교신저자：차창일, 130-702 서울 동대문구 회기동 1  경희대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   진주종성 중이염은 중이와 중이강 주위 조직의 골흡수 및 골파괴를 야기하여 난청, 전정기능 장애, 안면신경마비 및 치명적인 두개내 합병증까지 발생할 수 있다. 이러한 진주종성 중이염의 골파괴 기전에 대해 활발한 연구가 진행되어 왔으나 아직까지 확실하게 규명되지는 않고 있으며 지금까지는 압력에 의한 괴사, 각종 분해효소에 의한 골흡수, 여러 cytokine의 활성에 의한 골흡수 등이 작용할 것으로 생각하고 있다.¹⁾²⁾³⁾ 최근에는 여러 cytokines들에 의한 파골세포의 활성화가 진주종에서 골흡수를 일으키는 주요한 기전으로 생각되며 특히 Chole는 파골세포가 중이 진주종에 의한 국소적인 골 흡수기전에서 중심적인 역할을 한다고 보고하며 진주종에 의한 골파괴에서 파골세포의 형성과 활성화(activation), 화학주성(chemotxis), 동원(recruitment) 등의 기전을 규명하는 것의 중요성을 강조한 바 있다.⁴⁾ 파골세포는 단핵구와 대식세포주에서 분화하여 골주변에서 나타나는 대식세포로 국소적인 골흡수에 관여하나 파골세포의 분화 및 활성화 기전에 대해서는 명확히 규명되지 않고 있다.
   최근 골 대사 분야에서는 Receptor Activator of NF-κB Ligand(RANKL) 및 Osteoprotegerin(OPG)이 골개형과정(bone remodelling process)을 조절하는 중요한 물질로 제시된 후 이에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. RANKL는 세포막에 위치한 Tumor necrosis factor(TNF)상과의 하나로 파골세포의 전구체에 존재하는 Receptor Activatior of NF-κB(RANK)에 결합하여 파골세포의 형성 및 활성을 증가 시킨다. 이러한 RANKL의 골 흡수활성은 OPG에 의해 조절되는데 이는 용해 가능한 TNF 수용체과의 하나로 RANKL와 결합하여 RANKL-RANK간의 상호작용을 방해하는 유인수용체(decoy receptor)의 역할을 하므로 파골세포의 형성이 억제 된다.⁴⁾⁵⁾
   특히 최근에는 파골세포의 형성 및 생존, 골 흡수 기능은 RANKL 및 OPG의 절대량의 증감 보다는 RANKL과 OPG의 비율에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다.^5)6)7)8)9)
   따라서 본 연구에서는 실시간 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR)법을 이용하여 진주종에서 RANKL mRNA, OPG mRNA의 발현을 알아보고 정량 분석을 통하여 절대량 및 비율을 골 파괴 정도와 비교해 진주종의 골 파괴에서 RANKL의 정량과 RANKL과 OPG비율의 의미에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험군으로 2002년 11월부터 2003년 1월까지 본원에서 진주종성 중이염으로 수술 받은 환자 13예(13귀)로부터 수술시 채취한 진주종 조직을 사용하였고 대조군으로 8예의 정상 외이도 피부조직을 사용하였다. 실험에 이용된 진주종 조직은 모두 수술시 이루 등의 활동적인 염증반응은 없었다. 13예의 채취한 조직편은 채취 후 즉시 액화질소로 냉동하였으며 멸균된 eppendorf tube에 넣은 후 실험시까지 영하 70℃에 보관하였다. 

방  법

Total RNA의 추출
   채취한 조직에 Trizol 500.0 μl를 첨가한 후 syringe를 이용하여 세포를 균질화 시키고 15~30℃에서 5분간 방치한 후 chloroform 100.0 μl를 첨가하여 부드럽게 inverted mix하여 잘 섞이게 하였다. 4℃에서 12000 g으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 채취하였다. 채취한 상층액을 새 tube에 옮기고 동량의 isopropanol과 혼합하여 실온에서 10분간 침전시킨 후 12000 g으로 10분간 원심분리 하여 RNA pellet을 얻었다. 여기에 75% ethanol 500.0 μl를 넣어 7500 g으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 상온에서 방치하여 RNA pellet을 완전히 건조시킨 후 DECP(Diethylpyrocarbonate) 용액으로 RNA pellet을 녹였다. 녹인 RNA는 분광광도계인 DU 530(Beckman instrument, CA, USA)를 이용하여 260 nm에서 순도 및 정량을 하였다. 

