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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 48(4); 2005 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2005;48(4): 443-448.
Evaluation of the Bilirubin Ototoxicity using ABR and DPOAE in Jaundiced Gunn Rats.
Hee Yeon Shim, Ji Hwan Woo, Young Ju Sung, Sang Min Lee, In Young Kim, Yang Sun Cho, Won Ho Chung, Sung Hwa Hong
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Sungkyunkwan University School of Medicine, Samsung Medical Center, Seoul, Korea. shhong@smc.samsung.co.kr
2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea.
Gunn Rat에서 청성뇌간반응과 변조이음향방사를 이용한 빌리루빈의 이독성 평가
심희연2 · 우지환2 · 성영주1 · 이상민2 · 김인영2 · 조양선1 · 정원호1 · 홍성화1
성균관대학교 의과대학 이비인후과학교실1;한양대학교 의과대학 의공학교실2;
주제어: 변조이음향방사청성뇌간반응빌리루빈 이독성Gunn rat.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
In neonatal hyperbilirubinemia, accumulation of unconjugated bilirubin in the central auditory pathway and basal ganglia may cause sensorineural hearing loss and neurologic sequelae. The effect of unconjugated bilirubin on the brain is known well through auditory brainstem responses (ABRs). However, there is no evidence of pathologic changes in the cochlea. Jaundiced (jj) Gunn rats have been used as a good animal model for hyperbilirubinemia-related auditory dysfunction. The purpose of this study is to evaluate the bilirubin ototoxicity using ABR and DPOAE in jaundiced Gunn rats before and after sulfadimethoxine injection.
MATERIALS AND METHOD:
Experiments were conducted on three homozygous (jj) P19 (postnatal 19 days) littermates, one heterozygous Gunn rat, five P21 jj littermates, and one nj Gunn rat littermate. P21 jj and nj Gunn rats were re-tested in three weeks in the same condition. ABR with 100-microsecond pulse width click and DPOAEs at 8 kHz, 16 kHz and 22 kHz were measured before and after 1 mg/kg sulfadimethoxine injection.
RESULTS:
The thresholds of ABR were elevated in P19 and P21 group within the first day after injection and became normalized at several days after injection. Delay of wave II, III, IV and V were also observed. DPOAE showed no significant change after injection in all groups, meaning that the cochlea was not damaged.
CONCLUSION:
This study shows that bilirubin ototoxicity is related with pathologic changes at or higher than the brainstem level with intact cochlear function. Changes in ABR findings were only observed in P19 and P21 groups because they had higher bilirubin level in blood and their central auditory pathway is more immature than that found in the P42 group. In this study, we also found the possibility of spontaneous recovery from hyperbilirubinemia-related auditory toxicity.
Keywords: Gunn RatsHyperbilirubinemiaAuditory brainstem responseSpontaneous otoacoustic emission

교신저자:홍성화, 135-710 서울 강남구 일원동 50  성균관대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화:(02) 3410-3577, 3579 · 전송:(02) 3410-3879 · E-mail:shhong@smc.samsung.co.kr

