교신저자：이철희, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(02) 2072-3646 · 전송：(02) 745-2387 · E-mail：chulhee@snu.ac.kr

서     론

   사회가 점점 산업화가 진행됨에 따라 천식이나 알레르기비염 같은 알레르기 질환의 유병율은 점점 증가하고 더불어 여기에 소용되는 비용도 점점 증가 추세에 있다. 
알레르기비염에 있어 많은 치료법들이 현재까지 개발되었으며 또 현재 연구 중에 있다. 알레르기비염의 치료는 크게 회피요법, 약물치료, 면역치료로 나눌 수 있다. 회피요법은 가장 안전한 치료방법이지만 만족할 만한 결과를 얻기에 역부족이고, 약물요법이 기본적인 치료방법으로 쓰이고 있으며 증상을 조절하는데 도움을 주지만 알레르기비염 자체를 치료하지는 못하며 종종 약물부작용을 초래한다. 최근 판매되고 있는 항히스타민제와 스테로이드 비내 주입이 뛰어난 효과를 보이고 있어 비교적 부작용 없이 알레르기비염을 조절하는 치료법으로 쓰이고 있지만 질병의 면역학적인 기전을 되돌리는 근본치료법이라기 보다는 증상을 완화하는 방법이다. 면역치료는 항원을 피하주사하여 항원에 대한 면역관용(immunologic tolerance)을 유도하는 근본치료법이지만, 수년간의 치료가 필요하고, 비용이 많이 들고, 주사로 주입해야 하며 또 증상개선율이 높지 않으며 심각한 부작용인 아나필락시스(anaphylaxis)를 유발할 수 있다는 단점이 있다. 하지만 약물치료와는 달리 면역치료는 장기간의 관해(cure)를 유지할 수 있어, 면역치료의 부작용을 줄이고 효율을 높이기 위해 많은 연구가 진행되고 있다.
   최근의 연구에 의하면 알레르기 질환은 Th1반응에 비해 Th2반응이 증가함으로써 생기며 면역치료가 Th2반응을 Th1반응으로 유도한다고 한다.¹⁾ 이 사실에 기초하여 면역반응을 Th1반응으로 바꾸는 물질들이 연구되고 있다. 그 중 하나가 면역 강화 DNA 서열(Immunostimulatory sequence, ISS)인 CpG motifs가 포함된 oligodeoxynucleotide(ISS-ODN)이다. ISS-ODN은 강력한 면역유도물질로 Th2반응을 억제하여 Th1반응을 유도하며 여러 동물모델에서 알레르기 과민반응을 줄여준다고 보고되었다.²⁾ ISS-ODN은 현재 알레르기 질환에 있어 새로운 면역치료법의 방법으로 관심을 받고 있으며 많은 연구가 이 분야에서 진행되고 있다.
   ISS-ODN을 항원과 결합(conjugation)시켜 투여하면 ISS-ODN단독 투여보다 더 효과적으로 Th1반응을 유발한다는 것이 보고 되고 있으며,³⁾ 저자들은 알레르기비염 마우스모델에서 ISS-ODN 단독 투여시 알레르기 증상의 호전 및 Th1반응이 유발되는 것을 보고한 바 있다.⁴⁾
   이 연구에서는 우리나라에서 흔한 항원인 집먼지진드기 항원을 마우스에 감작시켜 제작한 알레르기비염 모델을 대상으로 ISS-ODN 또는 ISS-ODN과 집먼지진드기의 conjugate를 주사하여 알레르기 반응의 변화를 관찰하고 보다 효과적인 알레르기 반응 억제 방법을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

Oligonucleotide의 제작
   CpG DNA motif가 포함된 ISS-ODN(immunostimulatory sequences of unmethylated CpG-containing oligodeoxynucleotide)과 mutant ODN(M-ODN)은 Bioneer회사(Daejon, Korea)에서 공급받았다. ISS-ODN의 서열은 5'-GCTAGACGTTAGCGT-3'이고, M-ODN의 서열은 5'TGACTGTGAACCTTAGAGATGA 3'이었다.

