교신저자：이흥엽, 420-717 경기도 부천시 원미구 소사동 2번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   알레르기 기전과 치료방법을 연구하는데 있어 알레르기 비염 동물모델을 만드는 것은 매우 중요하다. 여러 항원이 동물모델을 만드는데 사용되며, 이 중 난알부민(ovalbumin)을 가장 흔히 사용하지만 임상적으로 실제 환자에게서는 볼 수 없는 항원이라는 단점이 있다. Aspergillus fumigatus(Af)는 실제 환자에게서 알레르기를 일으키는 원인항원이고 항원보강제(adjuvant)를 사용한 전신감작 없이 비내 국소감작만으로도 천식¹⁾ 및 알레르기 비염 모델을²⁾ 만들 수 있는 장점이 있다.
   알레르기 비염의 조기반응(early phase reaction)에 비만세포가 중요한 역할을 하는데 항원에 감작되어 형성된 특이 Immunoglobulin E(IgE) 항체는 비만세포의 고친화성 IgE 수용체(FcεRI)에 결합하고, 다시 항원에 노출되었을 때 항원과 IgE가 결합함으로써 비만세포가 활성화되고 탈과립(degranulation)이 일어나게 된다. 이러한 비만세포의 활성화로 히스타민, protease, proteoglycans, leukotrienes, prostaglandins, 사이토카인 등의 염증매개체들이 세포 밖으로 나오게 되며, 이러한 염증매개체들은 조기 알레르기 반응을 일으키고 호산구를 비롯한 염증세포들의 조직내 침윤을 유도한다.³⁾
   난알부민을 사용한 기관지 천식 모델을 이용해 후기 알레르기 반응의 특징인 조직내 호산구 침윤 및 과반응성에 대한 비만세포,⁴⁾ T 세포,⁵⁾ interleukin(IL)-5의⁶⁾ 역할에 대해서는 많은 연구가 이루어졌지만, 알레르기 비염 동물모델에서의 비만세포 역할에 대한 연구는 많이 부족한 실정이다. 상기도와 하기도의 알레르기 염증반응은 많은 유사점을 갖고 있지만 침윤되는 세포 및 조직학적 구조변화 등에 있어 차이점도 있는 것으로 알려져 있다.^2,7)
   본 연구에서는 Af 항원을 이용한 진균성 알레르기 비염 마우스 모델에서 비만세포 결핍마우스를 이용해 후기 알레르기 반응 및 항원 특이 항체에 대한 비만세포의 역할을 알아보고자 하였고, 또한 급성군과 만성군으로 나누어 항원 투여시기에 따른 비만세포의 역할을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물과 항원
   생후 6~8주령의 수컷 마우스를 사용하였으며, 비만세포 결핍마우스인 double heterozygotes WBB6F1/J-Kit^w/Kit^w-v(W/W^v)와 정상 유사유전자형 마우스인 WBB6F1-+/+(W/W⁺)을 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 구하여 무균환경에서 사육하였고 실험동물실 이용규정을 준수하였다. Aspergillus fumigatus(Af)의 배양 여과액과 균사 추출물의 혼합물(Bayer Pharmaceuticals, Spokane, WA)을 생리식염수로 2 mg/ml가 되도록 희석하였다.

알레르기 비염 모델의 제작
   마우스를 Metofane(methoxyfluorane；Pittman-Moore, Mundelein, IL)으로 가볍게 흡입마취한 후 앙와위에서 실험군은 Af 항원 100 μg(50 μl)를 micropipette를 이용하여 좌측 비강에, 대조군은 생리식염수 50 μl를 점적하였다. 감작은 일주일에 세 번을 3주 동안 시행하였고 마지막 감작투여 후 3주 동안은 항원투여를 하지 않았다. 정상 마우스군과 비만세포 결핍마우스군은 각각 실험군과 대조군으로 나누고 각군은 다시 급성군과 만성군으로 나누었으며 총 8군으로 각군 6마리씩 총 48마리로 실험하였다. 급성군에게는 마지막 감작투여 3주 후에 비강을 통해 한번 항원투여를 하였고, 만성군에게는 마지막 감작투여 3주 후에 하루에 한번씩 5일 동안 연속적으로 항원투여를 하였다.