서     론


  
신생아 황달에서 비포합빌리루빈(unconjugated bilirubin)이 혈액-뇌장벽을 통과한 후 청성회로와 기저핵에 축적되면 감각성 난청과 신경성 후유증이 발생되며 다른 신경학적 증상 없이도 청성회로의 이상만을 초래할 수 있다. 최근에 청신경병증(auditory neuropathy)을 가진 소아의 50%에서 고빌리루빈혈증과 연관되어 있다고 보고되었다.1) 빌리루빈의 영향으로 인한 와우의 변화는 확실하게 밝혀지지는 않았으나, 중추청성회로 중 와우핵이 비포합빌리루빈으로 인한 청성회로의 이상을 초래하는 주된 병변 부위로 알려져 있다.1)
   인간에서 빌리루빈의 독성에 대한 연구는 저산소증, 허혈 등의 다른 원인 인자가 영향을 미칠 수 있다는 점에서 어려움이 많지만, 선천적으로 간의 이 인산 유리딘 글루쿠론산 전이효소(uridine diphosphate glucuronyl transferase)가 결핍되어 있는 동종접합(이하 jj) Gunn 랫드를 이용하면 빌리루빈의 독성만을 평가하는데 매우 용이하다.2) Gunn 랫드는 상염색체 열성유전 양식을 따르며 이종접합(이하 nj) Gunn 랫드는 정상의 약 50%의 효소활성을 가지고 있으나 표현형은 정상이다. jj Gunn 랫드에서는 효소활성을 가지고 있지 않으며 황달과 보행실조를 보이는 등 전형적인 핵황달의 징후를 볼 수 있다. 특히 sulfadimethoxine(이하 SDM)과 같은 지속 술폰아미드를 jj Gunn 랫드 복강내 주입하는 경우 알부민에 대해 빌리루빈과 술폰아미드가 경쟁적으로 결합하여 비포합빌리루빈의 혈중 농도가 증가하게되고, 증가된 비포합빌리루빈은 혈액-뇌장벽을 통과하여 뇌간의 여러 곳에 침투하여 뇌병변을 발생시킴으로써 인간의 핵황달과 유사한 신경병리학적인 병변을 만들 수 있다.3) Shapiro 등은 jj Gunn 랫드에 술폰아미드를 주사한 후 정상적인 달팽이음전기반응(cochlear microphonics)과 제 1 파형을 제외한 나머지 파형의 잠복기 연장과 같은 청성뇌간반응(Auditory Brainstem Response, 이하 ABR)의 이상 소견을 이용하여 뇌간 또는 그 상부 조직에 일어나는 병변이 주요 기전이라고 설명하였다.4)
   본 연구는 기존의 연구에서와 같이 jj Gunn 랫드에 SDM을 주입하여 급성 고빌리루빈혈증을 유발한 후, ABR을 측정함으로써 청성회로의 상태를 평가하고, 변조이음향반사(distortion product otoacoustic emission, 이하 DPOAE)를 이용하여 와우의 변화를 알아보고자 하였다. 청각기능을 판별하는 방법 중 한가지인 DPOAE는 와우의 변화를 민감하게 측정할 수 있는 방법으로서 코르티 기관의 외유모세포(outer hair cells)의 이상 유무를 판단하는데에 널리 사용되고 있다.5)6)