ISS-ODN과 Der f 항원의 결합
   ISS-ODN과 Der f는 다음과 같은 방법으로 conjugation하였다. Der f분자를 Succimimidyl 4-(N-maleimidomethyl-cyclohexane-1-carboxylate(Pierce chemicals, Rockford,USA)와 2시간 동안 반응시켜 Der f의 lysine에 maleimido group을 결합한 후 이것을 NAP-25 column (Amersham -Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 통하여 정제하였다. ISS-ODN은 20 μmol/L의 tricarboxyethylphosphine(TCEP)로 반응시켜 thiol기를 부착시킨 후 NAP-10 column으로 정제한 다음 Der f와 ISS-ODN을 함께 상온에서 반응시킨 후 superdex HR 200 Gel filtration chromatography를 통하여 정제하였다.

실험동물과 항원
   실험동물로는 체중 20~30 g의 specific pathogen free 상태의 C57BL/6 수컷 마우스를 사용했다. 항원으로는 집먼지진드기인 Dermatophagoides farinae(Der f)의 lyophilized crude body extract를 사용하였다. 항원은 4℃에서 냉장 보관하고 phosphate-buffered saline(PBS)에 희석하여 사용하였다.

알레르기비염 모델의 제작
   C57BL/6 마우스를 Table 1과 같이 음성대조군, 양성대조군, M-ODN/Der f conjugate치료군, ISS-ODN /Der f conjugate치료군으로 각각 5마리씩 나누어 이전에 본 연구자가 발표한 방법에 따라 음성대조군을 제외한 3개의 그룹에 알레르기 항원을 투여하여 감작시켰다.⁵⁾ 간략히 소개하면 C57BL/6 마우스에 Der f 100 μg을 녹인 PBS 100μl에 동량의 Complete Freund's Adjuvant 섞은 혼합액 200 μl를 tail base에 피하주사하여 항원에 전신감작 시켰다. 또한 실험시작 24시간 후와 72시간 후에 pertussis toxin 300 ng을 복강 내 주사하였다. 7일 후에 동량의 진드기 항원을 Incomplete Freund's Adjuvant에 녹여 혼합액을 피하주사하였다. 전신감작을 시킨 후 5주일간 1주일마다 한번씩 micropipette을 이용하여 20 μg의 Der f를 20 μl의 PBS에 녹인 용액을 마우스의 양측비강에 10 μl 씩 비내 점적(intranasal instillation)하여 비내 국소감작을 유도하였다. 음성대조군에서는 PBS를 복강 내 주사하였고, PBS를 마우스의 양측비강에 5회 점적하였다.

ISS-ODN conjugate의 예방적 투여
   비내 점적을 하기 24시간 전인 13일, 27일, 41일 째 양성대조군과 음성대조군에는 PBS 100 μl를 피하주사하였고, M-ODN/Der f conjugate군에는 50 μg의 mutant ODN과 Der f 항원의 conjugate를 ISS-ODN/Der f conjugate군에는 50 μg의 ISS-ODN과 Der f항원의 conjugate를 투여하였다.

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   마지막 비내 점적 1주일 후 모든 실험군에 20 μg의 Der f 용액 20μl를 micropipette을 이용하여 비내 점적한 후 15분간 나타나는 코비빔 동작과 재채기 횟수를 합하여 기록하였다.

비점막 조직 소견의 비교
   항원 주입 후 24시간 후에 마우스를 희생시켜 비중격 점막을 채취하여 Luna 염색을 시행하여 200배 광학 현미경(Laborlux K, Leica, Stgallen. Swiss) 하에서 비중격 전장의 점막하층을 관찰하여 조직 내 호산구 침윤정도를 측정하였다. 실험조건을 모르는 한 명의 관찰자가 모든 슬라이드를 측정하였다.

비강세척액에서의 IL-5, Interferon(IFN)-gamma 측정
   기관을 부분 절개한 다음 22G 카테터를 이용하여 비강 세척을 실시하였다. 카테터는 기관절개부에서 비인두방향으로 삽입한 다음 생리식염수를 주입하여 콧구멍으로 흘러나오는 용액을 체취하였다. 비강세척액을 원심분리하여 상층액을 이용하여 IL-5과 IFN-gamma의 농도를 ELISA kit(R & D systems, USA)를 이용하여 측정하였다.