cDNA의 합성
   추출한 RNA를 대상으로 first standard cDNA synthesis kit(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사중합효소반응(RT-PCR)의 조건은 10×buffer 2.0 μl, 25 mM MgCl 4.0 μl, dNTP 2.0 μl, oligo-dT primer 2.0 μl, RNasin 1.0 μl, AMV reverse transcriptase 0.8 μl의 혼합액에 RNA 1.0 μg을 넣은 후 멸균증류수를 첨가하여 총 20 μl가 되게 하였다. 이상을 Thermal Cycler(9700, Biosystem, USA)로 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

정량적 중합효소연쇄반응 
   합성된 cDNA를 대상으로 Light Cycler System(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)을 이용하여 FastStart PCR(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)시약으로 정량적 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 10×buffer 2.0 μl, 2.5 mM dNTP 1.6 μl, primer(10 pmol/μl) 1.0 μl, amplitaq 0.4 μl, DNA double-strand specific SYBR Green I dye가 포함된 혼합액에 cDNA 1.0 μg을 넣은 후 멸균증류수를 첨가하여 총 20 μl가 되게 하여 증폭하였다.
   증폭과정은 RANKL의 경우 95℃ 15초, 53℃ 5초, 72℃ 12초 OPG의 경우는 95℃ 15초, 55℃ 5초, 72℃ 15초였고 대조유전자(internal control)로 사용한 β-actin의 경우는 95℃ 15초, 63℃ 5초, 72℃ 12초였으며 각각 증폭과정을 40회 시행하였고 중합반응시 형광신호를 컴퓨터를 통해 측정하였다.
   사용한 primer의 염기서열 및 증폭산물의 크기는 Table 1과 같다.
   유전자의 발현정도는 중합효소 연쇄반응 주기 40회를 cut-off로 하여 측정하였고 최종 PCR산물은 전기영동을 시행하여 결과를 확인하였다. 

중합효소 연쇄반응의 상대적 정량화
   증폭된 중합효소연쇄반응산물의 정량화를 위하여 분광광도계를 이용하여 농도를 측정한 β-actin을 함께 증폭하여 threshold cycle 수를 얻었고 이를 기준으로 표준검량선을 작성한 후 이 검량선의 수식에 의하여 각 산물을 상대적으로 정량화 하였다. 즉 증폭되는 DNA의 양이 많을수록 형광이 처음 검출되는 연쇄반응 주기의 시점이 빨라진다는 것을 이용하여 threshold cycle의 수를 구한 후 RANKL과 OPG의 농도를 정량된 β-actin의 농도로 나누어 RANKL과 OPG의 농도를 구하였다.

골파괴 정도의 임상분석
   진주종에 의한 골 파괴 정도를 보기위해 환자의 수술기록을 후향적으로 조사하여 Kambhampati가 사용했던 분류¹⁰⁾와 동일하게 수술 소견에서 1개의 이소골의 파괴를 보이는 환자군과 2개 이상의 이소골 파괴 및 안면신경관 및 횡정맥판, 외이도후벽 파괴 등을 포함하는 광범위한 골 파괴군으로 분류하여 RANKL mRNA와 OPG mRNA의 농도 및 비율을 비교, 분석하였고 이를 유병기간과도 비교하였다. 

통계 및 분석
   진주종조직과 정상 외이도 피부조직에서의 RANKL mRNA와 OPG mRNA의 농도의 차이를 비교하였고 아울러 RANKL mRNA와 OPG mRNA의 농도의 비율을 비교하였다.
   또한 진주종 환자군에서 골 파괴 정도에 따른 차이를 비교하였으며 Mann-Whitney's U법을 이용하여 통계처리 하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   13예의 진주종조직과 8예의 정상외이도 피부조직에서 Real time RT-PCR법을 이용하여 RANKL mRNA와 OPG mRNA 발현을 측정한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
   1) 진주종 조직 13예와 정상외이도 피부조직 8예 모두에서 RANKL mRNA와 OPG mRNA가 발현되었다(Fig. 1).
   2) RANKL mRNA 농도는 진주종 조직에서 1.777±0.520 pg/ml, 정상외이도 피부조직에서는 0.141±0.121 pg/ml로 진주종 조직에서 유의하게 증가되어 발현되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 2).
   3) OPG m-RNA 농도는 진주종 조직에서 0.264±0.121 pg/ml, 정상외이도 피부조직에서 0.652±0.621 pg/ml로 진주종 조직에서 감소된 양상을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(Table 2, Fig. 2).
   4) OPG mRNA에 대한 RANKL mRNA의 비율은 진주종 조직에서 평균 785.92±767.79배, 외이도 피부조직에서 125.63±124.91배로 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05).
   5) 골 파괴 정도에 따른 RANKL mRNA의 발현은 광범위한 골 파괴를 동반한 군(6예)은 2.168±0.909 pg/ml, 1개 이하의 이소골 파괴를 보이는 군(7예)은 1.443±0.606 pg/ml로 광범위한 골 파괴를 동반한 경우에 증가된 소견을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다.
   OPG에 대한 RANKL의 농도비율은 광범위한 골 파괴를 보이는 군 6예에서는 1703.33±1659.38배, 1개 이하의 골 파괴를 보이는 군 7예에서는 8.00±1.36배로, 광범위한 골 파괴를 보이는 군에서 통계적으로 유의하게 높았다(Table 3).
   RANKL mRNA농도와 OPG에 대한 RANKL의 농도비율과 유병기간과는 연관성이 없었다.