재료 및 방법

   생후 19일(P19)된 jj Gunn 랫드 3마리와 1마리의 nj Gunn 랫드, 생후 21일(P21)된 5마리의 jj Gunn 랫드와 1마리의 이종접합 Gunn 랫드를 대상으로 ABR과 DPOAE를 측정하였다. P19 랫드로부터 1 mg/kg의 SDM 주사 후 첫 4시간에 처음 측정하여 4시간마다 각각 측정하여, 12시간 이내의 반응을 측정하였고 P21 랫드는 주사 후 1일, 2일째의 반응을 측정하여 nj Gunn 랫드에서 나온 결과와 비교하였다. 또한, 혈중 빌리루빈 농도가 저하되고 혈액-뇌장벽과 청성회로가 더 성숙된 상태에서의 빌리루빈 이독성을 파악하기 위하여 P21에 사용한 실험동물을 3주 후에 동일한 조건에서 실험을 다시 하여 주사 전, 주사 후 1일, 2일에 ABR과 DPOAE를 측정하여 P19와 P21랫드의 측정결과와 비교하였다. 마취는 ketamine(0.4 mg/kg), xylazine(0.11 mg/kg), 생리식염수(0.49 mg/kg)의 비율로 혼합한 후, 0.002 mg/kg의 양을 복강내로 주사하였다. 
   본 연구에서는 TDT(Tucker Davis Technologies, FL, USA)사의 Neurophysiology workstation과 Windows 기반의 개인용 컴퓨터로 ABR과 DPOAE를 측정하였고, 실험은 25 dB SPL 이하의 음향 방지된 공간에서 진행하였다. ABR 측정에 있어서 바늘전극을 두정부(vertex)에 활성 전극(active electrode)으로, 양측 귀에 각각 기준 전극(reference electrode)과 접지 전극(ground electrode)으로 위치하여 측정하였다. 소리 자극은 50 kHz의 범위를 가지는 튜브형 스피커를 이용하여 검사측 귀에 전달하였다. ABR의 음향 자극은 모든 주파수 영역 에너지를 가지는 100 μs의 자극폭을 가진 희박 클릭을 11.1 Hz의 빈도로 자극하였다. ABR에서 자극 빈도가 20 Hz 이내로서 자극 간격이 충분히 길 경우에는 신경의 회복기가 충분하여 파형의 변화가 미세하나, 자극 빈도가 80
~90 Hz 정도로 자극이 빠를 경우에는 반응의 진폭이 줄어들고, 잡음이 많아진다. 본 연구에서는 자극의 빈도를 11.1 Hz로 사용하여 청신경의 재분극에 필요한 충분한 시간을 주었다. 클릭음의 자극 강도는 80 dB SPL부터 20 dB SPL까지 10 dB SPL 간격으로 순차적으로 감소시키며 자극을 주었다. 자극 후 10 ms동안 신호를 측정하고, 측정된 신호는 60 Hz 노치 필터와 300~3,000 Hz의 밴드패스 필터를 사용하여 디지털 처리 작업을 거친 후 500회의 평균값을 구하였으며, 2회 반복하여 신호의 유사 반복성으로 역치값을 판단하였다.
   DPOAE는 삽입형 스피커를 검사측 귀의 외이도에 위치시켜 측정하였다. 자극음은 주파수 f1, f2(f2>f1)의 두 순음을 동시에 검사측 귀에 주었다. 두 주파수의 기하평균에 해당하는 주파수가(√(f1×f2)) 8 kHz, 16 kHz, 22 kHz로 되도록 f1과 f2를 계산하였으며 f1과 f2의 비율(f2/f1)은 1.20로 유지하였다. 