교신저자：남순열, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 3010-3710 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：synam@amc.seoul.kr

서     론

   편도 편평세포암종은 구인두에서 가장 흔한 악성 종양으로 근치적 치료방법에는 방사선 치료와 수술적 치료 방법이 있다. 초기 편도 편평세포암종에서는 치료 방법에 따른 예후의 차이가 크지 않기 때문에 치료 후 후유증이 큰 수술적 치료보다는 방사선 치료가 선호된다.¹⁾ 또한 진행된 병기에서도 생존율 향상을 위해 수술 후 방사선 치료가 선호된다.²⁾ 따라서 방사선 치료에 대한 반응의 정도는 모든 편도 편평세포암종 환자의 예후에 큰 영향을 미치게 된다. 최근까지 방사선 치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 확실한 임상적 지표는 없지만 방사선 민감도 및 종양의 악성도와 관련이 있는 여러 종류의 생물학적 표지자가 연구 되고 있다.
   그 중 Ku 단백질과 p53은 방사선 민감도와 관련이 있는 대표적인 생물학적 표지자로 알려져 있고 prostaglandin(PG)은 종양발생 및 종양침윤과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.^3,4) Ku 단백질(Ku70/80)은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 이중나선구조 손상을 복구하는 DNA protein kinase의 조절인자이고 p53 유전자는 인체의 종양에서 가장 흔하게 변성을 보이는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)로 세포자연사(apoptosis)를 결정짓는 데 중요한 역할을 한다.^5,6) PG 합성효소인 cyclooxygenase(COX)에는 COX-1과 COX-2 두 가지 isoform이 있다. COX-2는 1번 염색체에 위치하는 위기상황 대기 유전자(immediate-early gene)에 의해서 조절되는 유도가능효소(inducible enzyme)로서 주로 핵막에 존재한다. 위기상황 시에 COX-2는 성장인자, 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), cytokine, 종양촉진자 등에 의하여 유도되어 PG를 합성한다. PG는 세포자연사가 일어나지 않도록 억제하여 종양발생을 촉진하고, 세포외기질을 분해하는 효소를 활성화하여 종양침윤을 증가시킨다.⁷⁾
   방사선 민감도 및 악성도와 관련하여 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2 각각의 기능에 대해서 많은 것이 알려져 있음에도 불구하고 편도 편평세포암종에서 이들 표지자들의 발현 빈도나 예후와의 상관성에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 특히 편도 편평세포암종에서 이들 4가지 인자를 동시에 분석한 보고는 없다. 이에 저자들은 방사선 단독 치료나 수술 후 방사선 치료를 시행 받은 편도 편평세포암종 환자군에서 면역조직화학염색을 통해 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2의 발현 빈도를 확인하고 예후에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

환자군 및 치료
   1991년 10월부터 2006년 4월까지 조직검사상 편도 편평세포암종으로 진단된 환자를 대상으로 하였다. 조직검체는 수술 및 방사선 치료 전에 획득했으며 이전에 다른 암으로 진단 받은 병력이 있는 경우는 대상에서 제외하였다. 총 52예에 대한 면역조직화학염색을 시행하였으며 의무기록을 후향적으로 분석하였다. TNM 분류는 제5판 AJCC 병기분류법을 따랐다. 병기상 T1-2 환자가 35명, T3-4 환자가 17명이었다. 경과 관찰 기간은 평균 51개월(3~183개월)이었다. 환자의 평균 나이는 54세(29~71세)였으며 방사선 단독치료를 받은 환자가 14명, 수술 후 방사선 병합치료를 받은 환자가 38명이었다(Table 1). 모든 환자는 단독 혹은 술 후 병합치료로 방사선 치료를 시행 받았다. 방사선량의 중앙값은 6,480 Gy였다.

조직 microarray
   총 52예의 조직 paraffin-embedded block을 arrayer 장치(Beercher Instruments, Sun Prairie, WI, USA)를 이용하여 조직 microarray를 만들었다.

면역조직화학염색
   각 증례의 조직 microarray block을 취한 뒤 4 μm 두께의 연속절편을 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 고정하였다. 그 다음 10% xylene에서 탈파라핀하고 100%, 95%, 70% 알코올에서 차례대로 함수과정을 거친 후 흐르는 물에서 10분간 수세하였다. Ventana NX automated immunohistochemistry system(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)을 이용하여 Ku70/Ku80, COX-2, EGFR, p53에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 면역조직화학염색 시 Ku70/80은 생쥐 단클론항체(Ab4, Ab7, 1：50 희석；Neomarkers, Fremont CA, USA)를 이용하였다. 또한 p53 단백의 확인을 위해 생쥐 단클론성 항체(M7001, 1：3000 희석；Dako, Glostrup, Denmark)를, COX-2 항원에 대해서는 토끼 다클론항체(PGHS-2, 1： 50 희석；Oxford biomedical research, UK)를, 그리고 EGFR 항원에 대해서는 토끼 단클론항체(NOVO-L-EGFR, 1：50 희석；Novocastra, UK)를 각각 일차 항체로 사용하였다. 

