교신저자：신승헌, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   부비동염은 부비동 점막에 발생한 염증으로서 대부분 비강 점막의 염증을 동반하여 비부비동염(rhinosinusitis)이라고 부르기도 한다. 만성 부비동염은 만성 질환 중 가장 흔한 질병의 하나로 새로운 항생제의 개발과 부비동 내시경수술 등 새로운 치료법의 도입에도 불구하고 발생 빈도는 감소되지 않고 있다.¹⁾ 급성 부비동염의 경우 바이러스나 박테리아의 감염이 주요 원인으로 알려져 있고, 치료 또한 증상에 따른 대증요법이나 적절한 항생제의 사용으로 완치를 유도할 수 있으나, 만성 부비동염의 경우는 그 원인이 상기도 감염의 부적절한 치료, 알레르기성 비염과 천식, 저감마글로불린혈증, 원발성 섬모운동이상증 등의 전신 질환과 비중격 만곡증, 비용, 치성 감염 등 국소적 인자가 관여하는 등 다양한 요인이 관여하는 다인성질환으로 병리기전에 대한 논란이 계속되고 있으며 치료 또한 어렵다.²⁾³⁾
   진균성 부비동염은 20세기 중반이후 알려지기 시작하였으며, 1983년 Katzenstein 등⁴⁾이 부비동내 존재하는 Aspergillus가 만성 부비동염을 유발한다는 보고와 함께 알레르기성 진균성 부비동염이란 개념을 소개하였다. 최근 Ponikau 등⁵⁾은 만성 부비동염 환자의 96%, 정상인의 100%에서 비즙내 진균이 존재함을 보고하였고, 두군 모두에서 Alternaria, Aspergillus, Candida, Cladosporium, Penicillium 등이 주된 진균으로 정상인과 만성 부비동염 환자 사이에 진균의 분포와 양성 배양률에는 차이가 없다고 하였다. 모든 사람의 비강에 진균이 존재하지만 만성 부비동염 환자의 경우 정상인의 진균에 대한 면역반응과 다른 특이 반응을 보임으로서 부비동염을 유발할 것이라고 주장하였다.
   만성 부비동염의 발병 기전에 비부비동 점막의 염증반응이 중요한 역할을 담당한다는 사실에 대해서는 큰 이견이 없다. 염증반응은 크게 감염성 염증반응과 비감염성 염증반응으로 나누어 진다. 감염성 염증반응은 바이러스나 세균에 의한 감염으로 급성 부비동염의 주된 원인으로 알려져 있으나 만성 부비동염 환자의 경우에 비즙과 상악동 비즙에서 호중구와 interleukin-8(IL-8)의 증가 소견을 보인다. 이처럼 감염성 염증반응에는 Th1 림프구와 이들 세포에서 생성되는 사이토카인 및 호중구가 중요한 역할을 담당함을 알 수 있다.⁶⁾ 비감염성 염증반응은 부비동 점막의 비후와 비용을 동반하고 호산구와 비만세포의 증가 소견을 보이며 granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF), interleukin-5(IL-5) 등의 증가 소견을 보인다. 즉 비감염성 염증반응은 Th2 림프구와 이들 세포에서 생성되는 사이토카인 및 호산구가 중요한 역할을 담당한다.⁷⁾
   만성 부비동염 특히 비용을 동반한 경우 호산구의 역할이 강조되어 왔으며, 호산구의 병태생리학적 역할에 대한 활발한 연구가 이루어져왔다. 그러나 Park 등⁸⁾은 비용 조직검사에서 37.4%가 림프구와 호중구의 증가 소견을 보이는 염증성비용이었고 48.7%가 호산구가 특이적으로 증가하는 알레르기성 비용으로 만성 부비동염 및 비용의 발병기전에 호중구가 관여할 것으로 생각된다. 이에 저자들은 만성 부비동염의 발생에 영향을 미칠 것으로 생각되는 진균으로 비용 상피세포를 자극하여, 상피세포에서 생성되는 화학매개물질이 호중구의 활성화와 이주에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