따라서 각각 8kHz의 검사에 f=7272 Hz, f2= 8728 Hz, 16 kHz의 검사에 f1=14544 Hz, f2=17456 Hz, 22 kHz의 검사에 f1=19998 Hz, f2=24002 Hz의 주파수를 사용하였다. f1과 f2의 강도(L1, L2)는 동일한 값을 이용하였으며 90 dB SPL부터 40 dB SPL까지 10 dB SPL의 간격으로 자극을 주었다. 각 반응은 150회 평균하여 구하였다. 평균 소음수준은 2f1-f2의 주파수(DPOAE)에서 양쪽으로 각각 80개의 frequency bin에 해당하는 반응의 평균값으로 구했다. DPOAE는 위에서 구해진 평균 소음수준 보다 1.5 dB 이상의 값을 가지는 반응에 대해 이음향방사가 있다고 판단하였다. 

결     과

   P19 jj Gunn 랫드에 SDM을 주사하고 4시간이 지나고 나서부터 4시간 간격으로 ABR을 측정한 바 첫 4시간부터 청력 역치의 상승을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). P21 jj Gunn 랫드에 SDM 주사한 후 1일 뒤에 ABR을 측정하였을 때 2 마리는 최대 자극 강도인 80 dB SPL에서도 반응을 측정할 수 없었으며 나머지 3마리는 80 dB SPL, 60 dB SPL, 50 dB SPL의 역치를 보였다. 통계 처리를 위해 80 dB SPL에서도 반응을 하지 않은 역치를 90 dB SPL로 환산하였을 때 통계적인 의미가 있는 정도의 역치 상승이 나타났다. 그러나, SDM을 주사하고 2일이 지난 경우 3마리에서 역치의 감소가 나타났고, 나머지 2마리에서는 지속적인 청력 상승을 관찰하였다(Fig. 2). 특히 1일이 지나서 청력이 측정이 불가능할 정도로 손상을 받은 경우에서도 청력 회복이 가능함을 확인할 수 있었다. 또한 wave Ⅰ-Ⅲ와 Ⅲ-Ⅴ, Ⅰ-Ⅴ의 interwave intervals은 주입 후 1일 뒤에 증가하기 시작하여, 주입 후 2일째에는 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3). P21 nj Gunn 랫드에서는 청력 역치의 변화를 관찰할 수 없었다. 반면 P42 jj Gunn 랫드에서는 SDM의 주입 전-후 역치 차이가 없었다(Fig. 4). DPOAE는 P21 jj 및 nj Gunn 랫드에서 측정이 가능하였다. Fig. 5는 P21 nj Gunn 랫드에서 L1=L2=70 dB SPL의 자극 강도로 8 kHz에서의(f1=7272 Hz, f2=8728 Hz) DPOAE 파형을 보여주고 있으며 자극이 증가함에 따라 정상적인 반응 증가 소견을 보였다. 특히 jj Gunn 랫드에 SDM 주사한 후에도 8 kHz, 16 kHz, 22 kHz에서 뚜렷한 DPOAE가 관찰되었으며 자극의 강도가 증가됨에 따라 DPOAE의 반응도 증가되어 와우의 기능이 정상적임을 확인할 수 있었다(Fig. 6). P42의 jj Gunn 랫드에서도 개체마다 차이는 있으나 비슷한 양상을 보였다(Fig. 7). 
   ABR과 DPOAE의 결과를 종합하면 P19와 P21 jj Gunn 랫드의 경우 ABR의 역치는 증가하지만 DPOAE는 정상적인 소견을 보였으며 혈액뇌장벽이 성숙되고 혈중 빌리루빈치가 상대적으로 낮은 P42 jj Gunn 랫드에서는 ABR의 역치값 변화가 없었으며 DPOAE도 정상적이었다. 