염색결과의 판독
   Ku70/Ku80은 75% 이상이 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 75% 미만에서 염색되는 경우는 약양성으로, 염색이 전혀 되지 않는 경우는 음성으로 판정하였다.⁸⁾ p53은 10% 이상의 종양세포가 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 10% 미만의 종양세포가 염색된 경우를 음성으로 판정하였다. 이전 보고에 의하면 종양세포의 10%에서 p53 변이단백질이 발현되는 경우 p53 유전자변이가 있음을 시사하는 하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ COX-2는 이전의 다른 연구에서는 총 4단계로 염색의 강도를 분류하기도 하였으나 본 연구에서는 50% 이상이 염색된 경우 양성, 50% 미만에서 염색된 경우 음성으로 판정하였다. EGFR은 10% 이상의 종양세포가 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 10% 미만의 종양세포가 염색된 경우를 음성으로 판정하였다(Fig. 1).¹⁰⁾

통계 분석
   통계 분석은 SPSS, release 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였다. 생존율은 Kaplan-Meier 법을 이용하여 계산하였고 Log-rank test를 이용하여 각 예후인자의 영향을 분석하였다. 또한 다변량 분석을 위해 Cox 회기분석법을 이용하였다. 분석을 위하여 나이는 50세 미만 군과 50세 이상 군으로 분류하였고 T병기는 T1- 2군, T3-4군, N병기는 N0-1군, N2-3군으로 분류하였다. 통계 분석 시 각 인자별로 필요한 최소 데이터 수가 부족한 경우 분석에서 제외하였다. 모든 통계의 유의성은 p<0.05일 때로 간주하였다. 

결     과

Ku70/80, p53, EGFR, COX-2의 발현양상 
   Ku70은 모든 조직에서 양성 반응이 나타났고 3예에서 약양성반응을 보였으며 Ku80은 1예의 음성과, 3예의 약양성을 제외한 모든 조직에서 양성반응을 보였다. p53은 42예에서 음성, 10예에서 양성 반응을 보였고 COX-2는 26예에서 음성, 26예에서 양성 반응을 보였으며 EGFR은 1예에서만 양성 반응을 보였다(Fig. 2).

원발병소의 병기와 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2 발현율과의 관계
   각 원발병소의 병기는 T1 15예, T2 20예, T3 10예, T4 7예로 T2가 가장 많았다. Ku70의 강양성 발현율은 T1, T3, T4는 100%, T2는 85.0%였고 Ku80의 강양성 발현율은 T1, T3, T4는 100%, T2는 80.0%였다. p53의 발현율은 T1 26.6%, T2 15.0%, T3 20.0%, T4 14.2%였다. EGFR의 발현율은 T1, T2, T3는 0%, T4는 14.2%였고 COX-2의 발현율은 T1 46.6%, T2 55.0%, T3 40.0%, T4 57.1%였다. 원발병소의 병기와 표지자 발현율과의 관계에서 통계적 유의성은 없었다(p>0.05)(Table 2).

경부림프절 전이 병기와 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2 발현율과의 관계
   경부림프절 전이 병기는 N0 6예, N1 10예, N2 33예, N3 3예였다. Ku70의 강양성 발현율은 N0 100%, N1 90.0%, N2 96.9%, N3 33.3%였고 Ku80의 강양성 발현율은 N0 100%, N1 90.0%, N2 93.9%, N3 33.3%였다. p53의 발 현율은 N0 0%, N1 66.6%, N2 15.1%, N3 33.3%였다. EGFR의 발현율은 N0, N1, N3는 0%, N2는 3%였고 COX-2의 발현율은 N0 50%, N1 30.0%, N2 51.5%, N3 100.0%였다. 경부림프절 전이 병기와 표지자 발현율과의 관계에서 통계적 유의성은 없었다(p>0.05)(Table 3).