특이 IgE 농도
   혈액은 복부의 간문맥에서 채취하였고 특이 IgE농도는 ELISA방법을 이용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면 microtiter plate(NUNC Immunoplate Maxisorp F96, Basel, Switzerland)의 각 well에 carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.6)에 희석한 5μg/ml의 Der f 추출물을 4℃에서 24시간 동안 넣어 plate에 코팅하였다. 매 단계로 넘어갈 때마다 washing buffer로 washing을 시행하였고, washing buffer로는 PBS-tw(0.025% Tween 20 in PBS)를 이용하였다. 코팅되지 않은 부분의 차단을 위해 PBS에 녹인 5% skim milk(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 상온에서 1시간 동안 각 well에 넣어두었다. Washing buffer로 10배 희석한 혈청을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 1：1000으로 희석한 HRP conjugated rat anti-mouse IgE(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, USA)를 1시간 반응시켰다. Oorthophenyldiamine(OPD) substrate를 이용해 상온에서 30분간 발색시킨 후 optical density를 490 nm에서 측정하였다.

통계분석 
   통계분석은 Mann-Whitney U test를 이용하여 평균치분석을 시행하였고, p 값이 0.05이하인 경우를 통계적으로 의미 있게 보았다.

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교(Fig. 2)
   알레르기 양성 대조군에서는 증상점수가 평균 79.0±18.1(Mean±SD)으로 음성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. ISS-ODN/Der f conjugate군의 증상점수는 37.0±14.4로 양성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). M-ODN/Der f conjugate군의 증상점수는 65.0±14.1로 양성대조군보다 약간 감소하였지만 통계적으로 유의한 차이는 없었다.

비점막내 호산구의 침윤 정도의 비교(Fig. 3)
   호산구의 수는 양성대조군의 경우 92.4±18.9개로 음성대조군의 1.4±1.67개에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. ISS-ODN/Der f conjugate군은 21.8±8.4로 양성대조군에 비해 의미있게 감소되었다(p<0.05). M-ODN/Der f conjugate군의 호산구 수는 70.8±18.2로 양성대조군에 비해 감소되었지만 통계적으로 유의하지는 않았다.

비강세척액에서의 IL-5, IFN gamma 농도(Figs. 4 and 5)
   비강세척액에서 양성대조군의 IL-5 농도는 52.1±18.2 pg/ml 이었고, 음성대조군의 IL-5농도는 13.4±3.2 pg/ml로 통계적으로 유의한 차이가 있었다. ISS-ODN/Der f conjugate군의 IL-5 농도는 13.4±3.1 pg/ml로 양성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다. M-ODN /Der f conjugate 군의 IL-5농도는 44.1±18.6 pg/ml로 양성대조군과 비교했을 때 통계적인 차이가 없었다(p>0.05). 
   비강세척액에서 양성대조군의 IFN gamma 농도는 131.6 ±69.1 pg/ml이었고, ISS/Der f conjugate군의 농도는 각각 429.0±188.9 pg/ml로 양성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. M-ODN/Der f conjugate군에서는 양성대조군과 비교했을 때 통계적인 차이가 없었다(p>0.05). 하지만 음성대조군과 양성대조군의 IFN-gamma 농도는 두군간에 통계적인 차이가 없었다.

특이 IgE 농도(Fig. 6)
   집먼지진드기 특이 IgE농도는 양성대조군이 0.27±0.52로 다른 군에 비해 높았지만 다른 군과 비교했을 때 통계적인 의의가 없었다. 

