교신저자：김인상, 330-715 충남 천안시 안서동 산16번지  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   부비동염의 발병에는 부비동 점액 배출의 장애 및 분비물의 정체가 주요한 병태 생리로 작용한다고 알려져 있다.¹⁾ 섬모 운동 속도(CBF)는 점액섬모배출운동에 관여하는 인자 중 가장 핵심적인 요소로서 섬모 운동 속도가 빨라지면 점액 수송시간이 유의하게 감소한다고 알려져 있다.²⁾
   섬모 운동 속도는 크게 사이토카인, 기계적 자극, 온도, 및 해부학적 요인 등에 영향을 받지 않은 기저 상태의 섬모운동(basal CBF)과 특정한 자극에 반응하여 변화를 보이는 역동적 섬모 운동³⁾으로 나누어 볼 수 있다. 현재까지 부비동염의 기저 섬모 운동 속도에 대해서는 상반된 연구들이 보고되고 있다.^4,5,6,7,8,9) 그러나 만성 부비동염에서 각종 자극에 반응하는 역동적 섬모운동의 변화에 대한 보고는 매우 미미하다.
   가장 강력한 섬모기능의 활성제로 알려진 ATP의 자극에 정상 비점막은 짧은 자극에도 CBF가 20~30분간 증가된 상태로 지속되는 것으로 보고되고 있다. 또한 L-Arginine (L-Arg)을 기질로 하여 산화질소 합성 효소(NO synthase, NOS)에 의하여 형성되는 산화질소(nitric oxide, NO)도 점액섬모배출운동과 관련되었다고 알려져 왔으며 낮은 농도의 비내 산화질소는 상기도의 손상된 점액섬모배출운동과 관련 있으며 Kartagener 증후군이 있는 환자는 기도내 산화질소의 생성이 현저히 감소하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
따라서 본 연구에서는 부비동 점막에서 NO 자극에 반응하는 역동적 섬모운동의 변화를 관찰하고 정상군과 질환군에서의 차이를 알아 보고자 하였다. 또한 부비동염 점막에서 산화질소 합성 효소 발현의 변화를 알아보고 이러한 합성효소 발현의 변화와 섬모운동과의 관련성을 알아 보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2007년 6월부터 2008년 3월까지 대학교병원 이비인후과에서 부비동 내시경 수술을 받은 40명을 대상으로 하였다. OMU CT와 내시경 소견을 기준으로 하여 정상군 15명과 부비동염군 25명으로 나누었다. 정상 점막(N=15)의 채취를 위해 누낭 비강 문합술 및 안와외향골절 정복술을 받은 환자에서 사골동 점막을 채취하였으며, 비중격 및 비갑개 교정술, 외비 성형술을 받은 환자에서 하비갑개 점막을 채취하였다. 
   이 중 남자는 10명, 여자는 5명으로 연령 분포는 21세부터 58세, 평균 35세였다. 만성 부비동염군 25명은 모두 부비동내시경 수술을 받은 환자로 모두 전사골동 점막을 채취하였으며 남자는 17명, 여자는 8명으로 연령 분포는 18세부터 65세로 평균 34세였다.

비강 점막의 준비
   수술 중 비내시경을 통하여 점막을 채취한 후 F12-DME 1：1(HyClone, Utah 84321, with L-glutamine)이 담겨있는 Falcon tube에 담아 37℃, 5% CO₂ incubator에 1시간 동안 거치시켜 섬모운동을 안정화시켰다.

섬모운동속도(Ciliary beat frequency, CBF)의 측정
   점막을 측정용기로 옮겨 600배 시야의 침수현미경으로 관찰하였고, 현미경 시야를 초당 60프레임의 디지털 CCD (charged coupled device) camera(XCHR50, Sony, Japan)를 통해 컴퓨터로 전송하여 Fast-Fourier Transformation(FFT)에 기반을 둔 프로그램을 이용하여 분석하였다. 일정한 온도(37℃)가 유지되는 관류기내에 석사 격자(1.5 mm)로 점막을 고정한 후 섬모운동이 활발한 다섯 개 시야에서 CBF를 측정하였고 이 값의 평균을 해당점막의 기저 CBF값으로 정하였다. 이후 산화질소에 대한 점막의 반응을 보기 위하여 산화질소의 공여체인 L-Arg 10 mM을 첨가한 뒤 20분간 1분 간격으로 CBF 변화 양상을 관찰하였다.
   또한 산화질소 억제 반응을 유도하기 위해 산화질소 합성효소 억제제, NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) 100 mM을 기저상태 및 ATP(100 μM)로 활성화된 상태의 비점막에 첨가하였다.

