교신저자：전은주, 402-720 인천광역시 부평구 부평동 665  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용은 이비인후과에서 흔히 볼 수 있는 질환이지만 아직 그 병인과 치료법이 확실히 정립되지 않아 이비인후과 의사에게 주어진 난제중의 하나이다. 호산구의 침윤은 비용의 특징적인 조직학적 소견으로서 비용에는 호산구의 침윤, 활성화를 야기하는 여러 가지 사이토카인들이 증가되어 있다. 또한 호산구는 다양한 염증 매개인자들을 분비하여 비용의 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.¹⁾
   Protease-activated receptor(PAR)는 새로운 G-protein-coupled, seven transmembrane domain receptor로서 외부의 단백분해효소를 세포가 감지할 수 있도록 하는 역할을 한다. 호흡기에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PAR-2는 trypsin이나 비만세포 tryptase에 의해 활성화되며 기관지점막 상피세포, 기관지의 평활근세포와 섬유아세포, 혈관의 평활근세포와 내피세포 등과 비만세포, 호중구, 호산구 등의 염증세포에 발현되는 것으로 알려져 있으나²⁾ 비점막이나 비용에서는 그 분포가 별로 알려진 바가 없다. 호흡기에서 PAR-2의 역할은 아직 확실히 밝혀진 바가 없으나 염증세포의 침윤을 억제하고³⁾ 기도 과민성을 저하시켜 항상성 유지기능을 수행한다⁴⁾는 설과 염증세포를 활성화하고,⁵⁾ 기도 과민성과⁶⁾ 혈관투과성을 증가시켜⁷⁾ 염증반응을 항진시킨다는 설이 동시에 대두되고 있다. 최근 PAR-2의 활성화는 호흡상피세포에서 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) 생산을 증가시키고 호산구를 활성화시켜 탈과립화를 촉진한다고 보고되었다.⁸⁾⁹⁾
   이에 저자들은 비용과 하비갑개 조직에서 면역조직화학적 염색법으로 PAR-2의 분포를 관찰하고 호산구 침윤과의 상관관계를 봄으로써 PAR-2가 비용형성에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   만성 부비동염 및 비용으로 진단받고 부비동 내시경수술을 시행받은 20명의 환자에서 채취한 비용조직을 이용하였다. 환자의 평균연령은 49세였으며 남녀가 각각 10명이었다. 이 중 11명은 병력, 이학적 검사, 피부단자검사, multiple allergen stimulation test(MAST) 검사를 통하여 진단된 알레르기비염을 동반한 환자였으며 나머지 9명은 알레르기비염의 증거가 없는 환자였다. 비용을 얻기 전 최소 4주간 항히스타민제, 국소 또는 경구용 스테로이드 제재의 사용을 피하였다. 대조군으로 비중격 만곡증으로 비중격성형술을 시행받은 12명에서 하비갑개 점막조직을 채취하여 이용하였다. 대조군의 평균나이는 30세였으며 남자는 11명, 여자는 1명이었다.

점막하 고유층의 호산구의 관찰
   비용과 하비갑개 조직은 채취한 즉시 10% 중성 포르말린에 24시간 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μm 두께의 절편을 제작하였다. Hematoxylin-eosin 염색을 시행한 후 400배 시야에서 무작위로 10곳의 점막하 고유층 부위를 선택한 후 호산구 수를 세어 평균을 구하였다. 점막하 고유층은 상피층 아래로 결합조직, 염증세포, 혈관 및 점막하 분비선을 포함하는 곳으로 정의하였다.

PAR-2에 대한 면역조직화학 염색
   파라핀 포매 조직을 자일렌으로 탈파라핀화시킨 후 함수화하였고, 내재성 peroxidase를 억제하기 위하여 3% 과산화수소로 3분간 반응시켰다. 비특이적 반응을 억제하기 위하여 normal blocking serum을 20분간 반응시켰다. 항원-항체 반응을 위하여 PAR-2에 대한 염소 다클론성 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 1：200 농도로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 2차항체는 biotin이 부착된 항염소 면역글로블린(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)을 사용하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 발색제로는 diaminobenzidine(Vector Labo-ratories, Berlingame, CA)를 사용하였으며 대조 염색으로 Mayer's hematoxylin(Sigma Chemical Company, St Louis, MO)을 사용하였다. 음성 대조군은 1차항체 대신 인산완충용액을 사용하여 같은 방법으로 시행한 후 관찰하였다.