고     찰

   CpG motif라고도 알려져 있는 ISS-ODN은 메틸화되지 않은 CpG dinucleotide의 일종으로, BCG가 종양억제효과가 있다는 것이 밝혀지면서 연구가 시작되었다.⁶⁾ 초기에는 BCG가 면역계를 자극하면서 종양억제효과가 생기는 것이라고 생각했지만 나중에 마이코박테리움의 DNA가 종양을 억제한다는 것이 밝혀졌고, 이 DNA를 면역자극물질이라고 명명하였다.⁷⁾ 다른 그룹의 학자들은 일부 oligodeoxynucleotide(ODN)이 B 림프구를 증식시킨다는 것을 알아냈고, 이 ODN이 메틸화 되지 않은 cytosine과 guanosine의 dinucleotide(CG)를 중심으로 3' 말단에 1개의 퓨린기가, 5' 말단에 2개의 피리미딘기가 있는 구조를 가지고 있다고 하였다.⁸⁾ 이 ODN은 후에 BCG에 있는 면역자극물질과 같은 것으로 밝혀졌고, 척추동물보다 박테리아에 20배 이상 많다고 한다. 중심에 있는 CG 구조를 GC로 바꾸거나 메틸화를 시키면 면역자극효과가 완전히 없어지며, 박테리아, 바이러스, 무척추 진핵세포동물에 많고, 척추동물의 게놈에는 30%이하로 존재한다.⁹⁾ 박테리아에 이런 CG dinucleotide가 많기 때문에 박테리아가 포유류의 면역계로 들어오면 숙주의 면역계를 자극하여 숙주가 쉽게 박테리아와 숙주의 DNA를 구분할 수 있다.
   1980년대에 들어 BCG나 플라스미드의 DNA가 Th1반응을 유발한다는 것이 밝혀지기 시작하였고, 1990년대 중반에 메틸화 되지 않은 CpG motif가 면역반응에 중요한 역할을 한다는 것이 알려졌다. 이 무렵 동물을 이용한 실험이 시작되었는데, 대부분 동물 실험이 천식모델에서 ragweed extract,¹⁰⁾ Amb a 1(ragweed 항원의 일종),¹¹⁾ Bet v 1,¹²⁾ schistosoma egg antigen,¹³⁾ OVA,¹⁴⁾ conalbumin¹⁵⁾ 등의 항원을 이용한 실험이었고, 집먼지진드기를 항원으로 이용한 알레르기비염 모델에서의 연구는 드물다. DNA 백신의 경우 집먼지진드기 Der p1 또는 Der f11을 encoding하는 유전자를 이용한 유전자이전(DNA transfer)이 Th1반응을 유도한다는 보고가 있고, 또 in vitro에서 ISS가 Der f 항원에 의해 감작된 세포에서 Th1반응을 유도한다고 보고되었다.¹⁶⁾ 최근 OVA에 의한 알레르기비염 모델에서 ISS-ODN의 효과를 보고한 발표가 있지만¹⁷⁾ 집먼지진드기를 이용한 비염 모델에서의 ISS-ODN의 효과를 연구한 논문은 드물다.
   본 연구에서 저자들은 ISS-ODN/Der f conjugate가 유발하는 면역자극 효과를 평가하였으며, 다른 많은 연구에서 항원과 ISS를 conjugation시켰을 때 면역능력이 증가됨을 보였다.³⁾ 이러한 상승작용은 다음과 같은 기전으로 설명할 수 있다. 항원이 항원제시세포(antigen presenting cell)에 의해 흡수되어, 가공된 후 Th0 세포에게 제시될 때, ISS-ODN은 항원제시세포에서 IL-12 분비를 자극하여 T 세포가 Th1 세포로 유도되게 한다. 