교신저자：차흥억, 405-760 인천광역시 남동구 구월동 1198  가천의과대학 길병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   겐타마이신은 아미노글리코사이드계 항생제중의 하나로, 이독성을 갖고 있어 체내로 흡수 후 일정 농도 이상이 되면 내이기관을 파괴하여 기능 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 겐타마이신이 내이 기관에 미치는 이독성에 관한 연구는 그간에 와우와 전정의 유모세포를 중심으로 많이 진행되어 왔고, 이들 연구에서는 아미노글리코사이드계의 항생제가 일차적으로 내이의 감각 세포의 파괴에 영향을 미치는 것을 보여주고 있다.²⁾³⁾⁴⁾ 하지만 이차적으로 이들 연구는 내이의 다른 기관 즉, 내림프를 생성하고 흡수하는 기관인 내림프낭 자체나 세반고리관의 암세포(dark cell)의 기능 억제에도 영향을 미치는 것을 보여주고 있다. 따라서 본 연구에서는 실험 대상으로서, 환경적 요인이 배제된 순수한 내이 기관 실험 모델로서의 의의를 갖는 병아리 배아를 선택하여, 겐타마이신이 내림프낭에 일으키는 형태학적 변화를 관찰하고, 그 농도 증가에 따른 변화의 정도를 살펴보고자 하였다.

재료 및 방법

유정란의 선택 및 인공 부화
   본 연구에서 종란은 유정란(Gallus domesticus, Pulmuone, Korea) 240개(실험군 120개, 대조군 120개)를 사용하였다. 보관은 세포분열을 중단시키기 위해 10℃에서 둔단(알의 완만한 부분)이 위로 오게 하여(공기집이 둔단 쪽에 있으므로) 보관된 것 중 산란 3일 이내의 종란을 부화기로 입란시켜 발아시켰다. 
   부화시 종란의 위치는 둔단이 위로 오도록 하고 온도는 37.5℃, 상대 습도는 60%로 유지하였다. 자동 부화기(Saesil indu-stry, SS-5000, Korea)를 사용하여 1일 4회 이상 전란시켰다.

실험군과 대조군의 구별 
   실험군은 겐타마이신과 테트라사이클린을 모두 주입한 군으로 대조군은 테트라사이클린만을 주입한 군으로 설정하였다. 먼저 실험에 사용될 240개의 종란을 산란시작일 6일째에 꺼내어, 칼슘 이온 침착기관인 이석 기관에 형광 물질로 작용하는 것으로 알려진⁵⁾ 테트라사이클린(Sigma, USA)을 그 종란들의 난황에 각각 2 mg씩 투여하였다. 이중 120개의 종란은 대조군으로 사용하기 위해 다시 부화기에 넣어졌다. 그 다음 나머지 120개의 종란은 실험군으로 사용되었고, 각각 30개의 종란의 난황에 4 mg/egg, 8 mg/egg, 12 mg/egg, 16 mg/egg으로 농도를 증가시키면서 겐타마이신을 주입하였다(Fig. 1).

난황 내 약물 주입
   종란을 보관할 때 둔부(편편한 부분)를 위로 하여 보관하면 난황이 종란의 상부에 위치하게 된다. 이렇게 보관된 종란을 꺼내어 둔부의 첨부를 23 gauge spinal needle의 outer needle로 조심스럽게 구멍을 만들면 하얀 양막이 관찰된다. 이 양막을 spinal needle로 조심스럽게 뚫으면 바로 난황이 보이게 되는데 이를 보면서 23 gauge spinal needle의 inner needle을 이용하여 조심스럽게 난황 내 약물을 주입한다(Fig. 2).

조직의 채취와 조직 슬라이드의 제작 
   자동부화기내의 산란시작일로부터 6일째에서 8일째까지 종란중, 각 실험군과 대조군 별로 배아를 채취하여 25% 파라포름 알데하이드로 고정하고 알콜을 이용한 탈수과정을 거쳐 두부와 꼬리 부분의 장축을 파라핀블럭의 장축과 일치시키고 안면부를 밑으로 하여 파라핀화 하였다. 그 후 마이크로톰을 이용하여 난형낭과 구형낭의 장축과 일치하게 5μm 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켜 탈파라핀화 과정과 염색을 시행했다. 