비용 상피세포의 분리 및 human nasal polyp epithelial cell conditioned media(HPECM)의 생산
   부비동 내시경 수술을 시행한 환자에서 비용조직을 채취한 후 상피세포를 분리하여 사용하였다. 환자의 선택은 알레르기성 비염이 동반되지 않고, 수술 전 4주 이상 항생제, 항히스타민제, 국소 및 경구용 스테로이드제재 등의 약물 치료를 시행하지 않은 예에서 시행되었다. 비용조직은 penicillin(Pc) 100 UI/ml, streptomycin(SM) 100 μg/ml, amphotericin-B(Amp-B) 2 μg/ml을 포함한 Ham's F-12 배양액(GIBCO, Grand Island, NY, USA)으로 세척 후 dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)로 처리하였으며, 37℃에서 trypsin/EDTA로 10분간 배양하여 상피세포를 박리 하였다.
   박리된 세포들은 10 cm 접시에 1시간 두어 섬유모세포, 근육세포, 혈관 내피세포를 제거하였으며, 이렇게 얻어진 상피세포는 Pc, SM, Amp-B, glutamine 150 μg/ml, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 UI/ml, epithelial growth factor 25 ng/ml, endothelial cell growth supplement 15 μg/ml, triiodothyronin 200 pM, hydrocortisone 100 nM, fetal calf serum 15%을 포함한 Ham's F-12에 넣고, 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 상피세포의 confluent monolayer가 형성되면 배양액을 Aspergillus Versicolor 25 ug/ml, Alternaria Alternata, Bipolaris Sorokiniana 50 μg/ml과 10% fetal bovine serum, gentamicin 50 μg/ml을 포함하는 RPMI 1640(GIBCO, Grand Island, NY, USA)으로 바꾸어 48시간 배양 후 상층액을 얻어 -70℃에 냉동 보관하였다. 대조군은 진균을 포함하지 않는 RPMI 1640으로 48시간 배양하였다.
   HPECM에 포함되어 있는 화학매개물질은 ELISA(R& D system, Minneapolis, MN, USA)법을 이용하여 IL-8, GM-CSF, RANTES을 측정하였으며, 민감도는 5 pg/ml 이었다.

호중구의 분리
   호중구는 정상인의 heparin 처리된 말초 혈액을 PIPES(Sigma, St. Louis, MO, USA) 완충액과 혼합하여 Percoll액 위에 놓고 원심분리하여 과립구와 적혈구 층을 분리하였다. 적혈구는 삼투성 파괴법을 이용하여 제거하였고 과립구에서 호중구를 얻었다. Trypan blue를 이용하여 검사한 호중구의 순수도는 95% 이상이었고, 생존율은 98% 이상임을 확인하였다.

HPECM에 의한 호중구의 활성화와 이주
   분리된 호중구는 50% HPECM을 포함하는 hank's balanced salts solution(HBSS)(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 넣고, 37℃, 5% CO₂에서 4시간동안 배양하면서 superoxide와 myeloperoxidase(MPO)를 측정하여 호중구의 활성화 여부를 결정하였다. 양성 대조군으로 1 ng/ml의 phorbol myristate acetate(PMA)를 이용하였다.
   Superoxide 측정 방법은 cytochrome c의 superoxide dismutase 억제 반응을 이용하였다. 5×10⁵개의 호중구를 100 μM의 cytochrome c를 포함하는 HBSS에 넣고 HPECM과 반응시켰다. 반응 직후부터 microtiter plate reader(Thermomax, Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. MPO는 호중구 배양 4시간 후 얻어진 상층액에서 ELISA(OxisResearch, Portland, OR, USA)법을 이용하여 측정하였으며, 민감도는 1.5 ng/ ml 이었다.
   호중구 이주는 3 μm의 구멍으로 이루어진 막을 가진 24-well Transwell insert system(Corning Coster, Cambridge, MA, USA)을 이용하였다. 분리된 호중구를 upper chamber에 2×10⁵개를 넣고, lower chamber에 Aspergillus 25 μg/ml, Alternaria, Bipolaris 50 μg/ml을 이용하여 만든 HPECM을 넣고, 37℃ 5% CO₂에서 1시간 배양 후 광학 현미경을 이용하여 lower chamber로 이동한 호중구의 수를 측정하였다. 양성 대조군으로 lower chamber에 1 ng/㎖의 phorbol myristate acetate(PMA)을 넣고, 음성 대조군은 배양액인 RPMI 1640을 넣여 호중구 이주를 유도하였다.

