교신저자：박용진, 442-723 경기도 수원시 팔달구 지동 93-6  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   유전성 질환이나 암, 만성 염증성 질환의 치료 목적으로 1980년대 후반부터 유전자 요법에 대한 많은 연구가 이루어져 왔다. 이러한 유전자 요법들 중 아데노바이러스 벡터를 이용한 방법은 널리 사용되고 있는 간접이입 방법들 중 하나이다. 아데노바이러스는 세포주기에 들어가지 않은 세포에도 이입되어 단백질을 합성할 수 있으며 일반적인 포유동물의 세포에 잘 침투하는 장점이 있다. 또한 세포 이입시에 세포 표면에 발현되는 인테그린과 같은 일부 세포 표면 수용체와 친화성을 가지고 있어 장기에 따라 이입률에 차이가 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 많은 연구가 보고된 바 있다.^1,2) 
   아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 요법은 이비인후과 영역에서도 여러 질환에서 적용이 가능하겠지만 아직 일부 두경부 질환에서의 연구가 보고되었을 뿐 비과 영역에서의 연구는 거의 없다.³⁾ 알레르기 비염이나 부비동염은 비과 영역의 대표적인 질환으로 이러한 질환의 원인, 발병기전과 치료에 많은 연구가 진행되고 있으나, 아직 치료에 있어 만족할 만한 성과를 얻지 못하고 있다. 현재까지 비과질환에서 밝혀진 유전자 장애로 환자의 5~90%에서 비용이 관찰되는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)은 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR) 유전자의 이상이 원인인 것으로 알려져 있고 이에 대해 많은 연구가 이루어졌다.⁴⁾ 아토피와 알레르기 비염에 대한 유전자 연구들의 진행과정에서는 MHC class II, high affinity IgE 수용체, IL-4와 IL-4 수용체 유전자 등이 대상이 되고 있으며, 집먼지 진드기 항원(Dermatopha-goides pteronyssinus I, II)은 HLA-DRB1, DRB3, DRB5 분자와 관련이 있고, 특히 HLA-DRB1*7는 specific IgE와 양성 관련이 있는 것으로 보고되었다.⁵⁾ 낭포성 섬유증, 여러 종양성 질환 등 비강과 부비동에 발생하는 질환들이 유전자 요법의 대상이 될 수 있을 것으로 생각되며, 이러한 질환들의 유전자 치료를 위해서는 비강과 부비동으로의 유전자 전달에 관한 연구가 선행되어야 할 것이다.
   이에 본 연구자는 녹색 형광단백(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 표식자로 비갑개, 비중격과 부비동 점막에서의 발현 양상을 형광현미경과 면역조직화학염색을 통하여 확인함으로써 비·부비동 질환에 대한 유전자 치료의 적용 가능성을 제시하기 위하여 이 연구를 계획하였다.⁶⁾ 

재료 및 방법

실험동물
   10주 이상 동일한 조건에서 사육된 체중 300 g 내외의 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐 10마리를 사용하였다. 

녹색 형광 단백질을 발현하는 아데노바이러스(AdCMV.GFP)의 증식 및 분리 
   AdCMV.GFP(Quantum biotechnologies, Montreal, Canada)는 pShuttle-CMV(AES1021)에 녹색 형광 단백질 유전자를 삽입한 제품으로 이 바이러스 벡터는 CMV promoter를 가지는 제5형 아데노바이러스로(Type 5 adenovirus) E1과 E3 부분에 결손을 일으킨(Ad5 ΔE1/ΔE3) 것이다. 
   AdCMV.GFP의 증식과 분리는 Eliot 등의 방법에 따라 실시하였다.⁷⁾ 약술하면 제5형 아데노바이러스에 의하여 변형된 태아신장세포주인 293세포(ATCC CRL1573)를 중간 정도 혼탁하도록 배양한 후에 바이러스를 투여하여(MOI 5) 1주간 배양하였다. 배양한 세포와 배양액을 냉동과 해동을 수회 반복하여 세포를 파괴한 후 바이러스를 CsCl 완충액상에서 원심 분리하여 회수하였다. 회수한 아데노바이러스는 10% glycerol이 들어있는 0.01 M phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에 보관하여 실험에 사용하였다. 바이러스의 수는 293세포를 이용한 집락 형성 단위(plaque-forming unit, pfu)로 측정하였다.