비강세척액내 IL-5 및 세포 분석
   마지막 비강내 점적 24시간 후에 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(2 mg/kg)의 혼합액을 복강내 주사하여 마취시킨 후 아래턱을 분리하였다. Syringe가 달린 plastic tube를 후비공에 넣은 후 손으로 눌러 후비공을 막고 양쪽 비강을 phosphate-buffered saline(PBS) 1 ml로 세척하였다. 수집된 비강세척액을 원심분리(1500 rpm, 10분)한 후 상청액 0.5 ml를 IL-5 정량분석에 사용하였으며 -80℃에 보관하였다. IL-5 정량분석은 마우스 IL-5 ELISA Set(Pharmingen, San Diego, CA)을 이용하여 측정하였다. 수집된 세척액의 세포 침전물을 PBS 1 ml로 재부유시킨 후 hemocytometer를 이용하여 총 백혈구수를 측정하였다. 이후 cytospin(Shandon Scientific Ltd., Cheshire, UK)을 이용하여 슬라이드에 1.5×10⁵ cells/ml이 되도록 한 후 Diff-Quick 염색(Dade Behring, Newark, DE)을 시행하였다. 상피세포를 제외한 200개의 세포를 세어 호산구, 단핵세포, 호중구의 백분율을 계산하였고 각세포의 총 세포수는 각세포분획에 백혈구수를 곱하여 계산하였다.

Af 특이 IgE, IgG1의 측정
   비강세척을 한 후 흉곽을 절개하고 좌심실을 천자하여 혈액 1~2 ml를 채취하고 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. T helper cell type 2(Th₂) 면역반응과 관계된 Af 특이 IgE, IgG1 항체를 ELISA 방법을 사용하여 측정하였고 Af 특이 IgE 항체는 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 96 well ELISA plate(Corning Inc., Corning, NY)에 carbonate 버퍼용액(pH 9.6)으로 녹인 5 μg/ml rat anti-mouse IgE 단일항체(Biosource, Camarillo, CA)를 4℃에서 하룻밤 동안 유치(incubation)시킨 후 PBS-Tween20 버퍼용액(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)으로 4번 씻어낸 다음 10% fetal calf serum(Gibco, Grand Island, NY)으로 2시간 동안 blocking시켰다. 2배씩 희석된 각각의 혈청(시작 1：2)과 마우스 purified IgE standards(Pharmingen)를 각 well에 넣은 다음 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰고 3번 씻어냈다. Biotinylation을 위해 Af(2 mg/ml)를 biotin N-hydroxy succinimide ester(Vector, Burlingame, CA)와 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS/0.05%/sodium azide로 하룻밤 동안 투석하였다. Biotinylated Af 0.1 μg 을 각 well에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, Streptavidin-horseradish peroxidase(HRP) conjugate(1/ 1000 dilution in PBS/10% FCS；Sigma)로 1시간 동안 추가반응시켰다. Plate를 3번 씻어낸 후 tetramethyl-benzidine(TMB)용액(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)을 첨가한 후 10분 후에 microplate reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 OD 450 nm에서 결과를 판독하였고 Unit/ml로 표시하였다. Af 특이 IgG1 항체의 측정은 각 well을 5 μg/ml Af 항원으로 4℃에서 하룻밤 동안 먼저 유치시킨 후 PBS-Tween20 버퍼용액으로 씻어낸 다음 10% fetal calf serum으로 2시간 동안 blocking시켰다. 2배씩 희석된 각각의 혈청(시작 1：100)을 각 well에 넣은 다음 2시간 동안 반응시키고, biotinylated goat anti-mouse IgG1(1：4000；Boehringer-Mannheim, Indian-apolis, IL)으로 1시간 동안 추가반응시켰다. Streptavidin-HRP로 1시간 반응시킨 후 TMB용액을 첨가하여 10분 후에 microplate reader로 값을 구하였다.

조직학적 검사
   비강 세척과 혈액채취가 끝난 후에 마우스를 희생시켜 머리를 분리하고 두부로부터 피부와 근육 등을 제거한 후 4% paraformaldehyde에 24시간 동안 고정하였다. 탈석회액(Decalcifier II, Surgipath, Richmond, IL)에 48시간 동안 담근 후 비강조직을 파라핀에 넣고 5 μm의 두께로 관상면(coronal section)으로 잘랐다. Hematoxyline-eosin 염색을 시행하였고 호산구수 측정을 위해 Luna 염색을 하였다. 호산구수 측정은 400배 광학 현미경하에서 상악동이 가장 크게 보이는 위치의 비중격점막 5곳의 호산구수를 측정하여 각 군의 평균치를 비교하였다.

통계처리방법
  본 연구에서 얻은 측정치가 정상마우스군과 비만세포 결핍마우스군 간에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위해 SPSS version 10 프로그램(SPSS INC., Chicago, IL)의 Wilcoxon rank sum test를 이용하였고, p<0.05를 통계적으로 의미있다고 하였다.