호중구 활성화 억제와 이주 억제
   호중구 활성화 억제는 HPECM 50%의 농도에서 anti-human GM-CSF antibody 0.5 μg/ml, anti-human RANTES antibody 0.1 μg/ml, anti-human IL-8 antibody 0.2 ng/ml(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)을 이용하였다. 또 serine protease inhibitor인 p-aminoethyl benzenesulfonyl fluoride(Pefabloc) 25, 100 μg/ml과 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride(Aprotinin) 0.5, 1 μg/ml을 사용하였고, cystein protease inhibitor는 transepoxysuccinyl-L-leucylamide-(4-guanidino) butane(E-64) 1, 5 μg/ml(Roche Diagnostics Co. Indianapolis, IN, USA)을 사용하였다. 각각의 항체와 portease inhibitor를 HPECM이 들어있는 용기에 넣고 실온에서 30분 전처리한 후 호중구를 넣어 활성화를 측정하였다.
   호중구 이주의 억제는 anti-humam IL-8 antibody, anti-human GM-CSF antibody, anti-human RANTES antibody를 이용하여 이주 억제 여부를 측정하였다.
   HPECM은 다른 5명의 만성 부비동염 환자에서 얻었으며, 활성화와 이주에 대한 실험은 4회 반복하여 얻은 결과의 평균으로 하였다.

연구자료 분석
   호중구에 의한 superoxide와 MPO 생성은 Wilcoxon-Sign rank test를 이용하여 활성화 정도를 비교하였고, 호중구의 이주는 Mann-Whitney test를 이용하여 음성 대조 실험과 비교분석 하였으며, 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

진균에 의한 비용 상피세포의 화학매개물질 생산
   진균으로 자극하지 않은 만성 부비동염 환자의 비용 상피세포 배양액에서는 IL-8 31.5±37.6 ng/ml, GM-CSF 533.4±213.8 pg/ml, RANTES 11.1±5.9 pg/ml이 포함되어 있었다. Aspergillus 25 μg/ml, Alternaria 50 μg/ml, Bipolaris 50 μg/ml과 함께 배양된 각각의 상피세포 배양액에서 특히 IL-8의 생성이 통계적으로 유의하게 증가되었다(Table 1).

HPECM에 의한 호중구 활성화 및 활성화 억제
   호중구 활성화는 Aspergillus, Alternaria, Bipolaris로 만들어진 HPECM과 배양하였을 때 시간 경과에 따라 superoxide의 생성이 증가하였다. Alternaria와 Bipolaris에 의한 superoxide production은 4시간 경과 후 Aspergillus에 의한 superoxide 생성보다 유의하게 증가되었다(p<0.05). IL-8, RANTES, GM-CSF 항체로 전처리한 후 superoxide 생성은 억제되지 않았고, serine protease inhibitor (Aprotinine, Pefabloc)와 cysteine protease inhibitor (E-64)로 전 처리 한 경우에도 superoxide 생성에 영향을 미치지 않았다(Fig. 1). 배양 4시간 후 상등액에 포함된 MPO의 농도는 진균으로 자극하지 않은 HPECM과 호중구와의 배양에서는 38.7±10.2 ng/ml였으며 Alternaria, Aspergillus, 및 Bipolaris와 배양된 HPECM과 호중구를 배양한 경우 65.9±15.0 ng/ml, 74.0±7.0 ng/ml, 및 61.9±6.4 ng/ml로 통계적으로 유의하게 높게 나타났다(p<0.05). 이들 MPO 생산 또한 IL-8, RANTES, GM-CSF 항체로 전 처리한 경우나, serine protease inhibitor(Aprotinine, Pefabloc)와 cysteine protease inhibitor(E-64)로 전 처리 한 경우 모두에서 억제되지 않았다(Fig. 2).

HPECM에 의한 호중구의 이주와 이주 억제
   HPECM에 의한 호중구의 이주는 Aspergillus, Alternaria, Bipolaris로 자극된 배양액 모두에 의해 이주가 유도되었으며, 특히 Alternaria, Bipolaris의 경우 진균으로 자극시키지 않은 HPECM으로 이주를 유도한 경우보다 유의하게 많은 호중구의 이주가 관찰되었다. HPECM을 IL-8, GM-CSF, RANTES에 대한 항체로 전처리 후 호중구 이주를 유도한 경우 RANTES와 GM-CSF 항체는 호중구 이주를 억제하지 못하였으나 IL-8 항체는 Alternaria에 의한 호중구의 이주는 60.47%, Aspergillus에 의한 이주는 65.45%, Bipolaris에 의한 이주는 87.20% 억제하였다(Fig. 3).

