교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 220-7698 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：ksrha@cnu.ac.kr

서     론

   최근 수십 년 내에 기관지 천식, 알레르기 비염 등의 알레르기 질환이 전세계적으로 증가 추세에 있다. 이러한 현상은 산업화에 따른 오존, 이산화질소, 아황산가스, 디젤연소분자(diesel exhaust particles；DEP) 등의 대기오염물질 증가나 생활양식의 변화에 의한 것으로 생각되고 있다.¹⁾²⁾
   대표적인 대기오염물질 중의 하나인 오존은 광화학적 스모그의 주된 성분을 이루는 자극적인 산화기체로 기도 점막의 염증을 야기하고, 기도과민반응을 유발하며, 항원에 대한 알레르기 반응을 증강시켜 천식 증상을 악화시키는 것으로 알려져 있으며,³⁾⁴⁾ 오존농도가 높은 환경에서 운동을 하면 천식의 유병률이 높아진다고 보고되어 있다.⁵⁾ 그러나 어떤 기전에 의해 오존이 알레르기 질환의 증가에 기여하는 지에 대하여는 아직 확실치 않다.
   그동안 동물실험을 통한 여러 연구에서 항원과 오존에 동시에 노출하였을 때 IgE 항체⁶⁾나 IgG₁ 항체⁶⁾의 생산이 항원 단독노출군에 비해 증가하고 기관지폐포세정액 내 호산구⁷⁾와 IL-4, IL-5 등의 cytokine⁶⁾이 유의하게 증가한다고 보고되어 있어, 반복적인 오존노출이 Th2 면역반응을 야기할 수 있으며 항원과 동시에 노출되었을 때에는 항원에 대한 알레르기 반응을 증강시킬 수 있음을 시사하고 있다.
   그 동안 하기도가 아닌 비강을 대상으로 한 연구는 거의 없었으나 최근 Jin 등⁸⁾은 BALB/c 마우스를 대상으로 0.3 ppm의 오존에 반복적으로 노출했을 때 대조군에 비해 혈청 총 IgE와 IgG₁, 비세정액 내의 IL-4와 IL-5는 유의하게 증가하였으나 INF-γ는 변화가 없음을 관찰하여 오존이 비점막에서 Th2 면역반응을 야기할 수 있다고 주장하였으며, Iijima 등⁹⁾¹⁰⁾은 기니픽에서 1% 난알부민 용액을 비강 내에 주입함과 동시에 0.4 ppm의 오존에 노출하였을 때 재채기와 같은 알레르기 증상을 악화시키고 비점막 내의 호산구 침윤과 혈청 내 anti-OVA IgG 항체의 생산을 증가시킨다고 보고하여 비점막에서도 오존이 항원에 대한 알레르기 반응을 증강시킬 수 있을 것으로 생각되고 있다.
   이에 본 연구에서는 BALB/c 마우스를 대상으로 난알부민 분무와 오존노출을 동시에 시행하였을 때 난알부민 분무만 시행한 군에 비해 난알부민에 대한 알레르기 반응이 증강되는지 알아보고자 하였으며, 만일 증강된 반응을 보인다면 이 반응 정도가 전신감작을 시행한 경우와 유사한지 아니면 차이를 보이는지 비교해보고자 하였다. 또한 전신감작을 시행한 경우에도 국소 유발을 위해 난알부민 분무하는 과정에서 동시에 오존에 노출하였을 때 알레르기 반응이 증강되는지 알아보고자 하였다.

대상과 방법

실험동물
   무균상태로 사육된 18~22 g의 6주령 BALB/c 마우스 35마리를 사용하였다. 실험 1주일 전부터 온도 20~23℃, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하여 실험실 환경에 적응하도록 하였으며, 이 기간 내에 상기도 감염의 증상이나 다른 질환이 관찰되는 마우스는 실험에서 제외하였다.

실험군의 분류
   실험동물은 다섯 군으로 나누어 각 군마다 7마리씩 배정하였다(Fig. 1).

Group Ⅰ. 대조군
   난알부민 에어로졸 대신 PBS(phosphate buffered saline) 에어로졸에 노출되도록 하였으며 다른 군이 오존에 노출되는 동안에는 의료용 공기를 흡입하도록 하였다.

Group Ⅱ. 난알부민 분무군
   난알부민 국소 감작을 유발하기 위해 난알부민 에어로졸에 하루 20분씩 일주일에 5차례, 4주간 노출되도록 하였다.