고     찰

   고빌리루빈혈증에 의한 핵황달은 운동조절에 관여하는 중추신경계와 청성회로에 병변을 일으킨다. 일반적으로 청성회로에서 병변이 오는 부위는 뇌간의 와우핵이지만 상올리브복합체, 외측융대, 하구에도 영향이 있는것으로 알려져 있다.7) 말초 청신경이나 와우에 미치는 영향은 아직 확실하지 않으나 핵황달이 있는 신생아에서 고주파 난청과 누가현상(recruitment)을 보고한 연구 등4)에 의하면 와우 변성의 가능성은 여전히 제기되고 있다. 그러나, 인간을 대상으로 한 연구의 단점은 인간에서는 저산소증, 다른 이독성 약물 등의 요소가 병존해 있어 빌리루빈 독성 자체의 영향을 평가하기는 어렵다는 점이다. 이러한 면에서 고빌리루빈혈증을 유도할 수 있는 Gunn 랫드는 빌리루빈에 의한 이독성 연구에 매우 적절한 동물 모델이라고 할 수 있다. Gunn 랫드는 빌리루빈의 신경계 독성을 연구하는데 많이 사용되는 동물로 생후 17일에 처음으로 이상이 나타나며 성숙할 때까지 이러한 이상이 지속될 수 있으며 빌리루빈의 누가적인(cumulative) 영향은 뚜렷하지 않다고 하였다.8) 다른 연구들에서도 본 연구에서와 마찬가지로 대부분 생후 16일에서 22일 사이의 Gunn 랫드를 사용하였는데, 이는 인간의 신생아 황달과 가장 비슷한 모델을 만들기 위한 것이다. 랫드의 중추신경계의 발달이 와우의 발달보다 늦게 완성되기 때문에 랫드의 와우의 기능은 생후 17
~21일에 성숙되고9) 청성뇌간반응의 잠복기는 생후 15~34일 동안 정상 성숙한 쥐의 수치까지 감소한다고 한다.10) 
   청성회로에 대한 전기 생리학적 평가 방법으로서 ABR이 널리 사용되는데,7) 빌리루빈 이독성에 의한 경우 일반적으로 ABR로 청각 기능을 평가하는 기준으로는 역치값의 변화나 wave Ⅰ-Ⅲ, wave Ⅲ-Ⅴ, wave Ⅰ-Ⅴ간의 파간 잠복 시간으로 평가할 수 있다.11) 청력이 감소할수록 역치값은 증가하고, 동일한 크기의 자극에서도 반응의 진폭이 감소함을 알 수 있다. 파간 잠복 시간은 청력이 감소할수록 길어진다. Shapiro는 황달을 유도한 Gunn 랫드에서 ABR의 제 1 파형의 잠복기에는 변화가 없고 제 1 파형 이후에 나타나는 파형들의 잠복기가 길어지지만, 정상적인 달팽이음전기반응을 측정함으로써 와우의 기능에는 변화가 없으며 주요 병변은 뇌간 부위라고 보고하였으나 역치의 상승에 대하여는 보고가 없었다.4) 1993년 Shapiro의 실험에 의하면, 빌리루빈의 급성 독성은 sulfonamide를 주입한 지 4시간 후에 파형간 잠복시간 등의 ABR 변화가 나타났으며 주입 후 8시간에 파형간 잠복시간이 가장 길었음을 관찰하였다. 또한, 비포합빌리루빈과 결합하여 핵황달을 방지하기 위해 알부민 투여를 시도하였는데 약물 주입 2시간, 8시간에 알부민을 주입함으로써 ABR이 의미있게 회복됨을 증명하였고 일부에서는 치료 없이 자연적으로 잠복시간이 회복됨을 관찰하였다.3) 본 실험에서는 Shapiro의 실험과 같이 SDM을 주입하였으며 주사 후 첫 4시간 후 측정에서 역치의 상승이 관찰되었으며 일부 실험 동물에서는 24시간 후 최대 역치 상승을 보여 Shapiro의 연구 결과와 유사함을 확인하였다. 그러나, 일부 동물에서는 역치 상승의 폭도 적었으며 최대 역치 상승 시기도 달라 청성회로의 발달, 혈중 내 빌리루빈 수치의 차이 등 개체간에 차이가 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 본 연구에 사용되었던 모든 실험동물에서 ABR의 역치와 파형간 잠복시간 등이 자연 회복됨을 관찰하였다. 이러한 관찰은 임상적으로 핵황달 중 일부에서는 후유증없이 자연 회복될 수 있음을 설명할 수 있을 것으로 보인다. 본 연구에서는 와우 등 청성회로의 말초부와 뇌간 등 중추신경계가 성숙된 상태에서의 비포합빌리루빈의 영향을 관찰하기 위하여 P21 jj Gunn 랫드와 P42 jj Gunn 랫드의 ABR을 측정하였는데 P21 그룹에서는 SDM 주사에 의해 많은 영향을 받고 있지만 P42 그룹에서는 SDM 주사가 청성회로에 뚜렷한 영향을 주지 못하였다. 이는 P42 그룹의 경우 혈액-뇌장벽의 성숙, 뇌간 등의 청성회로가 성숙함에 따라 독성의 정도가 약해졌거나, P21 그룹에 비해 P42 그룹에서 혈중 비포합빌리루빈 농도가 상대적으로 상당히 낮기 때문에 SDM 주사 후 혈중 비포합빌리루빈 수치 증가하더라도 혈액-뇌장벽을 통한 영향력이 낮아지기 때문이라고 해석할 수 있다. 
   외유모세포의 능동적 기전에 의해 발현되는 DPOAE는 이독성 약물에 의한 외유모세포의 변화를 측정하는데 가장 민감한 검사로 알려져 있으며 고주파의 자극을 줄 수 있어 랫드의 와우 기능을 민감하게 반영한다.12) 본 실험은 DPOAE를 이용하여 와우의 기능을 평가하였을 때 통상보다 높은 22 kHz 고주파수에서도 이상을 발견할 수 없었다. DPOAE의 반응증폭을 보면 SDM의 주입하고 1일 후의 반응진폭이 주입 전 반응진폭보다 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며 이러한 현상은 자극의 세기가 작을 때보다 클 때 확연히 나타남을 관찰할 수 있었다. 이는 와우의 성숙에 의한 것이라고 해석하기 보다는 비포합빌리루빈이 와우핵 등 구심성 회로에 침착될 뿐 아니라 올리브와우 각속(olivocochlear bundle)에 관여하는 원심성 회로에도 침착되어 정상적인 이음향방사의 억제 기능이 저하되어 나타나는 현상으로 해석할 수 있다. 

결     론

   ABR을 이용하여 빌리루빈에 의한 청성회로의 독성이 뇌간의 와우핵을 비롯한 상위 중추청성회로의 병변에 의한 것임을 확인하였고, DPOAE에서는 정상 소견을 보여 와우에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 이러한 청성회로의 독성의 자연 회복에 대한 가능성을 확인하였다. 그러나 빌리루빈의 독성의 기전, 가역성, 축적 효과, 인간에서의 독성에 대해 밝혀지지 않은 부분이 많아 향후 추가적인 연구가 필요하다.


REFERENCES

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