고     찰

   호흡기 점막은 호흡기내로 들어온 미생물을 제거하기 위한 효율적이고 특이한 기능과 구조를 가지고 있다. 상피세포는 세포간 폐쇄막 등의 물리적 장벽을 형성하여 항원의 이동을 차단하고, 상피세포에서 분비되는 glycoconjugates, 방어 단백물질과 효소들은 미생물을 직접적으로 제거하거나 탐식 작용을 촉진시켜준다. 비강 상피세포는 알레르기 물질에 노출되거나 세균의 침입 등 염증반응이 일어나는 경우 GM-CSF, IL-8, tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등 각종 화학매개물질을 분비하며, 집먼지 진드기와 각종 진균들은 단백질분해효소 등 다양한 항원으로 호흡 상피세포의 활성화를 유도한다. 이때 호흡 상피세포에서 생성된 화학매개물질은 염증세포의 활성화와 이주를 유도하여 상하기도의 방어기전에 관여함과 동시에 염증반응에 중요한 역할을 한다.⁹⁾ 공기 중에 존재하는 진균들이 호흡기로 들어와 병원균으로 작용하기 위해서는 우선 점액섬모운동의 장애로 흡입된 진균의 배출 장애가 생겨 호흡 상피세포와 접촉시간이 길어지는 경우와 두번째로는 침입한 진균의 제거를 위해 비강 상피에서 만들어지는 살진균성 단백물질에 이상이 있는 경우, 세 번째로 진균에 의해 보체 체계와 항원-항체 반응이 억제되고, 탐식 세포에 의한 진균의 탐식작용이 진균에서 분비되는 gliotoxin, hyphal toxin 등에 의해 억제되며, 진균에서 분비되는 단백질분해효소들이 진균의 조직내 침투를 용이하게 하여 여러 가지 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾¹¹⁾ 이처럼 진균의 serine, cysteine, aspartic 등의 단백질분해효소 성분은 호흡기 상피세포의 수용체와 반응하여 상피세포를 활성화시켜 염증세포의 동원과 활성화를 유도하여 염증반응을 유지 및 악화시키는 역할을 담당하고, 상피세포의 탈피를 유도하여 공기 중 존재하는 병원체의 침입을 용이하게 한다.
   Ponikau 등⁵⁾은 만성 부비동염 환자의 96%, 정상인은 100%에서 비즙 진균을 배양하였고, 한국인의 경우는 비즙에서 Cladosporium이 가장 많이 검출되었고 그 외 Alternaria, Fusarium, Penicillium, Aspergillus 등의 순으로 나타났으며, 배양된 진균의 종류는 만성 부비동염과 알레르기성 비염, 정상인 사이에 차이가 없었다.¹²⁾ 이에 본 연구에서는 한국인의 비즙에서 흔히 발견되는 Alternaria, 알레르기성 진균성 부비동염의 흔한 원인으로 알려진 Bipolaris, 호흡기 질환이나 알레르기 염증반응의 주요한 원인 진균인 Aspergillus를 이용하였다. 저자들의 경우 이들 진균들이 비용 상피세포의 활성화를 유도하였으며, 특히 IL-8과 GM-CSF의 생성을 왕성하게 유도하였다. Shin 등¹³⁾은 진균에 의한 비용 상피세포의 활성화 과정에 진균이 가지고있는 단백질분해효소 특히 serine protease가 중요한 역할을 담당한다고 보고하였다.
   호중구는 세균, 진균, 원생동물이 인체내 침입한 경우 일차적 방어기전으로 작용하는 염증세포로 호중구에 의한 염증반응은 몇가지 단계를 거쳐 이루어진다.¹⁴⁾ 우선 혈액 중에 존재하는 호중구가 활성화된 혈관내피세포와 접촉이 이루어지고, 혈관벽을 지나 염증 반응이 있는 곳으로 이주가 이루어져 탐식작용이나 oxygen mediator, microbicidal substance 등의 화학물질을 유리하여 침입한 미생물을 제거하게 된다. 이 과정에서 호중구 세포내 존재하던 단백물질과 단백질 분해효소 등은 호흡 상피세포에서 유리하는 leukoproteinase inhibitor에 의해 비활성화 되지만 염증반응이 진행되거나 병적 상태로 발전되는 경우 호중구에서 만들어진 단백물질들은 미생물을 제거함과 동시에 호흡 상피세포 등의 자가세포를 손상시키는 세포독성을 나타내기도 한다. 호중구의 염증 조직으로 이주에는 수분에서 수시간에 거쳐 이루어지며 이 과정에 여러 가지 화학물질들이 관여한다. 호흡기내 호중구 이주에는 Leukotriene B4가 가장 강력하게 작용하고 그 외에도 CXC chemokine인 IL-8, 사이토카인으로는 GM-CSF, IL-6 등이 관여한다.