결     과

비강세척액의 IL-5 비교
   마지막 비강내 점적 24시간 후에 수집된 비강세척액에서 Af 항원을 투여한 정상마우스군은 생리식염수를 투여한 정상마우스군보다 IL-5가 유의하게 증가하였다(p<0.05). 급성군에서 Af 항원을 투여한 정상마우스군은 23±6 ng/ml이었고 비만세포 결핍군은 11±5 ng/ml로 유의한 차이를 보였지만(p<0.05), 만성군에서는 정상마우스군(32±7 ng/ ml)과 비만세포 결핍군(29±8 ng/ml) 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 1).

비강세척액 및 비점막내 호산구 침윤정도의 비교
   급성군에서 Af 항원을 투여한 정상마우스군의 비강세척액 총 염증세포수는 22±3.5×10⁴ cells로 비만세포 결핍군(13±3.1)과 유의한 차이를 보였고(p<0.05), Af 항원을 투여한 정상마우스군의 비강세척액 호산구수(14.5±3.4, 총 염증세포의 66%)도 비만세포 결핍군(8.5±2.5)과 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 만성군에서는 총 염증세포수와 호산구수에 있어 정상마우스군과 비만세포 결핍군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 2). Af 항원을 투여한 정상마우스군의 비강점막에서는 염증세포 특히 호산구의 침윤이 관찰되었다. 호산구는 상피세포층보다 상피하 고유층에 주로 분포하였으며, 일부에서 상피하 고유층의 부종소견도 관찰되었다(Fig. 3). 급성군에서 Af 항원을 투여한 비만세포 결핍군은 한 시야당 평균 12±4개로 정상마우스군의 29±6개에 비해 유의하게 호산구수가 감소하였으나(p<0.05), 만성군에서는 비만세포 결핍군(39±9개)과 정상마우스군(41±6개) 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 4).

혈청 Af 특이 IgE, IgG1 항체농도 비교
   Af 항원을 투여한 정상마우스군의 Af 특이 IgE, IgG1 항체농도는 항체가 거의 검출되지 않은 대조군에 비해 유의한 차이를 보였다(p<0.05). Af 특이 IgE 농도는 급성군에서 Af 항원을 투여한 비만세포 결핍군(470±85 Unit/ml)과 정상마우스군(502±110 Unit/ml) 간에 유의한 차이를 보이지 않았고, 만성군에서도 비만세포 결핍군(722±120 Unit/ml)과 정상마우스군(695±130 Unit/ml) 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05). Af 특이 IgG1 농도도 급성군에서 비만세포 결핍군(379±97 Unit/ml)과 정상마우스군(412±65 Unit/ml) 간에 유의한 차이를 보이지 않았고, 만성군에서도 비만세포 결핍군(469±82 Unit/ml)과 정상마우스군(495±77 Unit/ml) 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 5).