면역조직화학염색
   정상 및 부비동염 비점막을 탈파라핀화 및 수화작용 시킨 뒤 5분간 흐르는 물에 세척하였다. 내재성 peroxidase 활성을 제거하기 위해 0.3% H₂O₂액에 30분간 반응시킨 다음 완충액에 5분간 세척하고 정상 염소혈청(goat serum)에 5분간 반응시켜 주변부의 비특이적 반응을 억제한 후 일차항체에 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 조직은 완충액으로 세척 후 Biotin화 이차 항체에 30분간 반응시키고 세척하였다. 다시 슬라이드를 VECTASTAIN^® ABC Reagent와 반응시킨 뒤 세척하였다. 마지막으로 peroxidase 용액에 원하는 강도의 염색이 나타날 때까지 반응시킨 뒤 광학 현미경으로 관찰하였다.

통계적 분석
   시료마다 기저 CBF값을 기준으로 하여 CBF 변화량(ΔCBF)을 비율로 표현하였다. 또한 최대 증가율은 기저 CBF에 대한 시약을 첨가한 뒤 안정화된 후 나타난 최대 증가 CBF에서 기저 CBF를 뺀 값의 백분율로, 최대 감소율은 기저 CBF에 대한 기저 CBF에서 시약을 첨가하여 안정화된 뒤 나타난 최소 CBF를 뺀 값의 백분율로 나타내었다. 통계분석을 위하여 t-test와 단순 선형 회기 분석을 시행하였고 p<0.05인 경우를 통계적으로 의미 있게 보았다. 결과의 값은 평균±표준편차의 형태로 제시하였다.

결     과

CBF에 대한 L-Arg의 효과
   NO에 반응하는 CBF의 변화와 정상군과 부비동염군에서의 차이를 알아보기 위하여 NO의 공여자로써 L-Arg 10 mM을 사용하였다.
   정상군(n=15)에서는 L-Arg 10 mM에 대한 CBF 최대 증가율이 21.31±2.20%(범위：13.37~27.72%)를 보였으며, 부비동염군(n=25)에서는 CBF 최대 증가율이 5.41±0.26%(범위：4.35~9%)로 나타났고 이는 통계적으로 유의하게 정상군보다 낮았다(p<0.05)(Fig. 1).

CBF에 대한 L-NAME의 효과
   기저 상태의 CBF가 NO를 억제시켰을 때 어떻게 반응하는지 알아보기 위하여 NO의 길항제로 알려진 L-NAME 100 mM을 투여하였다. L-NAME 투여시 정상군과 부비동염군 모두 기저 상태의 CBF가 감소되었으며, 이 때 정상군(n=15)은 20.26±1.30%(범위：14.8~31.6%)의 최대 감소율을 보였으나, 부비동염군(n=25)은 이보다 훨씬 적은 12.5±2.19%(범위：7.3~24.9%)의 최대 감소율을 보였으며, 이는 통계적으로 유의한 차이였다(p<0.05)(Fig. 2).

ATP에 의해 활성화된 CBF에 대한 L-NAME의 효과
   ATP에 의하여 활성화된 상태의 섬모에서 NO를 억제시킬 때 나타나는 반응을 알아보고자 산화질소의 길항제로 알려진 L-NAME 100 mM을 ATP 100 μM 첨가 직후 점막에 첨가하였다. 정상군 및 부비동염군 모두에서 최대 증가율(정상군 27.3±2.20%, 부비동염군 16.2±1.98%)과 기저 상태의 섬모 운동 속도보다 10% 이상 증가되어 유지된 시간(정상군 7.5분, 부비동염군 6.2분)이, ATP만 반응시켰을 때에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 3).

NOS에 대한 면역조직화학염색
   정상군과 부비동염군 비점막에서 NOS의 분포를 알아보기 위하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 정상군에서는 비점막의 상피세포의 세포막 상연에서 eNOS가 두드러지게 염색되었으나 iNOS의 발현은 뚜렷하지 않았다. 이와는 달리 부비동염군의 비점막 상피세포의 세포막 상연에서는 iNOS가 두드러지게 염색되었으며 반면 eNOS의 발현은 뚜렷하지 않았다(Fig. 4).