Group Ⅲ. 난알부민 분무/오존노출군
   4주간의 실험기간 중 난알부민 에어로졸에 하루 20분씩, 일주일에 5차례 노출되도록 하였으며 같은 기간 중 0.3 ppm의 오존에 하루 4시간, 일주일에 3차례 노출되도록 하였다.

Group Ⅳ. 난알부민 전신감작군
   전신감작을 위해 난알부민 용액 0.1 ml를 3회, 즉 실험 시작 0일, 7일, 14일에 복강 내에 주사하였으며, 1주일 후 유발을 위해 난알부민 에어로졸에 하루 20분씩, 5차례 노출되도록 하였다.

Group Ⅴ. 난알부민 전신감작/오존노출군
   Ⅳ군에서와 같은 방법으로 난알부민 용액을 복강 내에 주사하고 분무하였으며, 같은 기간 중 0.3 ppm의 오존에 하루 4시간, 일주일에 3차례 노출되도록 하였다.

난알부민 용액의 제작과 투여
   전신감작용 난알부민 용액은 생리식염수 1 ml에 난알부민(ovalbumin：chicken egg albumin, grade Ⅴ, Sigma, St. Louis, MO) 20 μg과 수산화알루미늄[Al(OH)₃]겔 2 mg을 용해하여 만들었다. 분무용 난알부민 용액은 PBS 1 ml에 난알부민 10 mg을 녹여 만들었다. 40×40×30 cm 크기의 아크릴 상자를 만들고 그 옆면에 구멍을 내어 분무기(jet nebulizer, Pulmo-Aide^®, Devilbiss, Somerset, PA)와 연결하였다(Fig. 2). 항원 감작 혹은 유발을 위해 마우스를 이 상자에 넣고 분무기에 의해 생성된 난알부민 에어로졸에 노출되도록 하였다.

오존 노출
   오존 폭로상자는 전신흡입상자(whole-body inhalation chamber)의 형태로 30×20×17 cm의 크기로 제작하였다. 오존발생기로는 SMO-200 ozone generator(삼성 매직 오존, Korea)를 사용하였다. 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공기와 섞여 상자 내로 유입되도록 하였다. Porta-sens model B16-14(Analytical Technology, Oaks, PA) 오존측정기를 사용하여 상자 내의 오존농도를 측정하면서 오존의 유입량을 조절하여 농도를 0.3 ppm으로 맞춘 다음 폭로시간 내내 일정한 농도가 유지되는지 감시하였다. 그리고 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화한 다음 배출되도록 하였다. 오존노출을 시행한 Ⅲ군과 Ⅴ군의 동물은 0.3 ppm의 오존에 하루 4시간씩 일주일에 3차례, 4주간 노출되도록 하였다.

비세정액과 혈액의 채취
   마지막 노출 24시간 후 케타민(250 mg/kg)을 복강 내로 주입하여 마취한 다음 비세정액을 채취하였다. 머리를 신전하여 전비공이 가장 낮게 위치하도록 하였다. 기관절개를 하고 기관절개 창을 통해 cut-down tube를 삽입하여 관의 끝을 후비공에 위치한 다음 0.1 M PBS 용액 1 ml를 5분 이상에 걸쳐 점적한 다음 전비공으로 흘러나오는 비세정액을 받았다. 비세정액은 평균 0.9 ml가 회수되었으며, 세정액 내의 cytokine을 측정하기 위하여 윈심분리(100 g, 5분)한 다음 상청액 0.5 ml을 채취하여 측정 전까지 -70℃에서 보관하였다.
   비세정액을 채취한 다음 개복하여 하대정맥을 노출시킨 후 26G 1 cc 주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 평균 채취량은 0.5 ml이었으며, IgE와 IgG₁의 양을 측정하기 위하여 채취한 혈액을 4℃에서 2~4시간 동안 보관한 후 원심분리(1200 g, 15분)를 시행하여 혈청을 분리한 다음 측정 전까지 -70℃에서 보관하였다.

비세정액 내의 cytokine 측정
   ELISA를 이용해 비세정액 내의 IL-4, IL-5, INF-γ의 양을 측정하였다. 96-well ELISA plate에 rat anti-mouse IL-4, IL-5, INF-γ capture antibody(BD Biosciences, San Diego, CA)를 carbonate coating buffer (pH 8.2)로 희석하여 입힌 후 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. Washing buffer(0.1% Tween 20/PBS, pH 7.2)로 3회 반복하여 세척한 다음 비특이적 반응을 억제하기 위하여 Assay Diluent(10% FBS/PBS, pH 7.0, BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 cytokine standard 용액(BD Biosciences, San Diego, CA) 혹은 비세정액 0.1 ml를 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척한 다음 Working Detector(Detection Antibody+Avidin-HRP reagent, BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 7회 세척한 후 기질용액(substrate solution)을 넣은 다음 어두운 곳에서 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액(H2SO4)을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer(SPECTRA MAX Plus, Molecular Devicies, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였다.

