교신저자：이재서, 110-744 서울 종로구 연건동 28  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 2072-3991 · 전송：(02) 745-2387 · E-mail：csrhee@snu.ac.kr

서     론

   비강의 섬모상피에 의한 점액섬모운동은 호흡기의 중요한 일차 방어기전으로 점막에 부착된 흡기중의 유해한 분자들을 제거하는 역할을 한다. 점액섬모기능의 저하는 외부자극에 대한 반응의 감소와 비강과 부비동의 분비물의 저류를 일으키고 자연공의 폐쇄를 야기하여 부비동염 등 상부 호흡기 질환의 원인이 될 수 있다.
   점액섬모운동에 영향을 미치는 요인에 대한 많은 연구가 이루어졌고 과거의 연구들은 주로 특정 환경조건이나 약품, 싸이토카인 등이 점액섬모운동에 미치는 영향을 확인하는데 중점을 두었다.^{1)2)3)4)5)6)7)8)9)} 그러나, 점액섬모운동조절에 관련된 신호전달체계에 대한 연구는 부족한 상황이다.
   부교감신경계에 의한 점액섬모운동의 항진은 비교적 잘 알려져 있고 아세틸콜린에 의한 섬모운동의 항진의 신호전달체계에 대한 연구 결과 프로스타글란딘,¹⁰⁾ 5-HT,¹¹⁾ Neuropeptide-Y,¹²⁾ Protein kinase-C¹³⁾ 등도 섬모운동 조절에 관련된 신호전달체계에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 
   최근 산화질소가 부비강점막의 점액섬모운동을 증가시킨다는 것이 증명되었다.^1)14)15) 산화질소(Nitric Oxide, 이하 NO)는 부비강에서 주로 inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해서 생성되는데, 정상비강점막에서 iNOS의 발현은 약하지만, 알레르기비염 및 만성부비동염 등의 염증성 비강점막에서 iNOS 발현이 증가되는 것으로 밝혀졌다. NO가 점액섬모운동조절에 관련되어 있고, 부교감신경계에 의한 섬모운동조절에서 산화질소의 역할에 대한 연구가 있어 왔으나 아직까지 논란의 대상이 되고 있다.^16)17)18) 또한 알레르기 비염 등의 염증성 비질환에서 발현이 증가된 iNOS가 비강점막의 기초점액섬모운동(basal ciliary beat frequency) 조절에만 관여하는지, 아니면 콜린성 점액섬모운동항진에도 관여하는지에 대한 연구가 없었다.
   본 연구는 비점막 세포 이외의 섬모세포에서 증명된 부교감신경계에 의한 점액섬모운동의 항진이 실제 비강호흡기 점막에서도 적용되는지를 확인하고, 부교감신경계에 의한 점액섬모운동 조절의 신호전달과정에서 NO의 역할을 규명하고 전달 경로의 모델을 구성하고자 하였다.

재료 및 방법

호흡기점막의 준비 및 배양
   몸무게 300 g의 건강한 흰쥐(SD Rat)를 실험동물로 사용하였고, ketamine(500 mg/kg)을 이용하여 마취시킨 후 가위를 이용하여 비중격을 채취하였다. 박리한 비중격점막을 등장액의 생리식염수로 세척하여 혈액과 분비물 등을 제거한 후, 2×2 mm 크기로 절제하였다. 역위현미경(Inverted microscope, BX51WI, Olympus)을 통해서 절제연에서 섬모운동이 잘 관찰되는 조직을 35 mm plastic culture dish에 넣고 DMEM-F12(Gibco BRL, Grand Island, NY) 배양액을 넣어서 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액에는 정상 상재균의 생장을 억제하기 위해서 항생제와 항진균제(10 IU/mL penicillin, 10 μg/ mL streptomycin, 0.025 μg/mL amphotericin B)를 첨가했다. 배양된 점막시료는 48시간 이내에 실험에 이용되었다. 각각의 실험에서 최소한 5회를 반복하여 평균값을 구하였다.

섬모운동빈도(Ciliary Beat Frequency, CBF)의 측정 
   비디오전산화분석시스템을 이용하여⁹⁾ CBF를 측정했다. 약술하면 각 점막 시료에서 최소 5회 CBF를 측정하고 이 값의 평균을 해당점막의 CBF 값으로 정하였다. 섬모운동을 역위현미경의 600배로 관찰하면서 CCD(charged coupled device) camera(Digistar, Xomed, Jacksonville, FL)를 통해 모니터에 상(image)을 전송한 후, 이 영상을 PC로 전송하고 자료를 디지털화하여 FFT(fast-Fourier transformation)에 기반을 둔 프로그램(CBF 2000)에 의해 분석하였다. 섬모운동은 온도에 영향을 받기 때문에 실험하는 동안 항온기를 사용하여 온도를 37℃로 유지했다.