조직의 슬라이드 절편방향
   병아리 배아의 내이기관을 관찰하는 관점 중에서 내림프낭을 가장 잘 관찰하기 위해 Oblique-Coronal section을 시행하였다.⁶⁾

헤마톡실린-에오신 염색 
   파라핀블럭을 마이크로톰을 이용하여 두께 5 μm로 박절하여 슬라이드(ProbeOnTM Plus Microscope Slides, Fisher Biotech, USA)에 부착시킨 후 크실렌(Duksan, Korea)을 10분씩 2회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 그 다음에 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올(Duksan, Korea)에 각각 5분씩 처리하여 함수 시키고 흐르는 물에서 10분간 세척 한 후 헤마톡실린(Sigma, USA)과 에오신(Sigma-Aldrich, USA)으로 염색하였다. 마지막으로 70%부터 100% 에탄올에 각각 10초씩 처리하여 탈수 시키고 크실렌에서 3분간 투영 과정을 거친 후 Canada balsam(Duksan, Korea)을 이용하여 봉입한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 

현미경과 사진촬영 
   본 연구에서는 조직절편을 광학생물현미경(L1100A, Guangzhou Optical, China)으로 검안하고, 사진촬영은 광학생물현미경에 디지털카메라(Coolpix 4500, Nikon, Japan)를 자체 제작한 어뎁터로 연결하여 접사촬영을 시행하였다.

Data 처리 및 통계적 유의성 검토
   기록된 자료는 SPSS 10.0 for Windows(SPSS Inc. USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 실험 측정치는 paired t-test로 통계학적 분석을 시행하였고 p<0.05를 유의성의 기준으로 삼았으며 결과값은 평균±표준오차(standard error)로 표시하였다.

결     과

겐타마이신을 투여하지 않은 군(대조군)의 내림프낭 모양 
   겐타마이신을 투여하지 않은 군에서는 발생 6일째부터 8일째까지 내림프낭의 크기 증가만 관찰될 뿐 특이한 구조상의 차이점은 발견되지 않았다(Fig. 3). 이석 기관에 형광물질로 작용하여 이석기관 관찰을 용이하게 해줄 목적으로 사용한 테트라사이클린의 효과는 뚜렷이 관찰할 수는 없었다. 겐타마이신이 투여된 군(실험군)과 투여되지 않은 군(대조군)의 직접적인 크기 비교를 하기 위해 측정이 가장 용이한 발생 8일째를 기준으로 내림프낭 내강의 단축의 길이를 측정하였고, 대조군에서 발생 8일째 40개의 배아를 갖고 측정한 내림프낭의 단축의 길이는 0.12±0.014 mm로 측정되었다.

겐타마이신을 투여한 군(실험군)의 내림프낭 모양
   겐타마이신을 투여한 군에서는 그 투여한 겐타마이신의 농도가 증가함에 따라 내림프낭의 비정상적인 모양 변화가 발생 6일에서부터 발생 8일째까지 뚜렷이 관찰되었다. 이런 비정상적인 모양 변화 중 특히 주목할 만한 점은 첫째, 농도가 증가함에 따라 내림프낭 내강의 단축의 길이가 증가하여 상대적으로 장축이 짧아져 그 모양이 전체적으로 원형에 가깝게 되는 현상이 관찰되는 점과, 둘째 내림프낭 내부 상피 세포의 모양 변화가 급격히 진행되었다는 점이다(Fig. 4). 대조군과의 직접적인 크기 비교를 하기 위해 실험군에서도 발생 8일째의 내림프낭 내강의 단축의 길이의 평균값을 측정해 보았다. 그 결과 실험군의 난황에 주입된 겐타마이신의 양이 4 mg/egg(n=10)일때 0.15±0.018 mm를 나타내었고, 8 mg/egg(n=10)일때는 0.21±0.014 mm, 12 mg/egg(n=10)일때는 0.29±0.019 mm, 16 mg/egg(n=10)일때는 0.33±0.019 mm으로 각각 측정되었다. 이는 주입된 겐타마이신의 농도 증가와 내림프낭의 단축의 길이 증가가 서로 양의 상관관계(p<0.05)가 있음을 확인시켜 주었다(Fig. 5). 이를 고배율로 관찰하였을 때는 내림프낭 내부의 상피세포들이 규칙적인 배열에서 벗어나 불규칙한 형상으로 변모하다가 종국에는 내림프낭 내로 탈락되는 소견이 관찰되었다(Fig. 6). 특히, 겐타마이신의 농도가 8 mg/egg만으로도 내림프낭의 모양변화 즉, 단축의 길이가 확장되면서 내부 상피세포들이 규칙성을 잃어버리고 괴멸하는 양상을 보이고 있었다. 

