Address for correspondence : Seung Hwan Lee, MD, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Hanyang University, 17 Haengdang-dong, Seongdong-gu, Seoul 133-792, Korea
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서     론

   전압의존성 칼슘채널은 뇌, 근육, 내분비 및 감각기관 등에 존재하는 흥분성 세포에 분포하여 이들 세포로부터 신경전달물질이 분비되는데 중요한 역할을 한다.¹⁾ 감각세포의 하나인 내이 유모세포의 활성과정은 일차로 유모다발(hair bundle)이 기울어짐에 따라 mechanotransduction 채널이 개방되고 이를 통해 양이온들이 유모세포에 유입되면 세포의 탈 분극이 일어난다. 이어서 유모세포 내 전압이 올라감에 따라 전압의존성 칼슘채널이 활성화되어 세포 내 칼슘농도가 증가되고, 증가된 칼슘이온이 신경전달 물질의 분비를 유발하여 구심성 신경의 활성화가 일어나는 것으로 요약된다.^2,3,4,5) 유모세포는 일반 신경세포나 근육세포와 달리 자극이 없는 상태에서도 활성을 보이며(spontaneous activity) 실무율(all or none principle)을 따르지 않고 세포 내 전압의 변화(receptor potential)에 따라 세포의 활성도가 변하는 특징을 갖는데 이러한 특성이 세포 내 칼슘농도의 변화에 조절을 받는 것으로 알려져 있다.^6,7)
   그러므로 유모세포의 칼슘채널 활성도 및 칼슘 전류의 특성을 파악하는 것이 유모세포와 구심성 신경 사이의 신경전달 과정을 이해하는데 중요하다. 유모세포의 칼슘채널특성을 연구하기 위하여는 해당채널 이외의 전류를 차단시켜야 하며, 이제까지 칼슘전류를 측정하기 위하여 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다. 본 연구에서는 여러 K⁺ 차단제를 추가 사용하여, 포유류 내이의 유모세포와 생리적 특성이 거의 유사한 것으로 알려진 조류 와우와 전정 유모세포로부터 더욱 순도 높은 전압의존성 칼슘 전류를 분리할 수 있었으며, 이를 토대로 칼슘채널의 전압에 따른 활성특징과 전류의 크기 및 세포 내 완충액의 역할 등을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

   부화 후 7일 이내의 병아리(Gallus gallus)를 pentobarbital을 근육 주사하여 마취시킨 후 두부를 분리하였다. 수술현미경하에서 측두골을 박리하여 내이조직을 적출하였다. 내이는 청각기관에 해당하는 basilla papilla와 이와 인접해있는 ampulla로 각각 분리하였다. 적출된 basilla papilla를 단백분해효소에 약 3분간 처리 후 천개막(tectorial membrane)을 제거하였다. Papilla의 첨부에서 1.0~1.2 mm되는 부위로부터 포유류 와우의 내유모세포에 해당하는 장(長)유모세포(tall hair cell)를 흡인하여 분리한 후 recording dish에 다시 불어내어 바닥에 분산시켰다. 마찬가지 방법으로 crista로부터 전정유모세포를 분리하였다. 분리된 세포를 대상으로 whole-cell patch clamp recording을 시행하였다. Patch pipettes의 저항은 5~10 MΩ이었으며, 밀착저항(seal resistance)은 2~3 GΩ이었다. 막전압 고정과 전류의 측정은 Axopatch 200B patch clamp amplifier를 이용하여 Digidata 1,200B(Molecular divice, CA, USA) interface를 통하여 컴퓨터와 연결하였다. 막전압 조절과 실험결과 얻어진 칼륨 전류의 기록 및 자료 분석은 pClamp 7.0 software를 사용하였으며, oscilloscope를 사용하여 전류의 변화를 동시에 관찰하였다. 누출전류(leak current) 감산은 시행하지 않고 pClamp7.0 software를 이용하여 교정하였다. 전압의존성 칼슘채널을 활성화시키기 위해 -70 mV부터 +40mV까지 10 mV 간격으로 변화시키는 voltage step 전압 자극을 가한 후 발생하는 전류를 60 msec 동안 측정하였다.
   유모세포에서 predominant 한 K⁺ 전류에 비해 상대적으로 작아 가려진 칼슘전류를 분리해 내기 위해 내, 외부의 용액을 조제하였다. 내부(Pipette) 용액은(mM) 130 CsMeSO4, 10 HEPES, 3 Mg₂ATP, 5 phosphocreatine, 5.6 glucose를 포함하였고 pH 7.3, 삼투압은 290 mOsM로 조제하였다. 유모세포의 칼슘완충작용이 칼슘전류에 영향을 주는지 알아보기 위해 칼슘완충제인 ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA)와 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N, N',N'-tetraacetic acid(BAPTA)를 각각 0.1, 1.0, 10 mM 농도로 하여 측정하였다. 표준 외부용액은(mM) 90 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂, 10 HEPES, 30 TEACl, 5.6 glucose, 2 pyruvate, 3 4-AP, 0.005 apamin를 포함하고 pH는 7.3, 삼투압은 310 mOsM이었다. 모든 조작과 기록은 상온(20~22℃)에서 시행하였다.