실험 디자인
   첫째, 실제로 비강점막에서 메타콜린에 의한 섬모운동항진효과가 있는가를 알아보고자 하였다. 메타콜린에 의해서 CBF 값이 증가하고, 이것이 메타콜린의 농도에 비례하고 muscarinic receptor antagonist인 atropine에 의해서 억제되는지를 관찰하였다.
   둘째, 메타콜린에 의한 섬모운동항진의 신호전달과정에서 프로스타글란딘의 역할을 규명하고자 하였다. Cyclooxygenase inhibitor인 diclofenac을 투여한 후 메타콜린에 의한 섬모운동항진의 변화를 관찰하였다. 
   셋째, NO의 역할을 규명하고자 하였다. NO synthase blocker인 L-NAME을 투여한 후 메타콜린에 의한 섬모운동항진의 변화를 관찰하였다.

메타콜린의 효과 
   메타콜린 농도 10^-10, 10^-8, 10^-6 mol/L에서 각각 CBF를 측정했다. Basal CBF를 5분간 측정한 후 점막 시료를 담고있는 배양액을 메타콜린을 포함하는 배양액으로 교환하고, 20분간 CBF를 20회 측정하여 평균값을 구한 후 CBF의 변화를 관찰하였다.

Atropine의 효과 
   Basal CBF를 측정한 후 배양액을 atropine을 포함하는 배양액으로 교환한 후 15분 후에 다시 메타콜린을 포함하는 배양액(10^-6 mol/L)으로 교환하여 CBF를 측정하였다. 

프로스타글란딘의 효과 
   Basal CBF를 측정한 후 diclofenac(cyclooxygenase inhibitor, 10^-6 mol/L)을 포함하는 배양액으로 교환한 후 15분 후에 다시 메타콜린(10^-6 mol/L)을 포함하는 배양액으로 교환하여 CBF를 측정하였다. 

NO의 효과 
   Basal CBF를 측정한 후 L-NAME(L-n-arginine-methyl-ether, 10^-6 mol/L)을 포함하는 배양액으로 교환한 후 30분 후에 다시 5분간 basal CBF를 측정하였다. 메타콜린(10^-6 mol/L)을 포함하는 배양액으로 교환하고 20분간 CBF를 측정하여 L-NAME에 의한 muscarinic ciliostimulation 억제효과를 관찰하였다.

통계적 분석
   시료마다 basal CBF 값을 기준으로 하여 CBF 변화량(ΔCBF)을 백분율로 표현하였으며 통계분석은 Wilcoxon rank sum test로 시행하고 p<.05인 경우를 통계적으로 의미 있게 보았다. 결과의 값은 평균±표준편차의 형태로 제시하였다.

결     과 

메타콜린에 의한 섬모운동항진 효과
   흰쥐 비중격점막의 basal CBF는 7.84±0.74 Hz였고 메타콜린을 투여했을 때 메타콜린 농도에 비례하여 CBF가 증가하였다(Fig. 1). 투여 후 3시간 경과 후에 모든 농도에서 유의하게 CBF의 증가가 관찰되었고, 최대 증가율은 10^-6 mol/L의 메타콜린을 투여하여 6시간 후에 볼 수 있었고, 44.1%의 증가율을 보였다.

Atropine의 효과 
   Atropine을 20분간 전 처치한 후 메타콜린을 투여한 경우, atropine 투여 직후 basal CBF가 27.8±8%까지 감소하였으나, 이후 메타콜린을 투여했을 때 ΔCBF는 atropine을 전 처치하지 않고 메타콜린을 투여한 군과 유의한 차이가 없었다(Fig. 2).

프로스타글란딘의 효과 
   Diclofenac을 투여한 직후에 basal CBF의 변화는 -0.9± 7%로 통계적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았고, 메타콜린을 투여했을 때 ΔCBF는 -5.8±5.8%로 diclofenac이 메타콜린의 섬모운동 촉진효과를 의미있게 감소시켰다(Fig. 3). 시간의 경과에 따라 메타콜린에 의해 CBF가 증가되는 양상을 보이지 않고, 비슷하거나 감소하는 양상을 보였다.

산화질소의 효과
   L-NAME를 투여한 경우 basal CBF의 통계적으로 의미있는 변화는 관찰되지 않았고(Fig. 4), 메타콜린에 의한 ΔCBF는 유의하게 감소하였다(Fig. 5).