고     찰

   병아리 배아가 내이기관 연구에 사용된 것은 1951년 처음으로 미국의 Hamburger⁷⁾가 병아리 배아의 전 발달 과정을 광학 현미경으로 관찰하여 발표함으로써 그 실체 및 유용성이 알려지게 되었다. 
   최근 들어서는 내이기관의 연구의 실험 모델에 포유류뿐만 아니라 조류가 많이 이용되고 있다.⁸⁾⁹⁾ 조류가 내이기관에 관한 실험 모델로 많이 이용되는 이유는, 인간과 유사한 배아 발생 단계를 가지면서도 수태기간이 짧아 단시간 내에 많은 조직을 채취할 수 있고, 고등 포유류와 유사한 내이구조를 갖는 조건을 만족시키기 때문이다. 이런 취지에서 본 연구에서는 실험 모델로써 병아리 배아를 선택하였다.
   병아리의 이석기관은 발생 4일째부터는 이낭형태로 존재하다가 발생 5일째부터는 조금씩 분화를 시작하여 내림프낭이 관찰되고, 발생 6일째부터는 난형낭과 구형낭이 관찰된다. 병아리의 난형낭과 구형낭은 약간 잘록한 모양으로 연결되어 마치 하나의 구조처럼 보이지만, 실제로는 엄격히 독립적인 구조를 형성하고 있으며 실제 본 실험에서도 발생 6일째부터 일정한 크기와 모양의 난형낭반과 구형낭반을 확인할 수 있었고, 발생 7일째와 8일째에서는 더욱더 명확한 모양을 관찰할 수 있었다. 처음에 슬라이드를 제작할 때는 절편방향에 따라 내이기관의 모양이 변해 정확한 기준을 잡기에 어려움이 있었다. 하지만 여러 절편 방향을 시도해본 결과, oblique coronal section이 가장 적합한 시야를 제공하는 것으로 나타났다. Oblique coronal section방향으로 절편을 얻는다는 것은 후뇌(hindbrain)을 중심으로 안구가 관찰되기 전까지의 슬라이드를 얻는 방법으로, 하나의 슬라이드내에 내이기관의 대부분을 관찰할 수 있는 시야를 확보할 수 있었다. 
   인간의 내림프낭은 그 형태에 있어서 바깥쪽으로 깊은 주름과 소낭선이 이루는 불규칙한 표면을 갖고 있으며, 그 위치에 따라 근위부, 중간부, 원위부의 세부위로 나눌 수 있다.¹⁰⁾ 근위부는 전정도수관 내에 위치하며 내림프관의 세포에 비해 약간 긴 세포들로 구성되어 있다. 중간부 일부는 전정 도수관 내에, 일부는 경막 내에 놓여 있으며, 유두와 소낭선이 불규칙하게 배열한 상피층은 긴 원통형의 세포들로 구성된다. 세포는 흐리게 염색되는 세포와 진하게 염색되는 세포로 구분된다. 원위부는 경막 내에 놓여 있으며 내부 공간은 존재하지 않는다. 상피층에는 입방세포들로 흐리게 염색되는 세포들이 주로 분포한다.¹⁾ 본 연구에서는 병아리의 내림프낭이 인간의 내림프낭과 모양이 유사함을 확인할 수 있었다. 
   내림프액은 와우혈관조의 분비 세포와 전정미로내의 암세포에서 생성되며, 내림프낭에서 흡수되는 것으로 알려져있다.¹¹⁾ 이런 내림프낭의 주요 기능 중의 하나인 내림프의 흡수작용의 장애로 인해 내림프 수종이 발생한다는 이론에 대해 낭주위의 섬유화나 위축 등의 소견, 전정도수관의 형태학적인 형성부전 등이 그 가설로 제시되어 왔다. Kimura¹²⁾¹³⁾에 의한 내림프낭의 폐쇄로 유발한 와우의 내림프 수종의 동물실험 모델연구는 내림프 수종의 기전이 내림프낭의 흡수장애임을 설명하였다. 또 Beck¹⁴⁾은 내림프액 분비세포의 파괴를 목적으로 소량의 스트렙토마이신이나 겐타마이신을 중이강 내로 점적하여 치료 효과를 높이는 방법을 고안하여 청력 및 전정기능의 파괴없이 현기증의 치료에 좋은 결과가 있음을 보고 하기도 하였다.