전체생존율과 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2, 나이, 병기, 치료방법과의 관계(단변량 분석)
   전체 환자의 5년 생존율은 77.5%였다. 나이(50세 미만과 50세 이상), 치료방법(방사선 치료단독과 수술 후 방사선 병합치료), T병기(T1-2과 T3-4), N병기(N0-1과 N2-3), Ku70/Ku80, p53, EGFR, COX-2의 발현에 대해서 Log-rank 분석을 이용하여 생존율을 비교하였다. 50세 미만 환자군에서는 사망한 예가 없었으며 50세 이상 환자군에서는 생존율이 65.3%이었다(p=0.012). 수술 후 방사선 병합치료군과 방사선 치료단독군의 생존율은 각각 86.8%, 51.9%였다(p=0.029). T1-2군과 T3-4군의 생존율은 각각 83.8%, 51.6%였다(p=0.052). N0-1군과 N2-3군의 생존율은 각각 82.1%, 74.8%였다(p=0.491). Ku70은 음성대조군이 없었으며 Ku70 약양성군과 양성군의 생존율은 각각 66.7%, 78.2%였다(p=0.317). Ku80의 경우 음성과 약양성이 각각 1예와 2예로 적었고 EGFR의 경우 양성군이 1예로 적어 통계 분석을 시행하지 않았다. COX-2 음성 환자군의 생존율은 74.8%, 양성 환자군은 81.6%였다(p=0.932). p53 음성 환자군의 생존율은 82.5%, 양성 환자군은 52.5%로 양성군에서 통계적으로 유의하게 생존율이 낮았다(p=0.049)(Table 4, Fig. 3).

전체 생존율과 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2, 임상 특성과의 관계(다변량 분석) 
   단변량 분석에서 p value가 0.25 이하인 나이, 치료 방법, T병기, p53에 대해서 다변량 분석(Cox 회귀분석)을 시행하였다. 이 중 나이가 통계적으로 유의하게 예후에 영향을 미쳤고(p=0.02) T병기는 통계적으로 경계 중요도(p=0.58)를 보였다. 하지만 나머지 인자에서는 다변량 분석상 통계적 유의성을 관찰할 수 없었다(Table 5).

무병생존율과 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2, 나이, 병기, 치료방법과의 관계(단변량 및 다변량 분석)
   전체 환자의 5년 무병 생존율은 77.8%였다. Log-rank 법을 이용한 단변량 분석에서 나이(p=0.014) 및 p53(p=0.017)은 통계적 유의성을 나타냈으며 치료방법(p=0.058) 은 통계적 경계 중요도를 나타냈다. Ku80과 EGFR은 전체생존율 분석 때와 같은 이유로 통계분석에서 제외되었다. 그 외 다른 요인들은 통계적 의미가 없었다(Table 6). 단변량 분석에서 p value가 0.25 이하인 이상의 세 가지 인자에 대해서 다변량 분석(Cox 회귀분석)을 시행하였다. 하지만 p53이 통계적으로 경계중요도(p=0.078)를 나타낸 것 이외에 통계적 유의성은 없었다.