만약 항원과 ISS의 con-jugate가 투여되면 항원제시세포가 항원을 흡수할 때 동시에 ISS가 항원제시세포를 자극하게 되어, IL-12 분비가 증가하게 되며, 이 때 일어나는 반응들이 동일한 항원제시세포에 의해 생기게 되어 ISS가 마치 항원에 특이적인 반응을 일으키는 것처럼 행동하게 되기 때문이다.¹⁸⁾ 항원과 ISS가 conjugate가 아니고 혼합물로 동시에 투여되면 항원제시세포가 항원과 ISS를 동시에 습득하는 확률이 떨어지게 되어 면역자극능력이 ISS/항원 conjugate가 투여됐을 때보다 감소할 수도 있다. 이 실험에서도 ISS-ODN/Der f conjugate를 투여했을 때 증상점수나 호산구 침윤정도에서 우수한 효과가 나타남을 알 수 있었다. 상기 결과만으로는 ISS-ODN의 단톡투여와 비교할 수는 없지만 앞서 이야기한 여러 실험에서 보듯이 ISS와 항원의 conjugate투여에서 더 뛰어난 결과가 나올 것이라고 예측할 수 있다.
   ISS-ODN/Der f conjugate를 투여했을 때 Th2 사이토카인인 IL-5의 농도는 감소하였고, Th1 사이토카인인 IFN gamma는 증가하였는데, ISS conjugate가 면역반응을 Th2반응보다는 Th1반응으로 전환한다는 것으로 유추할 수 있다.
   집먼지 진드기에 대한 특이 IgE는 양성대조군에서 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다. 다른 군에서는 특이 IgE 농도가 양성대조군에 비해 낮게 나왔는데 이는 통계적인 유의성이 없고 M-ODN/Der f conjugate를 사용한 군에서도 비슷한 수준으로 나온 것은 설명하기가 어렵다. 
   현재 ISS-ODN과 항원의 conjugate를 이용한 임상실험이 많이 진행되고 있고 결과도 발표되고 있다. Simmons 등¹⁹⁾은 ragweed항원인 Amb a1과 ISS의 conjugate를 6회 연속 투여하여 Th1반응의 증가와 Th2반응의 감소를 16주 이상 볼 수 있었다고 하였고, Tulic 등²⁰⁾은 Amb a1과 ISS의 conjugate를 6회 연속 투여하여 다음 꽃가루 날리는 시기에 흉통과 비증상이 감소하는 경향을 보였으며 이 연구에서 ISS/allergen conjugate의 장기효과를 어느 정도 입증할 수 있었다.
   앞으로도 효과와 부작용 측면에서 더 많은 연구가 필요하지만, ISS-ODN을 항원과 conjugation시키면 면역능력이 증가하고 또 항원사용량을 줄일 수 있어 아나필락시스 등의 부작용이 생길 가능성을 줄일 수도 있다는 점이 ISS-ODN과 항원의 conjugate가 현재의 단백질을 이용한 면역치료보다 더 효과적이고 안전한 치료방법이 될 수 있다는 가능성을 갖게 한다. 현재의 면역치료법도 장점을 가지고 있지만 아나필락시스라는 치명적 부작용의 가능성이 있고, 70%정도의 환자에서만 효과가 있고, 장기치료 효과가 명확하지 않으며 다른 치료약제의 발달로 널리 쓰이지 못하고 있다. 
   만약 항원과 ISS-ODN의 conjugate가 아나필락시스를 유발하지 않는다고 밝혀지고 효과가 입증된다면 미래에 유망한 면역치료요법제로 쓰일 수 있을 것이다.

