Address for correspondence : Yong-Dae Kim, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Yeungnam University, 170 Hyeonchung-ro, Nam-gu, Daegu 705-703, Korea
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서론

점액(mucus)은 호흡기 상피 표면을 덮고 있는 물질로서 적절한 습도를 유지해주고 윤활역할을 하며, 흡기에 포함된 독성물질과 감염원에 대한 일차 방어선 역할을 한다.¹⁾ 그러나 만성 염증성 호흡기 질환에서는 점액의 분비가 과도하게 일어나거나 그 성상이 변화하여 병의 경과를 악화시킬 수 있어, 점액의 과다 분비를 조절하는 것이 매우 중요하다.²⁾ 점액의 성상을 결정하는 여러 성분 중에서 점소(mucin)는 당단백으로 점액 유전자에 의해 생성이 조절되고, 점액의 유동학적, 물리화학적 또는 생화학적 특성을 결정할 때 가장 큰 역할을 담당한다. 점액유전자는 현재까지 20여 개가 발견되었으며, 이 중에서 분비형 점소(secretory mucin)인 MUC5AC와 MUC5B의 유전자 발현에 대해 상기도 영역에서 활발히 연구가 이루어지고 있다.^1,3,4,5)
사람의 코 점막 상피세포에서 점액 유전자 발현과 점액의 분비를 증가시키는 여러 가지 물질이 존재한다. Interleukin-1β(IL-1β), lipopolysaccharide(LPS), phorbol myristate acetate(PMA)와 같은 cytokine이나 염증 유발 물질은 호흡기에서 점액의 분비를 증가시킨다.^6,7,8) 이 중 IL-1β는 대식세포와 내피세포에서 생산되는 monokine으로 T세포와 B세포, 섬유아세포의 증식과 프로스타글란딘 E2의 생산, 류마티스성 관절염과 같은 여러 가지 반응에 관계한다.⁴⁾ LPS는 그람 음성 세균의 외막 성분으로 인체 내에서 mitogen activated protein kinase 경로를 통해 대식세포를 자극시켜 cytokine을 유도하여 여러 염증 반응을 일으킨다.⁴⁾ PMA는 protein kinase C activator로 호흡상피에서 matrix metalloproteinase-9를 통하여 염증 반응을 일으킨다.^5,9)
Betulinic acid는 pentacyclic triterpenoid 구조를 가진 식물에서 생합성 되는 천연물의 일종으로 East Africa의 상록수(Ziziphus mauritriana)에서 최초로 분리되었고, 항염증작용을 포함한 다양한 생물학적 작용을 가지고 있다.^10,11) 그러나 염증반응에 의한 기도점액 과분비 과정에서 betulinic acid가 점액유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 아직까지 보고된 바가 없다.
따라서 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 betulinic acid가 MUC5AC 및 MUC5B 유전자의 발현과 점액 단백 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 이 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재료
Betulinic acid는 목향(Saussurea lappa)의 뿌리에서 추출하였고,⁹⁾ IL-1β와 LPS, PMA는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. RPMI 1640 medium은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA), fetal bovine serum(FBS)은 Hyclone Laboratories(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. MUC5AC(MS-145-P1) 일차항체는 Neomarker(Fermont, CA, USA)에서 구입하였으며, MUC5B(SC-23024) 일차항체와 anti-rabbit or anti-mouse horseradish peroxidase(HRP)-conjugated 이차항체, MUC5AC HRP-conjugated 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