PAR-2에 대한 면역염색의 분석
   비용과 하비갑개에서 PAR-2의 분포를 관찰하였다. 면역염색의 강도는 Oh 등¹⁰⁾의 방법에 따라 반정량적인 방법으로 측정하였는데 상피세포, 혈관내피세포, 선세포, 염증세포에서 면역반응의 강도에 따라 면역염색이 되지 않은 경우 0점, 약하게 염색된 경우, 중등도로 염색된 경우, 강하게 염색된 경우를 1, 2, 3점으로 분류하였다. 상피세포, 혈관내피세포, 선세포, 염증세포에서 비용군과 하비갑개군간에 염색 강도의 차이가 있는지 비교하였다. 호산구의 침윤이 PAR-2 발현과 관계가 있는지 보기 위하여 Furukawa 등¹¹⁾의 방법을 변형하여 비용군을 호산구의 침윤이 경한 군과 호산구의 침윤이 심한 군으로 나누어 PAR-2 발현을 비교하였다. 400배 확대된 시야당 호산구 평균 개수가 20개 미만인 경우를 경한 호산구 침윤군, 20개 이상인 경우를 심한 호산구 침윤군으로 정의하였다. 또한 비용군에서 알레르기비염 유무에 따라 PAR-2 발현에 차이가 있는지 각 조직부위별로 면역염색의 강도를 비교하였다.

통계학적 분석
   모든 통계처리는 SPSS version 11(SPSS Inc. Chicago, IL)을 이용하였다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney U test를 이용하였으며 통계학적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다.

결     과

비용과 하비갑개 점막에서 호산구의 침윤
   400배 시야에서 비용의 점막하 고유층의 호산구 수는 22.0±20.9개(평균±표준편차), 하비갑개의 점막하 고유층의 호산구 수는 2.7±2.5개로 통계학적으로 유의한 차이를 보였다.

비용과 하비갑개 점막에서 PAR-2의 면역조직화학적 분포
   PAR-2의 분포는 비용군과 하비갑개군에서 비슷하였다. 상피세포에서 중등도로 염색되었으며 주로 세포 첨부에 강하게 염색되었으나 손상된 상피층에서는 기저세포에도 강하게 염색된 경우가 있었다. 혈관내피세포와 혈관근세포, 섬유모세포에서 약하게 염색되었으며 선세포에는 전혀 염색되지 않는 부분과 약하게 염색되는 부분이 혼재되어 있었다(Fig. 1). 염증세포의 일부에서 면역염색이 되었는데 면역염색 양성 염증세포의 세포형을 모두 판단하기는 어려웠으나 연속된 절편의 HE염색과 비교하여 볼 때 호산구는 잘 염색되는 반면 림프구는 거의 염색되지 않았다(Fig. 2).

비용과 하비갑개 점막에서 PAR-2 발현의 비교
   염증세포에서의 면역염색 강도는 비용군에서 2.45±0.76 (평균±표준편차), 하비갑개군에서 0.91±0.28이었으며 통계학적으로 의미있는 차이가 있었다. 상피세포, 혈관내피세포, 선세포에서의 면역염색 강도는 두 군간에 차이가 없었다(Table 1, Fig. 3).

호산구 침윤과 PAR-2 발현의 관계
   비용군중 경한 호산구 침윤군은 12명, 심한 호산구 침윤군은 8명이었다. 염증세포에서의 면역염색 강도는 심한 호산구 침윤군에서 2.88±0.35, 경한 호산구 침윤군에서 2.17±0.83으로 통계학적으로 유의한 차이를 보였다. 상피세포, 혈관내피세포, 선세포에서의 면역염색 강도는 두 군간에 차이가 없었다(Table 2).

알레르기비염과 PAR-2 발현의 관계
   비용군중 각 조직별로 알레르기비염이 있는 환자의 비용군과 알레르기질환이 없는 환자의 비용군을 비교한 결과 두 군간에 PAR-2의 면역염색강도는 차이가 없었다(Table 3).