검체의 제작과 관찰 
   마리당 각각 0.3 ml씩 2×10⁸개의 바이러스를 꼬리 정맥을 통하여 주입한 후 14일에 경추를 탈골시켜 도살하고, 즉시 비강과 부비동을 포함한 두개골을 적출하였다. 

형광 현미경 관찰
   이 중 5마리는 냉동매체(cryomedia, O.C.T. compound 4583, Sakura fine technical, Tokyo, Japan)에 넣어 -70℃ 냉동고에 보관하였다가 Shandon(Shandon southern products, UK) 냉동 절편 제작기를 사용하여 무형광 슬라이드(Matsunami microslide glass, Japan) 위에 4 μm 두께의 표본으로 제작한 후 455 nm 필터를 사용하여 형광 현미경(B×50, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또한 대조군으로 아데노바이러스를 주입하지 않은 동일 조건의 흰쥐를 사용하였다.

면역조직화학염색
   나머지 5마리의 10% formaldehyde에 고정시킨 비강, 부비동 조직은 0.1 M citric acid로 탈석회화 과정을 거친 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 제작된 검체에서 4 μm 두께의 관상 절편을 얻은 후, xylene과 alcohol을 이용하여 파라핀 제거와 수화 과정을 거쳤다. 조직 내 peroxidase의 활성을 막기 위하여 3% hydrogen oxide에 15분간 반응 시킨 후, 증류수로 세척하고 PBS에 5분간 담근 후, 1：100으로 희석시킨 anti-GFP antibody(anti-GFP, A6455, Eugene, Oregon, USA)를 실온에서 2시간 반응시켰다. DAKO사의 LSAB kit를 이용하여 결합 항체와 20분간 반응시킨 후 streptovidine과 20분간 반응시키고 diaminobenzidine(DAB)을 이용하여 발색하였다. Hematoxyline으로 대조 염색하였다. 

결     과

Hematoxylin-Eosin 염색 조직 소견
   비갑개, 비중격과 부비동 점막은 아데노바이러스 벡터의 투여에 의한 것으로 생각되는 특별한 병리학적 소견은 발견되지 않았다(Fig. 1).

형광 현미경하 관찰 소견
   아데노바이러스 벡터를 투여하지 않은 정상 비갑개와 부비동 점막에서는 뚜렷하지 않은 자가형광발현을 보였으며(Figs. 2A and 3A), 실험군인 아데노바이러스 벡터를 주입한 백서의 비갑개에서는 녹색 형광단백이 상피와 점막하고유층에 모두 고르고 강하게 발현되는 양상을 보였으며(Fig. 2B), 부비동 점막에서는 발현을 관찰할 수 없었다(Fig. 3B). 

면역조직화학염색 소견 
   비갑개에서는 점막 상피세포인 위중층원주상피세포에서 뚜렷하게 붉은색의 염색의 발현이 관찰되었으며, 점막하 고유층에서도 일부 염색이 관찰되었고, 점막하선(submucosal gland) 내에 강한 염색이 관찰되었다(Fig. 4A). 또한 비중격 점막에서는 점막 상피세포에만 국한되는 염색의 발현 양상을 보였고(Fig. 4B), 부비동 점막에서는 점막 상피와 점막하 고유층에서 모두 발현이 관찰되지 않았다(Fig. 4C).