세포 배양 및 처치
점액분비를 일으키는 사람 폐의 점액상피양 암 세포주(human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line)인 NCI-H292 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 접종한 후 2 mM L-glutamine과 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin과 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 이용하여 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 혼합된 배양기에서 37℃의 온도로 배양하였다. 수일 후 70~80% 정도의 융합기가 되면 세포를 0.5% fetal calf serum이 포함된 RPMI 1640 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양하고, 다시 FBS가 포함되지 않은 RPMI 1640 배지로 세척한 후 실험에 사용하였다.
Betulinic acid의 효과를 알아보기 위해서 NCI-H292 세포에 1 μg/mL와 5 μg/mL, 10 μg/mL 농도의 betulinic acid를 전처치한 후 1시간 뒤에 10 ng/mL 농도의 IL-1β와 100 ng/mL 농도의 LPS, 10 nM 농도의 PMA를 각각 투여하였다. 대조군은 동일한 시간 동안 배지에서 NCI-H292 세포를 단독으로 배양하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석
Gene Amp RNA PCR core kit와 PTC-200(MF Research Inc., Watertown, MA, USA) PCR 기계를 사용하여 제조사의 방법대로 시행하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primer는 밝혀진 염기서열에 의해 제작하였으며, 각 반응의 내부 양성 대조군(internal positive control)은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였다.
실험에 사용된 primer의 염기배열은 MUC5AC의 경우 sense는 5'-TCA ACG GAG ACT GCG AGT ACA C-3', antisense는 5'-CTT GAT GGC CTT GGA GCA-3'이고 MUC5B의 경우 sense는 5'-CAC ATC CAC CCT TCC AAC-3', antisense는 5'-GGC TCA TTG TCG TCT CTG-3'이며, GAPDH의 경우 sense는 5'-CCT CCA AGG AGT AAG ACC CC-3', antisense는 5'-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3'이었다. 실험에 사용되어 증폭된 mRNA 산물의 크기는 MUC5AC는 130 bp이고 MUC5B는 245 bp, GAPDH는 145 bp였다. RT-PCR 과정을 간략히 설명하면, NCI-H292 세포에 1 μg/mL와 5 μg/mL, 10 μg/mL 농도의 betulinic acid를 전처치 한 후 1시간 뒤에 10 ng/mL 농도의 IL-1β와 100 ng/mL 농도의 LPS, 10 nM 농도의 PMA를 각각 투여하여 배양하였고, 8시간 후에 배양된 세포를 2% bovine serum albumin을 함유한 phosphate buffered saline(PBS)으로 3회 세척한 후 Trizol^®(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)을 이용하여 총 mRNA를 추출하였다. MUC5AC mRNA에 대한 PCR은 95℃에서 60초간 변성과정과 60℃에서 60초간 결합반응, 72℃에서 60초간 연장반응을 33회 반복한 후 72℃에서 20분간 최종 연장반응을 시행하였고, MUC5B mRNA에 대한 PCR은 95℃에서 60초간 변성과정과 72℃에서 60초간 결합반응, 72℃에서 60초간 연장반응을 33회 반복한 후 72℃에서 20분간 최종 연장반응을 시행하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응의 산물은 SYBR green이 함유된 1% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하여 분리 관찰하였다. 확인된 띠(band)의 세기는 Scion Image software(Scion Corporation, Frederick, MD, USA)를 이용하여 반정량적으로 분석하였고, 대조군의 density를 100으로 하였을 때 실험군의 density 값을 비율로 나타내어 relative density로 나타내었다.

면역분석법(Immunoassay)
MUC5AC 및 MUC5B의 점액 단백의 함량을 측정하기 위해서 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법을 이용하였다. NCI-H292 세포에 1 μg/mL와 5 μg/mL, 10 μg/mL 농도의 betulinic acid를 전처치 한 후 1시간 뒤에 10 ng/mL 농도의 IL-1β와 100 ng/mL 농도의 LPS, 10 nM 농도의 PMA를 각각 투여하여 배양하였고, 24시간 후에 배양된 세포에서 lysis buffer[50 mM Tris·Cl(pH 7.5), 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride]로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well plate에 담고 40℃에서 건조될 때까지 방치한 후 plate를 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 2% bovine serum albumin으로 실온에서 1시간 동안 차단한 후 PBS로 3회 세척한 다음 0.05% Tween 20를 함유한 PBS에 1:200으로 희석된 MUC5AC와 MUC5B 일차항체로 반응시켰다. 다시 PBS로 3회 세척한 후 HRP-conjugated 이차항체를 0.05% Tween 20를 함유한 PBS에 1:5000으로 희석하여 각 well에 첨가하였고, 1시간 후에 각 well을 PBS로 3회 세척하였다. 3,3ʼ, 5,5ʼ-tetramethyl benzidine 용액으로 발색한 후, 2N-H₂SO₄를 이용하여 중단시켰다. ELISA reader(EL800^®, BIO-TEK Instruments, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준곡선을 이용하여 단백의 양을 정량하였다.