결     론

   본 연구에서는 Der f 항원으로 감작시킨 마우스에서 Der f 비내 투여 전에 ISS-ODN/Der f conjugate를 피하주사함으로써 집먼지 진드기 알레르기비염의 증상과 호산구 침윤이 완화되었으며, IL-5는 감소하고 IFN-gamma는 증가하였고, 이로부터 ISS-ODN/Der f conjugate가 면역반응을 Th2반응에서 Th1반응으로 전환함을 확인할 수 있었다.

1. Jutel M, Pichler WJ, Skrebic D, Urwyler A, Dahinden C, Muller UR. Bee venom immunotherapy results in decrease of IL-4and IL-5 and increase of IFN-gamma secretion in specific allergen-stimulated T cell cultures. J Immunol 1995;154:4187-94.

2. Bauer M, Heeg K, Wagner H, Lipford GB. DNA activates human immune cells through a CpG sequence-dependent manner. Immunology 1999;97:699-705.

3. Tighe H, Takabayashi K, Schwartz D. Coupling CpG motif immunostimulatory DNA to ragweed allergen Amb a 1 induces a Th1 response to allergen. J Allergy CLin Immunol 1999;103:S48.

4. Yun JB, Kim JW, Lee CH. Inhibition of allergic response by CpG motif immunostimulatory oligodeoxynucleotide in a murine model of allergic rhinitis. Korean J Otolaryngol 2002;45:462-6.

5. Yun JB, Lee CH, Kwon TY, Park SW. House dust mite allergic rhinitis model in C57BL/6 Mice. Korean J Otolayrngol 2000;43:276-81.

6. Tokunaga T, Yamamoto T, Yamamoto S. How BCG led to the discovery of immunostimulatory DNA. Jpn J Infect Dis 1999;52:1-11.

7. Yamamoto S, Yamamoto T, Shimada S, Kuramoto E, Yano O, Kataoka T, et al. DNA from bacteria, but not from vertebrates, induces interferons, activates natural killer cells and inhibits tumor growth. Microbiol Immunol 1992;36:983-97.

8. Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 1995;374:546-9.

9. Bird AP. DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Res 1980;8:1499-504.

10. Sur S, Wild JS, Choudhury BK, Sur N, Alam R, Klinman DM. Long term prevention of allergic lung inflammation in a mouse model of asthma by CpG oligodeoxynucleotides. J Immunol 1999;162:6284-93.

11. Santeliz JV, Van Nest G, Traquina P, Larsen E, Wills-Karp M. Amb a 1-linked CpG oligodeoxynucleotides reverse established airway hyperresponsiveness in a murine model of asthma. J Allergy Clin Immunol 2002;109:455-62.

12. Jahn-Schmid B, Wiedermann U, Bohle B, Repa A, Kraft D, Ebner C. Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs modulate the allergic TH2 response of BALB/c mice to Bet v 1, the major birch pollen allergen. J Allergy Clin Immunol 1999;104:1015-23.

13. Kline JN, Krieg AM, Waldschmidt TJ, Ballas ZK, Jain V, Businga TR. CpG oligodeoxynucleotides do not require TH1 cytokines to prevent eosinophilic airway inflammation in a murine model of asthma. J Allergy Clin Immunol 1999;104:1258-64.

14. Broide DH, Stachnick G, Castaneda D, Nayar J, Miller M, Cho JY, et al. Systemic administration of immunostimulatory DNA sequences mediates reversible inhibition of Th2 responses in a mouse model of asthma. J Clin Immunol 2001;21:175-82.

15. Serebrisky D, Teper AA, Huang CK, Lee SY, Zhang TF, Schofield BH, et al. CpG oligodeoxynucleotides can reverse Th2-associated allergic airway responses and alter the B7.1/B7.2 expression in a murine model of asthma. J Immunol 2000;165:5906-12.

16. Zhou C, Yao MP, Wen TM, Sun CR. Effect of immunostimulatory DNA sequence on the production of Th1 and Th2 cytokines induced by Dermatophagoides farinae allergen in vitro Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi 2001;19:65-7.

17. Hussain I, Jain VV, Kitagaki K, Businga TR, O'Shaughnessy P, Kline JN. Modulation of murine allergic rhinosinusitis by CpG oligodeoxynucleotides. Laryngoscope 2002;112:1819-26.

18. Shirota H, Sano K, Kikuchi T, Tamura G, Shirato K. Regulation of murine airway eosinophilia and Th2 cells by antigen-conjugated CpG oligodeoxynucleotides as a novel antigen-specific immunomodulator. J Immunol 2000;164:5575-82.

19. Simons FE, Shikishima Y, Van Nest G, Eiden JJ, HayGlass KT. Selective immune redirection in humans with ragweed allergy by injecting Amb a 1 linked to immunostimulatory DNA. J Allergy Clin Imunol 2004;113:1144-51.

20. Tulic MK, Fiset PO, Christodoulopoulos P, Vaillancourt P, Desrosiers M, Lavigne F, et al. Amb a 1-immunostimulatory oligodeoxynucleotide conjugate immunotherapy decreases the nasal inflammatory response. J Allergy Clin Immunol 2004;113:235-41.