고     찰

   유전자 치료는 지금까지 많은 질환의 치료에 대하여 연구되어 왔다. 첫 치료적 유전자 치료의 임상적 적용은 1990년대 초반 adenosine deaminase 결핍의 치료에서 시작되었고,⁸⁾ 현재까지 다양한 질환을 대상으로 유전자 치료에 대한 연구가 보고되어 있는 상태이다. 유전자 치료는 기본적으로 특별한 질환에 없는 유전자를 공급하는 것만을 포함하였으나, 이러한 개념은 점점 확대되어 반드시 유전자 결손에 의한 것이 아닌 병리적 상태의 증진에 대한 유전자의 유도까지 포함하게 되었다. 
   유전자 치료의 관점에서 볼 때, 비강은 쉬운 접근과 다양한 종류의 세포와 호흡상피, 후각상피, 선, 면역세포, 풍부한 혈관과 신경조직 등으로 구성되어 있어 특히 매력적인 기관으로 생각되어 질 수 있다. 그러나 비강과 부비동 질환의 유전자 치료를 목적으로 하는 비과 영역에서 유전자 치료의 현 상황은 알레르기 비염에서 TNF-alpha 수용체를 함유한 유전자를 이용한 치료와 Epstein-Barr virus/lipoplex를 이용한 치료 등의 연구가 진행되고 있는 정도이며, 비점막으로의 유전자 전이에 대한 연구는 아직 많이 보고되고 있지 않은 상태이다.⁹⁾ 이 연구에서는 아데노바이러스를 이용하여 외부 단백질이 비강과 부비동에서 효과적으로 발현되는지, 일정한 발현 양상을 보이는지 알아보고, 또한 발현 시 주위 조직에 병적 변화를 일으키지 않는지에 대하여 알아보고자 하였다. 
   이 연구에 사용된 녹색 형광 단백은 Aquorea victoria라는 북서 태평양 지역에 서식하는 해파리에서 분리한 238개의 아미노산으로 구성된 단백으로,¹⁰⁾ 이 녹색 형광 단백질은 스스로 형광을 일으키는 성질이 있어서 자외선을 조사하면 다른 보조효소나 염색과정 없이 그 자체가 녹색(λmax=510 nm) 혹은 푸른색(λmax=395 nm)의 형광을 발생한다. 따라서 녹색 형광 단백질 유전자가 포함된 유전자를 이입하면 이로부터 생성된 녹색 형광 단백은 다른 유전자 산물이나 기질 혹은 다른 인자의 투여 등의 이차 조작 없이 형광을 발생함으로써 유전자 조작 후 세포 혹은 세포 내 기관에 이입된 유전자의 발현을 확인할 수 있는 좋은 표식자가 될 수 있으므로 유전성 대사 질환을 비롯한 여러 질환의 치료, AIDS 등의 감염성 질환의 치료, 자가 면역 질환의 치료, 항암 요법, 면역 백신, 약제의 개발 등을 목적으로 유전자 요법에 연구 및 적용되고 있다.¹¹⁾
   유전자 치료의 핵심은 원하는 유전자를 목표하는 세포에 효율적이고 안전하게 전달할 수 있는 벡터 체계라고 할 수 있다. 지금까지 알려진 방법은 DNA 단백질 결합체(protein/DNA complex), 기계적 주입(mechanical administration), 리포솜(liposome)과 바이러스 벡터 등을 이용한 요법이 있다. 바이러스 벡터로는 herpes simplex virus-1, 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 렌티바이러스 등이 연구되고 있다.¹²⁾ 본 연구에서 사용된 아데노바이러스는 parvo 바이러스의 일종이며, 벡터로 재조합 아데노바이러스의 이용은 유전자 치료에 고역가의 바이러스가 생산될 수 있고, 벡터가 천천히 분화하는 또는 분화하지 않는 세포 모두에 감염시킬 능력을 가지고 있고, 아데노바이러스 DNA는 숙주 게놈으로 통합되지 않으며 유도된 유전자의 발현이 일시적이라는 장점이 있다. 이러한 이유들로 섬유성 낭포증에 대한 연구에서 인간과 쥐과의 비점막에 대해 재조합 아데노바이러스를 이용하여 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 유전자 전이에 대한 연구가 이루어졌다.¹³⁾ 