통계
통계 처리는 Windows용 SPSS version 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다. 모든 실험은 p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 정하여 Student's t-test를 이용하였다.

결과

NCI-H292 세포에서 betulinic acid가 IL-1β에 의한 MUC5AC와 MUC5B 발현에 미치는 영향
NCI-H292 세포에서 IL-1β로 유도된 MUC5AC의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 변화가 없었다(Fig. 1A and B).
NCI-H292 세포에서 IL-1β로 유도된 MUC5B의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 통계학적으로 의미 있게 감소하였다. Betulinic acid 투여 용량이 많을수록 mRNA의 발현이 감소하였으나, 점액 단백의 경우에는 고용량(10 μg/mL)을 투여한 군과 저용량(1 μg/mL와 5 μg/mL)을 투여한 군에서는 큰 차이가 없었다(Fig. 1C and D).

NCI-H292 세포에서 betulinic acid가 LPS에 의한 MUC5AC와 MUC5B 발현에 미치는 영향
NCI-H292 세포에서 LPS로 유도된 MUC5AC의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 변화가 없었다(Fig. 2A and B).
NCI-H292 세포에서 LPS로 유도된 MUC5B의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 통계학적으로 의미 있게 감소하였다. Betulinic acid 투여 용량이 많을수록 mRNA의 발현이 감소하였으나, 점액 단백의 경우에는 고용량(10 μg/mL)을 투여한 군과 저용량(1 μg/mL와 5 μg/mL)을 투여한 군에서는 큰 차이가 없었다(Fig. 2C and D).

NCI-H292 세포에서 betulinic acid가 PMA에 의한 MUC5AC와 MUC5B 발현에 미치는 영향
NCI-H292 세포에서 PMA로 유도된 MUC5AC의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 변화가 없었다(Fig. 3A and B).
NCI-H292 세포에서 PMA로 유도된 MUC5B의 mRNA 발현과 점액단백의 생성량은 betulinic acid를 투여한 군에서는 통계학적으로 의미 있게 감소하였다. Betulinic acid 투여 용량이 많을수록 mRNA의 발현이 감소하였으나, 점액 단백의 경우에는 고용량(10 μg/mL)을 투여한 군과 저용량(1 μg/mL와 5 μg/mL)을 투여한 군에서는 큰 차이가 없었다(Fig. 3C and D).