결     과

유모세포의 전압변화에 따른 전류의 측정
   세포내액이나 외액에 아무런 이온채널 차단제를 포함하지 않은 조건에서 전압의 변화에 따른 전류의 변화를 측정하였을 때, 최대 약 2,000 pA의 크기를 보이는 외향성 전류가 측정되었다. 전압에 따른 전류의 특성을 볼 때 K⁺ 통로를 통한 K⁺ 이온의 이동에 의한 것으로 여겨지며 세포 내의 K⁺ 통로의 종류에 따라 시간에 따른 전류의 변화 차이를 관찰할 수 있었다(Fig. 1).

K⁺ 통로의 차단을 통한 칼슘전류의 분리측정
   유모세포의 K⁺ 전류를 차단하기 위하여 일차적으로 세포내액으로 치환될 pipette solution을 K⁺ 대신 Cs⁺으로 대치하였을 때 대부분의 외향성 K⁺전류가 차단되었으나 약 10% 정도의 외향성 전류가 지속적으로 측정되었다. 세포외액에 K⁺ 통로 차단제인 tetraethylammonium(TEA)과 4-aminopyridine(AP)를 추가하여 모든 외향성 전류가 억제된 순수한 내향성 전류를 얻을 수 있었다(Fig. 2). 측정된 내향성 전류가 유모세포에 존재하는 L-형 칼슘채널을 통한 전류임을 확인하기 위하여 L-형 칼슘채널의 자극제인 BayK 8644나 억제제인 nifedipine을 첨가하였을 때 뚜렷한 흥분 및 억제반응을 관찰하여, 측정된 내향성 전류가 칼슘전류임을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이 내향성 칼슘전류는 -40 mV 이상에서 관찰되기 시작하여 0~10 mV에서 가장 크게 측정되었으며 이후 다시 감소하는 전압-전류 특성을 보였다(Fig. 4).

칼슘전류의 크기
   칼슘전류의 크기는 전압전류곡선에서 가장 크게 기록된 전류의 크기를 측정하였다. 세포내액에 칼슘완충용액으로 첨가하는 EGTA나 BAPTA의 농도 변화에 따른 칼슘전류의 크기 변화를 관찰하였다. 내이 유포세포로부터 측정된 칼슘 전류의 크기는 10 mM EGTA에서 120.71±39.67 pA(n=7), 1 mM EGTA에서 105.08±31.81 pA(n=13), 0.1 EGTA에서 약 104.30±22.82 pA(n=10)로 10 mM EGTA를 완충제로 이용한 측정에서 유의하게 크게 나타났으며, BAPTA를 이용한 실험에서는 10, 1, 0.1 mM에서 각각 142.00±35.62(n=9), 109.25±29.81(n=4), 103.33±34.38 pA(n=6)으로 10 mM BAPTA에서 유의하게 크게 측정되었다(ANOVA, p<0.05). 와우 유포세포와 전정유모세포와의 비교에서는 두 세포군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 5).