면역글로불린의 측정
   ELISA를 이용하여 혈청 내 IgE의 농도를 측정하였다. 96-well ELISA plate에 rat anti-mouse IgE(BD Biosciences, San Diego, CA)를 carbonate coating buffer(pH 8.2)에 1：250배로 희석하여 입힌 후 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. Washing buffer(0.1% Tween 20/PBS, pH 7.2)로 3회 반복하여 세척한 다음 비특이적 반응을 억제하기 위하여 Assay Diluent(10% FBS/PBS, pH 7.0, BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 antibody standard 용액(BD Biosciences, San Diego, CA) 혹은 1：100으로 희석한 혈청 0.1 ml를 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척한 다음 Working Detector를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 7회 세척한 후 기질용액을 넣은 다음 어두운 곳에서 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer(SPECTRA MAX Plus, Molecular Devicies, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였다.
   혈청 내의 OVA-specific IgE 혹은 OVA-specific IgG₁ 항체를 측정하기 위해 96-well ELISA plate에 난알부민 용액(10 μg/ml OVA in PBS, pH 9.6)을 입힌 후 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 완충액으로 세척 후 비특이적 반응을 억제하기 위하여 Assay Diluent를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 standard 용액 혹은 혈청 0.1 ml를 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 이 때 혈청은 IgE를 측정하기 위해서는 1：100으로, IgG₁를 측정하기 위해서는 1：2,000으로 희석하였다. 완충액으로 세척한 다음 Working Detector를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척한 후 기질용액을 넣은 다음 어두운 곳에서 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

비점막에 침윤된 호산구의 측정
   마우스의 머리를 몸통에서 절단한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다. 하악, 피부와 근육을 제거한 다음 4% paraformaldehyde 용액에 24시간 동안 고정하고 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) 용액에 1주간 탈회하였다. 상절치 바로 뒤에서부터 경구개의 절치유두(insicive papilla)의 약 2 mm 전방부위까지 절단하여 블록을 만들고 파라핀 포매 후 5 μm의 두께로 절편을 만들었다. 호산구를 관찰하기 위하여 Luna 염색을 하였고, video micrometer(VM-30, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 maxilloturbinate의 내측 점막에 침윤된 호산구의 수를 측정하였다.결과는 104 μm² 당 호산구의 수로 표현하였다.

자료 분석 및 통계처리 방법
   각 군 사이에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위하여 SPSS version 10.0의 분산 분석(independent t-test)를 이용하였고, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

혈청 내 면역글로불린의 농도
   혈청 내 총 IgE 항체는 대조군이나 난알부민 분무군에 비해 Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군에서 유의하게 증가되어 있었으며, Ⅲ군과 비교하였을 때 Ⅳ군과 Ⅴ군에서 유의한 증가를 보였다. 그리고 Ⅳ군에 비해 Ⅴ군에서 약간 증가하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 3).
   OVA-specific IgE 항체도 대조군이나 난알부민 분무군에 비해 Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군에서 유의하게 증가되어 있었으며, Ⅲ군과 비교하였을 때 Ⅳ군과 Ⅴ군에서 유의한 증가를 보였다. 그러나 전신감작을 시행한 Ⅳ군과 Ⅴ군 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).
   OVA-specific IgG₁ 항체는 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의하게 증가되어 있었으며, Ⅱ군과 비교하였을 때 Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군 모두 유의한 증가를 보였다. 그리고 Ⅲ군과 비교하였을 때 Ⅳ군에서는 유의한 차이를 보이지 않았으나 Ⅴ군에서는 유의한 차이를 보였다(Fig. 5).

비세정액 내 cytokine의 농도
   비세정액 내의 IL-4 농도는 대조군과 난알부민 분무군 사이에는 유의한 차이가 없었으나, Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군에서는 대조군에 비해 유의하게 증가되어 있었다. 그리고 Ⅱ군에 비해 Ⅲ군과 Ⅴ군에서는 유의하게 증가되어 있었으며, Ⅳ군과 Ⅴ군 사이에도 유의한 차이가 있었다(Fig. 6)
   IL-5의 농도도 유사한 양상을 보여 대조군과 난알부민 분무군 사이에는 유의한 차이가 없었으나, Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군에서는 대조군이나 난알부민 분무군에 비해 유의하게 증가되어 있었다. 그리고 Ⅳ군과 Ⅴ군 사이에도 유의한 차이가 있었다(Fig. 7).
   비세정액 내의 INF-γ의 농도는 모든 군에서 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 8).