고     찰

   기저 상태의 섬모 운동은 정상군이나 부비동염군에서 큰 차이를 보이지 않는 것으로 보고되었다. 그러나 부비동염군에서 Lund-Mackay score와 기저 상태의 섬모 운동이 의미있는 음의 상관관계를 보여 심한 부비동염 상태에서는 섬모 운동이 감소하는 것으로 보고한 연구자들도 있다.⁹⁾ 이러한 결과는 부비동염의 초기 또는 경증의 부비동염에서는 증가된 분비물 등의 병적인 상태에 대한 생리적 보상작용으로 CBF가 증가되지만 중증도가 심할수록 만성의 중증 염증으로 인한 점막내 심한 구조적, 또는 기능적 손상이 나타나 섬모 운동이 감소하는 것으로 해석되었다.
   산화질소는 L-Arg을 기질로 하여 산화질소 합성 효소에 의하여 형성된다. 기도 점막 산화질소 합성 관련 효소는 크게 세포내 구성요소의 eNOS와 사이토카인이나 박테리아의 내독소에 의하여 발현되는 iNOS로 분류된다. 이러한 산화질소 합성 효소를 억제하였을 때 섬모운동이 떨어진다고 보고되고 있다.^{10,11,12,13,14)} 한편 Ramis 등은 비용종과 같은 염증성 부비동 점막에서는 iNOS가 정상 점막에 비하여 과발현되어 있다고 보고하였으나 Lundberg 등은 오히려 정상군에서 iNOS의 발현이 두드러진다고 보고하고 있어¹⁵⁾ 아직 정립되지 못한 실정이다.
   본 연구에서 산화질소 공여자, L-Arg에 대한 반응은 부비동염이 있는 비 점막에서 CBF의 최대 증가율(5.41%)이 정상점막 CBF의 최대 증가율(21.31%)에 비하여 낮게 나타났으나 산화질소의 길항제에 대한 최대 감소율은 정상점막에서 부비동염 점막보다 크게 나타났다.
   정상군의 비점막에서 산화질소의 공여자는 CBF를 증가시켰으나 ATP에 의해 활성화된 상태에서 산화질소 합성 효소의 길항제인 L-NAME를 첨가하였을 때는 CBF가 급속도로 감소하여 20분이 지났을 때는 기저 상태의 섬모 운동보다도 감소하였다.
   Korngreen과 Priel은 토끼 기관(trachea) 점막을 이용한 연구¹⁶⁾에서 ATP의 자극에 의하여 점막 상피세포 내 Ca²⁺농도가 빠르고 강력히 증가(4~5배) 되지만 Ca²⁺농도는 3~4분 정도면 정상화 되는 반면 CBF 증가는 ATP자극에 의하여 20~30분 정도 지속된다고 하였고, Uzlaner와 Priel은 이러한 현상에 대하여 토끼 기관을 이용한 연구에서 NO-cGMP 신호체계가 ATP에 의해 세포 내 증가된 Ca²⁺의 증가 및 유지에 관여하여 섬모 활동이 증가된다고 보고하였다.¹⁷⁾ 본 실험에서도 ATP에 의해서 기저상태에 비해 CBF가 활성화된 상태로 유지된 시간이 L-NAME 처치에 의해 두 군에서 모두 유의하게 감소되는 것으로 보아, ATP에 의한 활성화 상태를 지속시키기 위해서 NO 신호체계가 관련되어 있을 것으로 추정하였다.
   산화질소의 합성 효소의 분포를 확인하기 위한 면역조직화학염색에서 eNOS는 정상군에서 iNOS는 부비동염 점막에서 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다. 이는 Kim 등이 발표한 정상 비점막에 대한 면역조직화학염색에서 iNOS보다 eNOS에 대한 활성도가 높았다는 결과와도 일치하며 또한 부비동염 점막에 대한 NOS의 활성도의 차이를 알게된 것에 의의가 있겠다.¹⁸⁾ 그러나 병적 상태에서 NOS 분포의 변화로 인해 기저 CBF의 변화를 보이지 않으며, 오히려 임상적으로 중증도가 심한 부비동염 점막에서는 CBF가 감소하는 기존의 결과를 고려해 볼 때 이러한 iNOS 발현의 증가 및 이에 따른 NO 생성의 변화가 CBF의 증가로 이어지지는 않는 것으로 생각된다.
   이러한 결과는 염증 상태의 부비동염 점막에서 생리적 범위를 넘는 지나친 NO 생성의 증가로 인한 NO 자체의 독성 효과의 발현과 섬모 소실 등의 비 점막 상피세포의 구조적 손상 등이 원인으로 추정되지만 NO를 정량적으로 측정하지 못한 한계가 존재한다. 향후 비정상적인 점막 상태에서의 NO의 정량적 측정 및 CBF의 변화와의 관련성에 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   따라서 정상점막에서 eNOS가 활성화되어 나타난 것은 생리적인 농도 범위에서 CBF의 조절 및 항진 기능을 보이는 NO의 역할을 보여주는 것으로 생각되며, 반면 부비동염 점막에서 iNOS가 활성화되어 나타난 것은 병적 상태에서의 NO의 농도 변화와 살균 및 염증 작용을 나타내는 또 다른 NO의 역할을 보여주는 것으로 생각된다.

결     론

   정상 및 부비동염 비점막에서 산화질소의 항진제는 CBF를 증가시켰으며, 길항제는 CBF를 감소시켰다. 다만 부비동염 점막에서는 산화질소 항진제에 의한 섬모운동의 증가율 및 증가 유지 시간이 정상 점막에 비해 의미있게 낮게 나타나, 산화질소와 연관된 섬모운동 조절 기전의 변화를 시사하였다.
   면역조직화학염색상 정상점막에서는 eNOS의 발현이 상대적으로 뚜렷하게 나타났고, 반면 부비동염 점막에서는 iNOS의 발현이 상대적으로 증가되어 나타났으며, 이러한 산화질소 합성 효소의 발현 변화는 섬모운동 양상의 변화에 영향을 미칠 것으로 생각된다.

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