고     찰

   중이 진주종은 임상적으로 골 흡수를 일으켜 중이강의 해부학적 구조물을 파괴하여 다양한 임상증상 및 합병증을 일으킨다. 진주종의 골 파괴 기전에 대해서는 최근 다양한 방법으로 활발한 연구가 진행되고 있으나 아직 확실하게 규명되지는 않았다. 그러나 논란의 여지는 있으나 최근에는 여러 cytokine들의 상호작용에 의한 파골세포의 활성화가 골흡수를 일으키는 주요한 원인일 것으로 생각되고 있다.^1)2)3)4)
   파골세포는 단핵구와 대식세포주에서 분화되는 다핵형세포로 골흡수에 결정적인 역할을 하는 것으로 보고되고 있으며⁴⁾ 파골세포에 의한 골흡수에서 주요한 두가지 기전은 파골세포의 동원과 성숙된 파골세포의 활성화이다. 따라서 이 두가지 기전에 대해 많은 연구가 이루어졌으며 파골세포의 형성 및 활성에는 M-CSF 및 활성물질이 필요한 것으로 생각되어져 왔다.⁴⁾⁶⁾ 최근 이러한 활성물질은 RANKL로 규명되었고 이것은 ODF(osteoclastic differentiation factor), TNF-related activation-induced cytokine(TRANCE)로도 불리워진다.
   RANKL은 세포막에 위치하는 TNF상과의 하나로 파골세포의 전구체에 존재하는 RANK에 결합하여 파골세포의 형성 및 활성을 증가 시킨다.⁶⁾
   RANKL외에는 파골세포의 배양을 가능하게 하는 물질은 아직 발견되지 않은 상태이며 RANKL 투여시 파골세포에 의한 골 흡수능이 증가한다는 Fuller 등의 보고¹¹⁾와 parathyroid hormon(PTH), parathyroid hormone related protein(PTHrp), 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃(1α,25-(OH)₂ D3), IL-1, IL-6, TNF, Prostaglandin 등에 의한 골흡수가 OPG나 anti-ODF antibody에 의해 완전히 차단되는 점¹²⁾으로 미루어 RANKL는 파골세포의 형성 및 활성화 전과정에 관여하는 결정적인 요소라고 할 수 있다. PTH, PTHrp, 1α,25-(OH)₂D₃, IL-1, IL-6, TNF, Prosataglandin 등 기존의 파골세포의 형성을 촉진한다고 알려진 대부분의 인자들은 파골세포 전구체 자체의 수용체 보다는 기질세포 및 조골세포의 수용체에 결합한 후에 RANKL의 발현을 증가시켜 파골세포의 형성에 기여한다고 알려지고 있다.¹³⁾ RANKL에 의한 신호 전달체계는 세포내 NF-κB연관 신호전달체계에 의해 파골세포의 전구체의 활성을 촉진하게 되는데 활성화된 NF-κB는 염증성 cytokine의 합성 및 분비를 촉진하고 또한 골수대식세포가 파골세포로의 분화를 촉진하고 성숙된 파골세포를 활성화 시키게 된다.⁶⁾ 이러한 경로로 최근에는 악성종양의 과칼슘혈증을 유발한 생쥐모델에서 OPG를 투여하여 골흡수 증가를 억제시켜 혈중 칼슘 치가 정상으로 회복됨을 관찰하여 OPG 투여에 따른 파골세포의 활성의 감소를 이용한 OPG의 치료제 개발 가능성을 제시한 보고가 있다.¹⁴⁾
   그러나 골 파괴를 동반한 모든 질환에서 RANKL이 발현되는 것은 아니다. 전이된 유방암조직이나 전이된 흑색종 등의 경우는 RANKL의 발현이 관찰되지 않아 일부질환에서는 상이한 cytokine들이 역할을 할 것으로 생각된다는 결과를 보고한 경우도 있다.¹⁵⁾
   본 연구에서는 13예의 진주종 조직 모두에서 RANKL mRNA와 OPG mRNA의 발현이 관찰되어 진주종에서 RANKL과 OPG의 되먹임체계가 존재함을 확인하였고 골 파괴시에 RANKL이 중요한 역할을 함을 제시하는 결과를 얻었다. 