비점막 내의 호산구의 수
   비점막 내의 호산구의 수는 대조군과 난알부민 분무군 사이에는 유의한 차이가 없었으나, Ⅲ군, Ⅳ군, Ⅴ군에서는 대조군과 난알부민 분무군에 비해 유의하게 증가되어 있었다. 그리고 Ⅲ군과 Ⅳ군에 비해 Ⅴ군에서 유의하게 증가되어 있었다(Fig. 9).

고     찰

   최근의 여러 역학적 연구와 실험적 연구에서 여러 대기오염물질 중 DEP뿐만 아니라 오존이 알레르기 비염의 증상을 악화시키고 알레르기 비염의 유병률을 증가시킨다는 증거가 많이 제시되고 있다.^4)9)10)11) 그러나 오존이 어떤 기전에 의해 알레르기 비염의 유병률을 증가시키는 지는 아직 확실치 않다.
   그동안 오존과 항원 사이의 상호작용에 따른 반응을 연구하기 위해 점막이나 기도액 내의 염증세포에 관한 연구, 저항이나 기도반응성 등의 기능적인 연구, 조직학적인 변화에 대한 연구, cytokine에 대한 연구, 접착분자에 대한 연구, 항체에 대한 연구 등이 시행되어 왔다.¹²⁾
   이들 연구는 대부분 폐나 기관지 등 하기도를 대상으로 한 연구이며 알레르기 비염 동물모델이나 환자의 비점막을 대상으로 한 연구는 거의 없다. 최근 Iijima 등⁹⁾¹⁾⁰은 1% 난알부민 용액을 비강 내에 주입함과 동시에 0.4 ppm 오존에 노출하였을 때 재채기와 같은 알레르기 증상을 악화시키고 비점막의 반응성을 증가시키며 비점막 내의 호산구 침윤과 혈청 내 anti-OVA-IgG 항체의 생산을 증가시킨다고 보고하였다. 그러나 항원과 오존에 동시에 노출되었을 때 비점막에서 Th2 cytokine인 IL-4와 IL-5의 생산이 증가하는지 그리고 마우스에서 알레르기 반응을 매개하는 것으로 알려진 IgE 항체와 IgG₁ 항체의 생산이 증가하는지에 대한 연구는 아직 없는 실정이다.
   이에 본 연구에서는 BALB/c 마우스를 대상으로 난알부민 분무와 오존노출을 동시에 시행하였을 때 난알부민 분무만 시행한 군에 비해 혈청 총 IgE, anti-OVA IgE, anti-OVA IgG₁, 비세정액 내 IL-4, IL-5 등의 증가를 보이는지 알아보고자 하였으며, 만일 증가한다면 전신감작을 시행한 경우와 유사한지 아니면 차이를 보이는지 비교해보고자 하였다. 또한 전신감작을 시행한 경우에도 국소 유발을 위해 난알부민 분무하는 과정에서 동시에 오존에 노출하였을 때 알레르기 반응이 증강되는지 알아보고자 하였다.
   그 결과 혈청 내 총 IgE 항체와 anti-OVA IgE 항체는 난알부민 에어로졸을 분무하였을 때에는 대조군과 차이가 없었으나, 난알부민 분무/오존노출군에서는 난알부민 분무군에 비해 유의하게 증가하였으며, anti-OVA IgG₁ 항체도 난알부민 분무군에 비해 난알부민 분무/오존노출군에서 유의한 증가를 보여 감작되지 않은 상태에서 항원과 오존에 동시에 노출되었을 때에는 오존이 항원에 대한 항체 생산을 증강시킬 수 있을 것으로 생각한다. 그리고 난알부민 분무/오존노출군에서의 총 IgE 항체와 anti-OVA IgE 항체의 농도는 난알부민 전신감작군에 비해 유의하게 낮았으나 anti-OVA IgG₁ 항체의 농도는 난알부민 전신감작군과 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 난알부민 에어로졸 분무만으로는 알레르기가 유발되지 않지만 오존에 동시에 노출되었을 때에는 비록 전신감작을 시행한 군에는 미치지 못하지만 어느 정도 근접한 수준까지 항체 생산이 증가함을 시사하고 있다.
   전신감작을 시행한 두 군을 비교하였을 때에는 오존 노출을 시행한 군에서 항체 농도가 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았다. 따라서 오존은 항원에 대한 항체생산을 간접적으로 증강시키는 효과가 있는 것으로 생각한다.