   일반적으로 바이러스는 세포로의 이전에 attachment와 internalization의 두 가지 단계를 겪는데 이 두 단계가 바이러스의 진입에 중요하다. 아데노바이러스는 attachment와 internalization을 유용하게 하는 분명한 세포 수용체와 연관성이 있다고 생각된다. 먼저 아데노바이러스 fiber capsid 단백질은 고안된 수용체 CAR(coxsackie-adenovirus receptor)의 상호작용을 통하여 세포로의 attachment를 매개하고, 다음 단계로 세포 표면에 alpha V beta 3 또는 alpha V beta 5 인테그린을 가지고 있는 아데노바이러스 penton base 단백질과의 관계가 바이러스 internalization을 촉진한다.¹⁴⁾ 세포 표면에서 이러한 수용체의 분포가 조직마다 다르므로 아데노바이러스에 의한 유전자 이전의 효율성은 다르고 많은 부분이 이 수용체의 분포에 의한다.¹⁵⁾ 이처럼 바이러스 벡터는 일부 세포 표면 수용체와 친화성을 가지므로 각 장기와 이를 구성하는 세포의 특성에 따라 아데노바이러스 벡터의 이입율에 차이가 있을 것이다.
   비강과 부비동에서 호흡기도 점막의 기본적인 기능은 미생물, 산화물, 먼지, 항원 등의 유해물질로부터 점막 표면을 보호하는 것이다.¹⁶⁾ 그러한 방어작용은 점액의 분비, 점액섬모수송을 통한 방어작용, 상피세포층이나 점막하 고유층의 작용으로 구성되며, 비·부비동의 점막은 상피세포층과 기저막, 점막하 고유층으로 구성된다. 비·부비동의 생리에 가장 중요한 역할을 하는 위중층원주섬모상피 세포층은 섬모세포, 배세포, 기저세포로 구성되는데, 그 중 본 연구에서 아데노바이러스 벡터의 발현부위인 섬모원주세포는 상피층의 선단면을 형성하는 세포로 비점막을 덮고 있는 점액의 흐름을 유지하는 데 중요한 역할을 담당하고, 비점막의 건조를 막고 세포와 점액 간의 수분과 전해질 수송에 기여하는 가장 중요한 부분이라 할 수 있겠다. 
   아데노바이러스를 이용한 한 연구에서 마우스의 꼬리정맥으로 녹색 형광 단백을 발현하는 아데노바이러스의 주입후 발현을 형광 현미경으로 관찰한 결과 폐, 심장, 신장, 간, 소장, 비장, 골수에서 모두 14일째 최고의 발현율을 보였다.¹⁷⁾ 이 연구 결과를 참고로 하여 본 연구에서는 아데노바이러스를 정맥 내 투여 후 14일째 비갑개, 비중격과 부비동 점막에서의 발현 양상을 관찰하였다. 형광 현미경상에서 관찰 결과 비갑개와 비중격 상피세포인 위중층원주섬모상피세포와 점액선, 장액선과 세정맥 등을 포함하는 점막하 고유층 모두에 고르고 강하게 발현되는 양상을 보였다. 그러나 발현 정도에서는 비갑개에서 더욱 뚜렷하게 관찰되었으며, 부비동 점막에서는 발현을 볼 수 없었다. 면역조직화학염색에서도 비갑개에서는 점막 상피와 점막하 고유층에서 양성반응을 보였고, 특히 점막하선에 강한 양성반응을 보였다. 또한 비중격에서는 점막 상피에만 약하게 양성 반응이 관찰되었고, 비갑개 발현부위의 관찰에서 전반부와 후반부에 상관없이 고르게 발현됨을 알 수 있었다. 
   본 실험에서 아데노바이러스를 정맥 내 주입 후 비갑개가 가장 잘 발현하는 부위였음을 알 수 있었고, 이러한 유입에 차이가 일어나는 것은 혈관 분포와 인테그린과 같은 세포간 부착물질의 분포 차이에 의한 것으로 생각되어 이에 대한 연구가 계속되어야 할 것으로 생각된다. 
   아데노바이러스는 일상 환경에서 생체가 흔히 노출되므로 이미 이에 대한 항체를 형성하고 있으므로, 정맥 내 투여에 영향을 받을 것으로 생각되며 또한 면역반응 체계에 영향을 주어서 전신적인 부작용을 일으킬 가능성도 배제할 수 없다. 그러나 본 연구에서 광학현미경적 검사로는 특이한 병소를 발견할 수 없었다. 
   비점막에서의 아데노바이러스 발현이 일시적이며, 투여로 인해 비점막에서 분명한 염증이나 조직학적 변화를 일으키지 않는 것으로 보이며, 실제 유전자 치료의 적용에서 숙주에 대한 병적 발현을 하지 않을 것이라고 기대할 수 있을 것이다. 그러나 일부 연구에서는 호중구 같은 염증세포의 침윤이 관찰되었는데, 이는 아데노바이러스 자체에 대한 면역 반응에 의해 생기며, 용량에 의존한다고 보고되었다. 그리고 반복적인 투여보다는 고용량에 의해서 면역 반응이 일어난다고 보고하고 있다.^18,19,20) 
   비갑개의 점막은 우리가 흔히 대하는 알레르기 비염이나 혈관성 비염, 만성비후성 비염, 비강 내 종양 외에도 많은 비강내 질환에 중요한 역할을 차지하는 부분으로 향후 유전자 치료에서 관심을 가져야 할 부분이며, 본 연구에서 비점막에서의 유전자 이전에 대한 고찰이 앞으로의 유전자 치료에 있어 방향의 제시에 도움이 되리라 생각된다. 

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