   하지만 RANKL이 존재한다고 해서 또는 절대량이 많다고 해서 골 파괴가 이루어지는 것은 아니다. 정상적인 피부와 간, 심장 등의 장기와 골조직 등 골 파괴와 관계없는 많은 조직에서 RANKL이 존재하고 있음이 확인되었고 이 경우 RANKL은 세포생존에 관여하여 세포고사와 관계있는 것으로 생각되고 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 본연구의 결과에서도 정상외이도 피부조직 8예 전부에서 RANKL mRNA의 발현을 관찰할 수 있었다.
   RANKL에는 두 개의 수용체가 있는데 하나는 RANK와 결합하여 전술한 NF-κB체계를 활성화 시키고 나머지 한 개는 OPG와 결합할 수 있다. OPG는 Osteoclastogenesis inhibitory factor(OCIF)로도 불리워지며 용해 가능한 TNF 수용체과의 하나로 RANKL과 경쟁적으로 결합하여 간질세포에서 생성되는 RANKL의 신호를 중화시키거나 억제하여 파골세포의 형성과 활성화를 억제하는 유인수용체로 알려져 있다.¹⁶⁾ 따라서 RANKL에 의한 골 파괴 기전은 파골세포의 형성을 억제하는 것으로 밝혀진 OPG에 의해 역으로 조절된다. 
   따라서 최근 많은 연구에서 RANKL과 OPG의 균형 즉 RANKL과 OPG간의 비율이 파골세포 형성능 및 파골세포에 의한 골흡수 정도를 결정하는 가장 중요한 요소라고 보고 되고 있다.^5)6)7)8)9) 
   최근 Hamzei 등은 중이진주종에서 면역조직화학염색을 통해 RANKL이 좀더 강하게 염색되고 OPG가 약하게 염색되는 결과와 RT-PCR에서는 RANKL과 OPG mRNA가 둘다 과발현되는 양상을 보고하였다.¹⁸⁾ 그러나 그결과는 정량 분석이 되지 않아 최근 중요시되는 RANKL과 OPG mRNA을 논하기에는 부족하다고 생각된다. 본 연구에서는 진주종의 골파괴정도에 따른 RANKL과 OPG mRNA의 양 및 RANKL과 OPG mRNA 의 비율을 분석해 보았다 진주종의 유병기간에 따른 골파괴 정도에서는 연관성을 발견하지 못했고 아울러 RANKL과 OPG mRNA의 양 및 RANKL과 OPG mRNA의 비율에서도 유병기간에 따른 차이는 없었다. 본 연구의 결과에서는 진주종에서 RANKL mRNA는 과발현 되었으나 OPG mRNA의 발현은 외이도 피부조직에 비해 감소되는 양상을 보여 Hamzei 등의 RT-PCR 결과와는 다른 양상이었고 실험군이 13예로 개체수가 적어 단언키는 어려우나 골 파괴정도에 따른 비교에서 진주종 내에서 2개 이상의 이소골 파괴를 보이는 군에서 1개 이하의 골 파괴를 보이는 군보다 RANKL mRNA의 양의 비교에서는 통계학적인 차이를 관찰하지 못했으나 RANKL과 OPG의 비율은 골 파괴정도에 따라 통계학적으로 의의있는 차이를 보여 중이진주종의 골 파괴정도와 RANKL과 OPG의 비율이 좀 더 예민한 상관관계가 있을 수 있음을 시사하는 결과를 얻어 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   중이진주종에서 골 파괴의 기전에 RANKL 및 OPG의 경로가 존재함을 확인하였고 진주종조직에서 정상외이도 피부보다 RANKL의 양이 증가됨을 확인하여 진주종의 골파괴 기전에서 RANKL이 관여할 것으로 사료되며. 아울러 RANKL의 양증가보다 OPG와의 비율의 균형이 골파괴 정도를 결정하는 지수로써 보다 연관성이 클 것으로 사료되는 결과를 얻어 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.

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