고찰

Betulinic acid의 분자식은 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oicacid이고, pentacyclic triterpenoid 구조를 가진 식물의 생합성 천연물이다.^12,13) 나무의 껍질에서 존재하며, 특히 흰 자작나무의 껍질에 풍부하여 약 22%의 betulinic acid가 이곳에서 추출된다.^10,11,12,13) Betulinic acid의 생물학적 기능은 항염증작용, 항바이러스작용, 항말라리아작용, 항인간면역결핍 바이러스작용과 항암작용 등 다양하게 보고되고 있으며, 이외에도 구충작용과 항진균작용에 대해서도 알려져 있다.^10,13,14) 현재까지는 항암작용과 항인간면역결핍 바이러스작용에 대해 많은 연구가 진행되어, betulinic acid가 세포사멸효과(apoptosis)를 통하여 melanoma나 neuroectoderm 기원의 암세포에 높은 선택적 성장 저해 인자(highly selective growth inhibitor)로 알려져 있고,^13,15) 이는 미토콘드리아의 기능저하와 활성산소 형성, caspase 활성화 등의 다양한 기전을 통하여 이루어진다고 보고되고 있다.^10,16,17) 또한 항인간면역결핍 바이러스작용은 betulinic acid가 인간면역결핍 바이러스의 성장과 복제를 억제하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾
Betulinic acid의 항염증작용에 대한 최근 연구에서는 염증 유발 cytokine인 tumor necrosis factor-alpha가 extracellular signal-regulated kinase 신호전달 체계를 통하여 chemokine인 monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)을 발현시켜 백혈구의 증원(recruitment)을 유도하여 염증을 일으키는데,¹⁰⁾ betulinic acid가 tumor necrosis factor-alpha에 의한 MCP-1 생성을 감소시켜 항염증작용을 보이는 것으로 보고하였다.¹⁰⁾ 또한 betulinic acid가 LPS로 유도된 쥐의 염증성 폐 조직에서 중성구의 증원과 염증 유발 물질 발현을 억제하여 호흡 기도에서 항염증작용이 보고되어 호흡기 염증성 질환의 조절제로서의 가능성도 알려지고 있다.¹⁸⁾ 하지만 betulinic acid가 호흡기 상피세포의 점액분비 및 성상변화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 아직까지 국내에 보고된 바가 없었다.
이 연구는 NCI-H292 세포에 betulinic acid를 전처치하고 IL-1β와 LPS, PMA를 각각 투여하여 8시간 배양한 후 MUC5AC와 MUC5B mRNA 발현을 RT-PCR로 관찰하였고, 점액유전자의 발현 후 점액단백이 생성되는 데 시간이 필요하므로 이 세포를 24시간 배양한 후 면역분석법으로 MUC5AC와 MUC5B 단백을 관찰한 결과, betulinic acid에 의해 IL-1β와 LPS, PMA로 유도된 MUC5B mRNA 발현과 단백 생성이 억제되었으나, MUC5AC mRNA 발현과 단백 생성은 유의한 억제효과를 보이지 않았다. Betulinic acid의 용량이 증가할수록 MUC5B mRNA발현 억제 정도도 증가하는 경향을 보였으나, 단백 생성에서는 betulinic acid의 용량과는 유의한 관련이 없었는데, 이는 MUC5B mRNA가 발현되어 MUC5B 단백의 생성까지 NCI-H292 세포에 알려지지 않은 다른 영향들을 받기 때문에 MUC5B 단백 생성은 전체적으로 감소된 양상만 보인 것으로 생각된다. 또한 betulinic acid가 IL-1β와 LPS, PMA로 유도된 MUC5AC 발현의 억제에는 효과가 없었는데, 이는 MUC5AC와 MUC5B 발현 기전의 차이와 NCI-H292 세포의 특성 때문일 것으로 추정된다.
이 연구의 결과로 betulinic acid는 IL-1β와 LPS, PMA에 의한 점액 유전자 발현과 점액 단백 생성 억제에 관여한다고 생각되며, 이는 MUC5B 발현에 주로 관여하는 것으로 알려진 extracellular signal-regulated kinase나 mitogen-activated protein kinase 신호전달 체계를 통하여 이루어질 것으로 추정할 수 있다.⁵⁾ 하지만 betulinic acid의 점액분비 억제 효과와 betulinic acid의 상용 복용에 의한 혈중농도로 점액분비 조절이 일어나는지를 확인하기 위해서 다른 종류의 세포나 동물을 이용한 다양한 연구가 시행되어야 할 것이다. 또 betulinic acid에 의한 MUC5AC와 MUC5B 발현뿐만 아니라 다른 여러 종류의 점액유전자 발현에 관한 효과와 신호전달체계에 대한 연구가 뒤따라야 할 것이다.
결론적으로 본 연구는 호흡기 상피세포에서 betulinic acid가 점액 과분비 조절에 관여할 것으로 생각되며, 이는 betulinic acid가 점액분비와 관련성이 있다는 기초자료로서의 의의를 가지면서 점액의 성상 변화 및 과분비를 억제할 수 있는 새로운 조절제의 개발에 도움이 될 것이다.

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