고     찰

   같은 병기의 두경부암종이라 할지라도 종양의 성장조건이나 유전자의 발현조건이 다를 수 있고 이는 치료 결과의 차이로 나타난다. 최근에는 성장인자와 그 수용체, 변형된 암 유전자 그리고 암 유전자 단백산물을 종양세포에서 규명하여 종양의 악성도 및 예후 예측에 이용하려는 연구가 많이 진행되고 있다.³⁾ 본 연구에서는 편평세포암종의 성장, 복구, 침습, 신생혈관생성 등에 관여하는 생물학적 인자로 Ku70/80, p53, EGFR, COX-2의 발현을 분석하였다.
   COX-2는 대부분의 정상세포에서는 발현되지 않고 종양유전자, 성장 인자, 염증 반응 등에 의해 유도되며 신생혈관생성 작용 및 세포 자연사를 감소시켜 암세포의 생존을 연장시키고 EGFR은 COX-2의 생성 및 신생혈관생성에 관여하여 암종의 증식에 영향을 미친다.⁴⁾ EGFR의 과발현은 유방암, 방광암 그리고 여러 기타 암종에서 관찰되었다.^11,12) 또한 두경부암에서도 EGFR과 COX-2가 발현됨이 알려져 있고 이를 바탕으로 COX-2 길항제나 EGFR C225 항체가 임상실험 중이며 이러한 약제가 종양의 악성도 뿐만 아니라 방사선 민감성에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 이번 연구에서는 편도 편평세포암종을 대상으로 EGFR, COX-2의 발현과 병기 및 예후와의 관계를 비교하였다. 52예의 편도 편평세포암종 환자 중에서 EGFR 염색에 대한 양성 반응은 1예로 현저하게 적어 통계적 유의성을 분석할 수 없었다. 보통 두경부 편평세포암종에서 EGFR의 양성 비율은 16%에서 58%로 다양하게 보고되고 있는데 본 연구에서는 시약 및 염색 과정의 문제점를 발견할 수 없었음에도 불구하고 현저히 낮은 양성률을 보였다.^14,15) COX-2는 50%의 양성률을 보였으나 병기 및 예후와의 관계에서 통계적 유의성을 확인할 수 없었다. 이는 Atula 등이 구강 및 구인두 환자를 대상으로 COX-2의 발현과 예후의 상관관계를 분석한 결과와 일치하였다.¹⁶⁾
   방사선 민감도는 방사선에 의해 파괴된 DNA 이중나선구조의 복구 정도와 연관된다. 각 유전자의 기능을 단순화 하기는 어렵지만 본 연구에서는 DNA 복구와 관련된 표지자 중 Ku70/80, p53을 대상으로 분석하였다. Ku 유전자는 DNA dependent protein kinase(DNA-PK)의 조절 단백 합성에 관여하여 DNA 이중나선구조 손상의 회복에 필수적인 역할을 한다. 따라서 Ku 유전자 결핍으로 인하여 DNA 이중나선구조 손상의 복구에 차질이 생기면 방사선 치료에는 잘 반응하게 된다. 예를 들어 자궁경부암 및 구강암 환자에서 Ku 유전자의 발현 정도와 방사선 민감성 및 예후에 대한 연구에서는 Ku 유전자의 발현 빈도가 낮을수록 방사선 치료에 대한 민감도가 높고 예후가 좋은 것으로 보고하고 있다.^5,17) 두경부암종의 cell line을 대상으로 한 연구에서도 비슷한 결과가 보고된 바 있다.¹⁸⁾ 하지만 Friesland 등이 편도 편평세포암종에서 면역조직화학염색을 통해 시행한 연구에서는 DNA-PK 복합체의 발현 빈도가 높을수록 오히려 생존율이 좋았으며 DNA-PK의 발현 정도가 방사선 민감도에 미치는 영향이 제한적일 수 있음을 보고한 바 있다.⁸⁾ 본 연구에서는 Ku70/80이 거의 모든 예에서 양성이었고 따라서 Ku70/Ku80의 발현과 편도 편평세포암종의 예후 사이에는 상관 관계를 확인할 수 없었다.
   p53은 세포자멸사(apoptosis)에 관여하는 표지자로 정상 세포에서는 낮게 발현되나 p53 변형이 있는 세포에서는 높게 발현된다. 정상형의 p53단백질은 반감기가 10~20분 정도로 짧아 매우 낮은 농도로 유지되어 면역조직화학염색으로 검출되지 않으나, 변이형 p53 유전자에서 표현된 변이형 p53은 형상의 변화로 정상의 p53보다 안정하게 되어 세포 내에 축적됨으로써 면역조직화학염색법으로 검출될 수 있다.⁹⁾
   Friesland 등은 편도 편평세포암종에서 p53의 발현이 생존율의 감소와 연관이 있는 것으로 보고하였으나⁸⁾ Calzolari 등은 구강 및 구인두암에서 p53의 발현과 예후 사이에 상관관계가 없는 것으로 보고하였다.¹⁹⁾ 국내 연구를 보면 Baek 등은 48예의 두경부 편평세포암에서 38%가 양성반응을 보였고 p53의 양성률과 임상병리학적 소견과는 무관하다고 주장하였다.²⁰⁾ 하지만 Choi 등은 설암과 편도암 29예에서 13.8%의 낮은 양성률을 보고하였고 종양의 크기와 양성률 사이의 연관성을 보고하였다.²¹⁾ 본 연구에서는 편도 편평세포암종 52예 중 10예에서 p53이 발현되어 19.2%의 양성율을 보였고 비록 다변량 분석에서는 통계적 의미가 없었지만 단변량 분석에서는 p53 발현 환자군에서 전체생존율과 무병생존율이 통계적으로 유의하게 낮게 나타났다.
   연구 결과를 종합하여 보면 Ku70/80, p53, EGFR 그리고 COX-2의 과발현이 각각 단독적으로 편도 편평세포암종의 악성도 및 치료 예후를 반영한다고 단정짓기는 어렵다. 하지만 p53의 발현은 단변량 분석상에서 통계적으로 유의하게 전체생존율과 무병생존율을 악화시키는 것으로 확인되었다. 따라서 p53의 발현 여부는 예후 추정에 보조적인 방법으로 사용이 가능할 것으로 여겨진다. 그러나 다변량 통계분석에서 수술 여부가 예후에 영향을 미치지 않았음이 확인되긴 했지만 본 연구는 이전의 연구들과는 달리 수술 후 방사선 치료군과 방사선 치료 단독군이 혼재해 있다는 점에서 이전 연구와의 직접적인 비교해석에는 주의를 요한다. 

결     론

   수술 후 방사선 치료 및 방사선 단독 치료를 받은 편도 편평세포암종 환자에서 p53 발현 환자군은 전체생존율 및 무병생존율이 낮은 경향을 보였고 Ku70/Ku80, COX-2, EGFR의 발현 정도와 병기 및 생존율 사이에는 상관관계가 없었다. 

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