¹⁵⁾ 이들 화학물질들에 의해 혈관내피세포의 P-selectin이 발현되고 호중구의 P-selectin glycoprotein ligand 1과 반응하여 접촉이 이루어지고, 호중구 세포벽에 β-integrin이 증가되어 intracellular adhesion molecule-1(ICAM-1)과 작용하여 transmigration이 일어나며 탈과립이 일어나게 된다. 또 호중구의 미생물 탐식과정에서의 탈과립은 Gram-negative 미생물의 peptidoglycan 부산물이나, lipopolysacaride와 반응하거나 미생물과 opsonization에 의해 이루어진다. 호중구 활성화 과정에서 생성된 각종 화학물질은 비즙의 생성을 증가시키고, 상피세포의 손상 및 점액섬모운동 장애를 초래하여 호흡기 염증반응을 악화 시키기도 한다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 본 연구에서는 호중구의 활성화와 탈과립반응에 비용 상피세포에서 분비된 IL-8, GM-CSF, RANTES 등의 화학매개물질이나 serine protease 혹은 cysteine protease가 관여하는지 알아보았으나 이들 물질들은 호중구의 활성화에 영향을 미치지 않았다. 그러나 HPECM이 호중구의 superoxide와 MPO 생성을 유도하는 것으로 보아 HPECM에 포함된 즉 진균에 의해 활성화된 비용 상피세포에서 만들어진 다른 화학물질이나 효소 등이 호중구의 활성화에 영향을 미칠 것으로 추측된다.
   IL-8은 T-림프구와 혈관내피세포에서 분비하는 강력한 호중구 화학주성을 가진 CXC계 chemokine이다. 호흡기 염증조직 선관세포와 상피세포에서 분비되는 IL-8은 호중구와 림프구를 조직으로 이동시키고 호중구의 탈과립을 유도하여 염증반응에 관여하며, 많은 양의 IL-8은 호산구의 화학주성에도 관여한다고 알려져 있다.¹⁸⁾ GM-CSF는 T-림프구, 상피세포, 혈관내피세포, 비만세포 등에서 분비되며, IL-3, IL-5와 함께 호산구의 생성, 이주, 수명 연장, 활성화에 관여한다.¹⁹⁾ 또한 GM-CSF는 호중구의 이주에도 관여하는 것으로 알려져 있으나 화학주성 능력의 경우 다른 화학주성물질에 비하여 약하며, platelet activating factor(PAF)와 leukotriene 등에 의한 화학주성능력을 향상시켜준다. 본 연구에서는 진균의 자극을 받은 비용 상피세포가 100~200 ng/ml의 비교적 높은 농도의 IL-8를 생산하였으며, 항 IL-8 항체로 전처리 한 경우 호중구 이주가 강력하게 억제되어 음성 대조군보다도 적은 호중구의 이주가 이루어졌으나 두 군간의 통계학적 의의는 없었다. 그러나 GM-CSF는 호중구의 이주에 영향을 미치지 않아 호중구의 이주에는 IL-8이 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었고 GM-CSF의 경우 호중구 이주에 영향을 미치기 위해서는 더 많은 양의 GM-CSF가 필요하거나 GM-CSF의 기능을 향상시켜주는 보조 인자가 필요하다는 것을 알 수 있었다.
   이상의 결과를 종합해 보면 비용 상피세포는 Alternaria, Aspergillus, Bipolaris 등의 진균에 의해 다량의 화학매개물질을 생산함을 알 수 있었다. 이 과정에서 만들어진 화학매개물질에 의해 호중구의 활성화와 이주가 촉진되었는데, 호중구의 활성화 기전은 본연구에서 확인할 수 없었으나 호중구의 이주에는 IL-8이 중요한 역할을 담당함을 확인할 수 있었다. 즉 부비동염 등 비강 점막의 병적 상태에서는 비강내 존재하는 진균에 의해 상피세포가 활성화되어 화학매개물질들을 생산하고 이결과 염증세포 특히 호중구의 이주와 탈과립이 일어나 비강 점막의 염증반응이 유지 강화됨을 알 수 있었다. 그러나 연구에 사용된 냉동 건조된 진균은 비강에서 직접 배양된 것이 아니어서 생체에 존재하는 진균의 항원 역가와 차이가 있을 수 있고, 생산 과정에 진균의 항원 특성의 소실, 변화가 초래될 수 있는 등의 한계성을 가지고 있다. 향후 본 실험에 사용된 진균의 농도가 인체 비강내 진균의 농도와 연관성이 있는지, 진균이 가지고 있는 여러 가지 항원성 중 어떤 물질이 상피세포의 활성화에 영향을 미치는지 등의 지속적인 연구가 필요할 것이다.

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