고     찰

   Aspergillus fumigatus(Af)는 알레르기 비염 및 천식과 같은 알레르기 질환뿐 아니라 aspergilloma, invasive aspergillosis, allergic bronchopulmonary aspergillosis 등과 같은 여러 질환의 원인 진균이다.⁸⁾ 본 연구에서는 이러한 Af 항원을 이용하여 알레르기 비염 마우스 모델을 만들었으며 항원 보강제 없이 비강내 국소감작만으로도 알레르기 비염의 특징인 항원특이 IgE 항체 생성과 조직내 호산구 침윤이 나타났다. Af 항원이 비강 점막에 대해 Th₂ 면역반응을 보이는 것은 Af의 탄수화물 성분이 Th₂ 면역반응을 유도하는 내부 항원보강제 역할을 하기 때문이다.⁸⁾
   비만세포는 골수의 pluripotent CD34+ 조혈세포에서 유래되어 혈액 내에서 형태학적으로 구별되지 않는 전구상태(progenitors)로 있다가 국소조직 내에서 stem cell factor와 IL-3, IL-6 등과 같은 사이토카인 등의 자극을 받아 분화하게 되며, 비만세포의 위치에 따른 다양한 기능과 생물학적 작용은 이러한 분화과정에 기인하는 것으로 추측된다.³⁾ 항원 접촉 후 수분 내에 비만세포에서 히스타민, heparin, protease 등과 같은 이미 형성된 과립 연관 매개체가 유리되고 이어 새로이 만들어진 지질 매개체들이 유리되어 알레르기 조기반응을 일으킨다. 항원 접촉 후 1시간 정도가 되면 다양한 사이토카인과 chemokine 등이 비만세포에서 만들어지며 이중 IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, TNF-α, GM-CSF, IL-8, eotaxin, RANTES, MCP-1 등이 호산구 염증과 관계가 있는 것으로 알려져 있다.⁹⁾
   알레르기 염증은 조직학적으로 호산구의 침윤을 특징으로하며 이러한 조직내 호산구의 증가는 골수내 호산구의 증가, 조직으로의 이동, 세포자멸사의 지연 등 다양한 기전이 관여하지만 IL-5, eotaxin, GM-CSF 등이 가장 중요한 역할을 한다.^9,10) IL-5는 골수에서의 호산구 분화, 혈액 내로의 이동, 호산구 활성화 등에 중요한 역할을 하며, 비만세포, T 세포, 호산구 등에서 분비된다.⁹⁾ 알레르기 동물모델에서 항 IL-5 항체를 투여하거나⁶⁾ IL-5 결핍마우스에서는¹¹⁾ 호산구 염증이 거의 일어나지 않는다. 비만세포는 호산구 화학주성에 중요한 eotaxin을 직접 분비하기도 하지만 IL-1β, TNF-α, IL-4 분비를 통해 상피세포 및 혈관내피세포의 eotaxin 발현을 증가시킨다. 알레르기 동물모델에서 eotaxin의 증가는 항원투여 12~24시간 후에 항원 투여 전 상태로 돌아오지만¹²⁾ IL-5의 증가는 5일까지 유지되어 지속적인 호산구 염증과 좀더 관계가 많다.¹³⁾
   비만세포 결핍마우스를 이용한 연구는 지금까지 천식모델에서 주로 이루어졌으며 급성과 반복적인 항원 투여에 의한 만성모델을 비교하여 알레르기 모델을 만든 보고는 없었다. 본 연구에서 Af 항원으로 감작 후 한번 항원투여를 한 비만세포 결핍군에서는 비강세척액에서의 IL-5와 호산구 침윤이 감소하였지만 5일 동안 연속투여 후에는 정상마우스군과 차이를 보이지 않았다. 이것은 항원투여에 의한 면역반응 초기에는 비만세포가 호산구 침윤에 어느 정도 역할을 하지만 연속적인 항원투여에 의해 유도된 만성적이고 강한 면역반응에서는 비만세포가 큰 역할을 하지 못하였던 것이 원인으로 생각된다.
   알레르기 염증반응에서의 비만세포 역할에 대한 기존의 연구에서, Kung 등⁴⁾은 난알부민을 복강내 전신감작시킨 후 하루 동안 2번 항원을 주었을 때 비만세포 결핍마우스에서 폐 호산구 염증이 감소한다고 하였으나 항원투여를 좀더 오랫동안 한 다른 연구에서는 비만세포 결핍마우스에서도 정상마우스와 유사한 호산구 염증이 생긴다고 하였다.^14,15,16) Williams와 Galli¹⁷⁾는 난알부민을 항원보강제없이 전신감작시키고 비강내로 항원투여를 했을 때는 비만세포 결핍마우스에서 폐 호산구 염증이 감소하지만, 항원보강제와 같이 전신감작시키고 분무로 항원 투여를 하였을 때는 비만세포 결핍마우스도 정상마우스와 유사한 반응을 보인다고 하였고 FcεRI 결핍마우스에서도 유사한 결과를 보였다. 이것은 기도염증반응과 과반응성에서의 비만세포 역할은 알레르기 동물모델에 따라 다르게 나타남을 의미하며, 비만세포 결핍마우스에서 강한 면역반응으로 많은 호산구 침윤을 유도한 동물모델에서는 폐 호산구 침윤과 Th₂ 사이토카인이 정상마우스와 차이를 보이지 않고, 약한 면역반응으로 적은 호산구 침윤을 유도한 동물모델에서는 호산구 침윤이 감소함을 의미한다.¹⁸⁾
   본 연구에서도 천식모델과 유사하게 비만세포 결핍마우스에 연속적인 항원투여를 한 후의 조직내 호산구 침윤이 정상마우스와 차이를 보이지 않았다. 이것은 만성 알레르기 비염 동물모델에서는 Th₂세포와 Th₂세포에서 분비되는 사이토카인이 호산구 침윤에 주된 역할을 하기 때문으로 생각된다.¹⁹⁾ 비만세포가 IL-4와 같은 사이토카인을 분비함으로써 Th₂세포 분화를 증가시키지만⁹⁾ 본 연구에서 비만세포 결핍마우스는 Th₂ 면역반응과 관계된 Af 특이 IgE, IgG1 항체가 정상마우스와 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 비만세포가 Th₂ 면역반응과 관계된 항체 생성에 큰 역할을 하지 못함을 시사하는 결과로 생각된다.

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