고     찰

   PAR-2는 사람의 비점막과 비용점막에서 상피세포와 혈관내피세포, 혈관근세포, 섬유아세포, 선세포, 염증세포에서 발현되었다. Cocks 등³⁾과 Schmidline 등¹²⁾은 사람과 생쥐의 폐조직에서 PAR-2에 대한 면역염색을 시행하여 상피세포와 평활근세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 혈관근세포에서 PAR-2의 발현을 확인하였다. 지금까지 사람과 동물의 폐와 기관지에서 PAR-2의 분포에 대하여 연구가 진행되어 왔으나 비점막에서의 PAR-2의 분포는 잘 알려지지 않았다. 본 연구에서 비점막에서의 PAR-2는 상피세포와 혈관내피세포, 혈관근세포, 섬유아세포, 선세포, 염증세포에서 발현되어 기관지나 폐조직의 분포와 유사하였다.
   Lan 등¹³⁾은 influenza virus에 감염된 생쥐의 기관지 상피세포에서 PAR-2의 발현이 증가되었다고 보고하여 호흡기의 염증반응과 상피세포의 PAR-2 증가가 관련이 있다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 비용과 하비갑개의 상피층간에 PAR-2 발현의 차이가 관찰되지 않았다. 저자들은 이러한 차이를 두가지 측면에서 설명하고자 한다. 첫 번째로 비점막과 기관지점막은 서로 다른 조직 특이성을 가질 수 있어 비점막 상피세포의 PAR-2는 Cocks 등²⁾의 주장대로 염증항진기능보다는 염증반응을 억제하고 인체의 항상성을 유지하는 기능을 주로 수행하는 것으로 생각해 볼 수 있다. 두 번째로 비용 염증의 만성적 성격을 들 수 있는데 비용의 염증은 virus 감염에 비해 장기간에 걸쳐 진행되는 만성적인 염증이다. PAR-2는 활성화 후 나타나는 불응기가 매우 짧고 세포 내 재생산과 세포막으로의 이동이 신속히 일어나는 물질이므로¹⁴⁾ 만성 염증조직에서는 단백질 수준에서 변화를 보이지 않을 수 있다. 물론 본 연구는 면역조직화학적 방법으로 PAR-2의 발현양상을 본 것이므로 정확한 기전을 규명하기 위해서는 상피세포에서 PAR-2의 RNA 수준에서의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   저자들은 본 연구에서 하비갑개 점막과 비점막 염증반응의 최종산물로 여겨지는 비용점막에서 PAR-2의 발현양상을 비교하여 비점막 염증반응에서 PAR-2의 역할을 알아보고자 하였다. 상피세포, 혈관내피세포, 선세포에서는 두 군간에 PAR-2의 발현에 차이가 없었으나 염증세포에서는 비용군에서 PAR-2가 더 강하게 발현되었다. 현재로서는 비용의 염증세포에서 PAR-2의 발현증가가 어떠한 생리적 의의를 가지고 있는지 확신할 수는 없으나 비용 염증세포에서 PAR-2 활성인자에 대한 감수성이 증가된 것을 반영하는 것으로 보인다. 즉 상피세포보다는 염증세포에서의 PAR-2 감수성의 증가가 비용의 염증반응 항진에 중요한 역할을 한다고 사료된다.
   PAR-2가 알레르기 염증반응에 관여하는지에 대한 연구가 최근 발표된 바 있다. Schmidlin 등¹²⁾은 동물 allergy model을 이용하여 PAR-2 과발현 생쥐에서 호산구의 침착과 기도과민성이 정상 생쥐보다 증가됨을 증명하여 PAR-2가 기도의 알레르기 염증반응의 발생에 관여함을 주장하였다. 반면 본 연구에서는 비용에서 알레르기비염의 유무에 따른 PAR-2 발현에 차이가 없었다. 본 실험의 결과를 볼 때 알레르기비염은 비용의 PAR-2 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다. 그러나 본 연구는 알레르기비염과 병인론적 관계가 명확하지 않은 비용에 국한된 것이며 지금까지 알레르기와 PAR-2의 관계는 거의 연구된 바가 없어 이 관계를 규명하기 위해서는 더 많은 실험적 또는 임상적 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   호산구의 조직 내 침윤은 비용의 가장 두드러진 조직학적 특징이다. 비용에는 interleukin-1β, TNF-α, GM-CSF, vascular cell adhesion molecule-1, intercellular adhesion molecule-1 등의 사이토카인들이 증가되어 있으며 이들은 호산구의 이동과 생존, 침윤에 중요한 역할을 한다. 침윤된 호산구는 major basic protein, eosinophilic cationic protein, eosinophilic peroxidase 등의 염증매개인자들을 분비하여 비용의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 최근 호산구와 PAR-2의 관계를 연구한 보고들이 있었다. Vergnolle⁷⁾은 혈관내피세포의 PAR-2가 백혈구의 혈관벽 접착과 유출을 증가시킨다고 하였으며 Lindner 등¹⁶⁾은 이러한 PAR-2에 의한 백혈구의 혈관벽 접착은 P-selectin에 의하여 매개된다고 주장하였다. 또한 Vliagoftis 등⁸⁾은 기도 상피세포를 PAR-2 agonist로 자극하여 GM-CSF와 eotaxin의 생산이 증가됨을 확인하였고 Miike 등⁹⁾은 trypsin이 PAR-2를 통하여 호산구를 활성화시켜 superoxide anion 생산과 탈과립화를 야기한다고 하였다. 이러한 연구결과들을 종합해 보면 PAR-2는 호산구의 조직내 침윤과 활성화, 생존 연장에 중요한 역할을 한다고 유추해 볼 수 있다. 본 연구에서는 호산구의 침윤이 심한 비용에서 염증세포의 PAR-2 발현이 강하게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 볼 때 PAR-2는 비용의 미세조직환경 속에서 염증세포 특히 호산구에서 autocrine 또는 paracrine mechanism을 통하여 염증반응을 항진시켜 비용형성에 기여한다고 생각된다.

결     론

   비점막에서 PAR-2는 상피세포와 혈관내피세포, 혈관근세포, 섬유아세포, 선세포, 염증세포에서 발현된다. PAR-2는 비용의 염증세포에서 강하게 발현되며 호산구의 침윤과 연관이 있어 비용의 형성에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 향후 비점막에 발현된 PAR-2의 기능을 규명하기 위한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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