   아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성은 급성 가역성 독성인 경우 내림프와 외림프에 축적된 고농도의 항생제가 그 독성을 유발시키고, 세포 내 작용기전은 세포막의 칼슘 길항작용에 의하여 유모세포내의 형질도입 채널을 억제시키고 세포막의 지질대사 장애를 초래하여 세포내 신호전달체계에 이상이 생기게 한다. 즉, 이차전달물질 형성과 inositol triphosphate를 방해하여 protein kinase C 활성화에 지장을 초래함으로써 유모세포의 항상성과 기능에 장애를 일으키게 되는 것이다.¹⁵⁾ 
   최근에는 이런 아미노글리코사이드계 항생제의 이독성을 이용하여, 내림프 수종 치료 방법중의 하나인 겐타마이신이 와우의 유모세포나 세반고리관의 암세포등에 미치는 영향에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 반면에, 내림프를 흡수하는 중요한 기능을 갖는 내림프낭 자체에 대한 연구는 많이 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 겐타마이신이 내림프낭 내의 상피세포에 미치는 영향에 그 주안점을 두었다. 그럼으로써 내림프낭의 주요 기능 중의 하나인 내림프액의 흡수 작용과 관련지어서, 태아기때의 병아리 배아처럼 정상 기능을 갖는 내림프낭이 겐타마이신에 노출된다면 그 독성으로 인해 내림프액을 흡수하는 기능을 잃어 버린다는 가설을 유발하는 하나의 계기가 되었다.
   저자는 본 실험에서 이런 가설을 증명해 보기 위해 외부의 영향이 미치지 않은 독립된 개체로서의 병아리 배아를 대상으로 하여 겐타마이신이 내림프낭에 일으키는 형태학적 변화를 관찰하였고, 그 농도 증가에 따른 변화의 정도를 살펴보았다. 겐타마이신의 농도가 증가함에 따라 내림프낭의 비정상적인 크기 증가가 뚜렷이 관찰되고, 특히 내림프낭의 구조 중에서도 내부 상피 세포의 파괴가 특징적으로 관찰되는 모습은 겐타마이신에 많이 노출 될수록 내림프낭도 그 본연의 모습을 잃어버릴 수 있고, 나아가서는 내림프액의 흡수를 저해시켜 내이 수종과 같은 질병의 원인이 될 수도 있음을 생각해 볼 수 있었다. 또한 겐타마이신의 농도가 8 mg/egg 에서부터 유의한 변화를 보이는 모습은 배아들이 겐타마이신에 소량 노출되어도 내림프낭의 구조적 변화를 초래할 수 있다는 것을 보여주고 있는 것이다.

결     론

   난황 내에 주입된 겐타마이신의 농도가 증가될수록 내림프낭의 형태학적 변화가 심화되는 것이 확인되었다. 특히 내림프낭의 구조 중에서도 내부 상피 세포의 파괴가 특징적으로 관찰되었고 이는 내부 상피 세포가 내림프액의 흡수에 큰 역할을 담당하고 있는 것을 고려한다면, 내림프낭의 겐타마이신에 대한 노출은 내림프낭의 기능을 저해시키는 원인으로 작용함을 유추해 볼 수 있겠다.

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