고     찰

   조류의 청각기관 중 포유류 와우에 해당하는 기관은 basilla papilla이다. 와우와는 달리 나선형을 이루지 않고 모든 감각세포가 단일 평면에 배치되어 있다.⁸⁾ 청각유모세포는 신경분포의 양상과 와우 내 횡단면에 따른 위치에 따라 구분이 된다. 병아리에서 장유모세포(tall hair cell)는 포유류에서 내유모세포와 상동기관으로, 대부분 구심성 신경이 분포되어 있고 원심성 신경은 거의 가지고 있지 않다.⁹⁾ 반면, 단유모세포(short hair cell)는 구심성 신경보다 원심성 신경이 대부분 분포해 있다.¹⁰⁾ 이러한 시냅스의 차이와 더불어 전압의존성 칼슘전류도 장유모세포에서 단유모세포보다 항상 더 큰 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 본 연구에서는 유모세포의 위치에 따른 오차를 배제하기 위해 basilar papilla의 tonotopic axis에서 1 KHz에 해당하는 곳 즉, 첨부로부터 약 1 mm되는 부위에서¹²⁾ 분리한 장유모세포를 이용하였다.
   전압의존성 칼슘채널(voltage dependent calcium channel, VDCC)은 세포막에 분포하며 유모세포, 신경세포 등에서는 세포 내 전압의 변화에 의해 채널이 열려 칼슘이온이 세포 내로 유입되게 한다.^1,13) 전압의존성 칼슘채널은 약리학적, 전기생리학적 특성에 따라 L, N, P, Q, R 및 T형으로 나뉜다.¹⁴⁾ 유모세포가 가지고 있는 칼슘채널은 dihydropyridine에 민감도를 보이며, 칼슘보다 바륨에 대한 투과성이 더 좋고 상대적으로 큰 단 채널 전도력(single channel conductance)를 갖는 L-형이고, 이 유모세포의 L-형 칼슘채널은 α1D 혹은 CaV1.3 유전자에 의해 발현된다.^15,16,17)
   전기생리학적 연구의 하나인 patch clamp 기술은 이온채널를 통한 전류의 이동과 같은 매우 작은 전류를 측정할 수 있는데, 이 중 whole cell patch clamp를 이용하여 세포 전체의 이온채널을 통하는 net 전류를 측정할 수 있다. 특정 이온채널의 전기생리학적인 특성을 보기 위해서는 해당 채널 이외의 이온채널을 차단하여야 한다. 특히 칼슘전류는 크기가 작기 때문에 타 이온채널을 통한 전류(이온)의 이동을 철저히 막아야 내향성의 칼슘전류를 성공적으로 기록할 수 있다. 내이 유모세포에는 일반 신경세포에서 보이는 Na⁺ 채널이 세포활성에 거의 기여하지 않는 반면, K⁺ 채널을 통한 외향성 전류가 whole cell recording으로 기록되는 전류의 대부분을 차지하고, 자연 상태에서 전압의존성, 칼슘의존성의 K⁺ 전도성(conductance)은 칼슘의 전도성보다 매우 크기 때문에 이를 차단하는 것이 필수적이다.^10,18,19) 본 연구에서는 칼슘채널 이외의 다른 채널을 통한 전류의 이동에 의한 실험의 오류를 막기 위하여 각종 K⁺채널 차단제를 첨가함으로써 +40 mV까지 내향성 전류를 얻을 수 있었다. 일차적으로 기존의 연구와 유사하게 세포내액을 K⁺ 대신 Cs⁺로 치환하였으며 세포외액에 비특이적 K⁺ 채널차단제인 tetraethylammonium을 첨가하였을 때는 양전압이 증가함에 따라 외향성 전류가 나타나고, 음 전위에서의 완속성 tail current이 나타났다. 이는 일부 K⁺ 전류가 아직 남아있음을 의미하는 것으로 세포외액에 4-AP를 첨가하였을 때 순수한 내향전류를 얻을 수 있었다. 추가적으로 small conductance calcium dependent K channel(SK) 차단제인 apamin을 첨가하였을 때는 전체 전류에 특별한 차이를 보이지 않아 조류 basilla papilla의 장 유모세포에는 원심성 자극에 의한 과분극(hyperpolarization)과 관련된 SK 채널의 역할이 없거나 미미한 것으로 확인하였다. 기록된 내향 전류는 칼슘채널억제제인 nifedifine에 의해 완전히 차단되어 DHP sensitive L type calcium channel임을 확인하였다.
   측정된 전류의 크기는 같은 위치로부터 얻어진 세포를 이용하였기 때문에 거의 유사한 평균 및 표준편차를 보였으나 세포내액에 첨가한 완충제의 용액에 영향을 받았다. 완충제의 농도가 높을수록 칼슘전류의 크기가 큰 경향을 보였다. 이는 세포 내로 유입된 칼슘의 역되먹임에 의한 칼슘채널의 불활성화가 완충제에 의해 적게 일어나 상대적으로 칼슘전류의 크기가 큰 것으로 생각된다. 작용시간이 매우 빠른 BAPTA와 상대적으로 느린 EGTA 간의 비교에서는 고농도에서는 차이를 보였으나 생리학적 농도와 유사한 1 mM 농도에서는 BAPTA의 완충작용이 EGTA에 비해 효과적이지 않았다는 것을 의미하는 것인데, 이는 칼슘의존성의 반응이 개방된 채널의 아주 근접한 부위를 벗어난 곳에서 일어나거나, 세포 내의 칼슘작용의 조절과 관련된 calcium binding protein 등의 영향일 것으로 생각된다. 전정유모세포로부터 측정된 칼슘전류도 유사한 특징을 보여 내이 유모세포와 기본적인 신경전달과정이 일어나고 있음을 추정할 수 있다.

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