   비세정액 내의 IL-4와 IL-5의 농도는 대조군과 난알부민 분무군 간에 차이가 없었으나, 난알부민 분무군에 비해 난알부민 분무/오존노출군에서는 유의하게 증가되어 있었다. 그리고 비점막에 침윤된 호산구의 수도 난알부민 분무군에 비해 난알부민 분무/오존노출군에서는 유의하게 증가되어 있었다. 따라서 오존은 항원과 동시에 노출되었을 때 IL-4와 IL-5의 생산을 증가시켜 알레르기 반응을 증강시키는 것으로 생각한다. 그리고 난알부민 분무/오존노출군의 IL-4와 IL-5 농도는 난알부민 전신감작을 시행한 군들과 비교하였을 때 유의한 차이를 보이지 않았으나, 오히려 전신감작을 시행한 두 군에서는 오존노출 여부에 따라 유의한 차이를 보였다. 이러한 결과는 오존이 직접 Th-2 cytokine 생산에 관여하며 항원과 동시에 노출되었을 때 부가적인 효과를 보이는 것으로 해석할 수 있다. 반면 Th1 cytokine인 INF-γ의 농도는 모든 군에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 오존은 기도점막에서 Th1/Th2 반응의 불균형을 초래하여 Th2 면역반응을 활성화시키는 것으로 생각한다.
   오존이 어떤 기전에 의해 항원 특이 항체의 생산을 증가시키고 Th2 cytokine의 생산을 증가시켜 알레르기 반응을 유발하고 증강시키는 지는 아직 잘 알려져 있지 않으나 여러 가지의 가설이 제시되고 있다.
   오존에 노출되면 비점막 상피세포의 손상¹³⁾과 점막의 염증을 초래하며 그에 따라 상피세포와 대식세포 등의 염증세포로부터 산화질소(NO)와 같은 세포독성 매개체가 생산된다.¹⁴⁾¹⁵⁾ Barnes 등¹⁶⁾은 기도점막에서 산화질소가 많이 생산되면 Th1 세포로부터 IL-2와 INF-γ의 생산이 억제되고 Th1 세포의 증식을 억제할 수 있기 때문에 Th1/Th2 면역반응 사이의 불균형을 초래하여 알레르기 질환을 악화시킬 것이라는 가설을 제시하였다. 또한 오존에 노출되면 상피세포의 손상으로 상피투과성이 증가하는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 따라서 항원을 포함한 작은 분자량의 자극물질은 쉽게 점막 내로 침투하여 지각신경을 자극하고 화학매개물질을 분비하여 비점막의 과민반응을 초래할 수 있을 것이다. 그리고 항원이 점막 내에 있는 항원제공세포나 비만세포에 쉽게 도달하여 항체 생산이 증가하고 알레르기 반응이 증강될 수 있을 것으로 생각되고 있다.
   본 연구의 결과를 요약하면 감작되지 않은 마우스에서 난알부민 에어로졸 분무만으로는 알레르기 반응이 유발되지 않았으나, 난알부민 분무 기간 중 반복적으로 0.3 ppm의 오존에 노출하였을 때 혈청 내 총 IgE와 anti-OVA IgE, anti-OVA IgG₁, 그리고 비세정액 내의 IL-4와 IL-5 농도의 유의한 증가를 관찰할 수 있었다. 이러한 반응 정도를 전신감작군과 비교한 결과 총 IgE와 anti-OVA IgE의 농도는 유의한 차이를 보였으나 anti-OVA IgG₁와 IL-4, IL-5의 농도는 차이를 보이지 않았다. 전신감작을 시행한 두 군을 비교하였을 때 오존노출을 시행한 경우에 항체 생산이 약간 증가하는 경향을 보였고 Th2 cytokine의 농도는 유의한 증가를 보였다.
   따라서 감작되지 않은 개체에서 반복적인 오존노출은 Th2 면역반응을 야기하고 알레르기 질환의 유병률을 높일 수 있으며, 이미 감작된 개체에서도 오존은 항원에 대한 알레르기 반응을 증강시켜 알레르기 질환을 악화시킬 것으로 생각한다.

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