고     찰

   본 연구는 흰쥐의 비중격점막에서 호흡상피세포를 기저막에 부착된 상태로 실험함으로써 in vitro 상태로 실험하면서 in vivo 상태에 가까운 조건을 만들었다. 본 실험에서 basal CBF 값은 7.84 Hz로 다른 연구 논문에서 밝힌 CBF 값과 다른데,¹⁶⁾ 이는 실험에 사용된 종이 다른 것에 기인한 것으로 판단되나 약제의 효과를 판단하는데는 문제가 없었다.
   본 연구에서 Nonselective muscarinic receptor blocker인 atropine은 basal CBF를 감소시켰으나, 메타콜린에 의한 ΔCBF에는 영향이 없었다. 대조군에 비해 atropine 전 처치군에서 methacholine 투여 6시간 후 ΔCBF가 감소한 것은 atropine 전 처치의 지연효과일 가능성이 있으나 본 연구에서는 atropine만의 장시간에 걸친 kinetic study가 이루어지지 않아 알 수 없다. Muscarinic receptor는 M1에서 M5까지 적어도 5가지 이상의 아형을 가지고 있는 수용체군으로 G protein과 상호작용을 하여 신호전달을 한다.¹⁹⁾ 아형에 따라 조직내 분포, 작용제(agonist), 길항제(antagonist)에 대한 친화력, 기능 등에 차이를 보인다. M1, M3, M5 아형은 inositol polyphosphate를 형성하여 phospholipase C를 활성화하는 반면 M2, M4 아형은 cAMP 형성을 억제한다. 인체의 비강에는 주로 M1과 M3의 아형이 존재하는데, M3 아형이 대부분이고, M2 아형은 없다. 따라서 atropine에 의한 CBF의 억제는 대부분 M3 아형 muscarinic receptor의 차단을 통한 것이라고 여겨진다. 
   Diclofenac을 투여하여 cyclooxygenase pathway를 차단시켰을 때 메타콜린에 의한 섬모운동 증가효과가 차단되는 것은 메타콜린에 의한 CBF의 증가에 내인성 프로스타글란딘이 필요하다는 것을 암시한다. 이에 대한 다른 해석으로 cyclooxygenase pathway를 차단하여 상대적으로 아라키돈산의 lipoxygenase pathway가 활성화 되어 이의 대사산물인 LTC4나 LTD4가 CBF에 미치는 영향을 고려해 볼 수 있으나 이들 류코트리엔들이 CBF에 미치는 영향에 대해서는 아직 일치된 견해가 없다.²⁰⁾
   NO는 기관지천식과 알레르기 비염 등과 같은 기도의 염증성 질환에서 증가하고 Kartagener 증후군 환자군에서 감소한다.¹⁹⁾ NO는 내피세포, 음경해면체, 그리고 갑상선세포에서 acetylcholine의 2nd messenger 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ NO는 호흡상피세포에서 CBF를 증가시킨다.¹⁷⁾ Yang 등¹⁹⁾과 Runer 등¹⁷⁾은 인체 아데노이드 점막을 이용한 실험에서 NOS activity를 억제함으로써 메타콜린에 의한 CBF 항진효과가 없어짐을 보고하였으나, Salathe 등¹⁸⁾은 양의 기관점막을 이용한 실험에서 NOS를 억제하여도 acetylcholine에 의한 CBF 항진효과에 변함이 없음을 보였고, Alberty 등¹⁶⁾도 인체의 하비갑개점막을 이용한 실험에서 같은 결과를 보였다. 이와 같이 NO와 cGMP 합성이 부교감신경성 점액섬모운동조절의 신호전달과정에 관련됐을 수 있으나 아직 논란의 여지가 있다. 본 실험에서 NO 합성효소의 억제제인 L-NAME를 투여했을 때 메타콜린에 의한 ΔCBF가 유의하게 감소함을 볼 수 있었다. 하지만 메타콜린을 주지 않고 L-NAME만 준 경우에 CBF의 변화가 없는 사실로 보아 NO 합성효소가 자극이 없는 정상상태에서 CBF를 조절하는데 별 영향을 끼치지 않고, 자극을 받아서 활성화 되어 있을 때 점액섬모운동에 관여할 것으로 여겨진다.
   본 연구에서 내인성 프로스타글란딘이나 NO 생성을 억제함으로써 메타콜린의 섬모운동자극효과를 상당히 억제할 수 있었으며 이는 이들 2nd messenger들이 메타콜린의 신호전달과정에서 별개의 기전으로 작용하지 않고 하나의 신호전달과정에 있을 것을 시사한다. 그러나 본 실험은 흰쥐의 비중격점막을 이용한 것으로 인체의 비강점막에서 동일한 기전이 작용할 지에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

결     론

   본 연구에서 메타콜린은 비점막 점액섬모운동을 증가시키며, NO와 cyclooxygenase pathway가 이에 관여할 것으로 생각된다. 만성 부비동염 환자에서 아세틸콜린 분비와 내인성 프로스타글란딘, 산화질소 생성을 조절함으로써 인체 호흡기점막의 방어 기제를 조절할 수 있을 것으로 판단된다.

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