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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 48(2); 2005 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2005;48(2): 234-240.
The Photodynamic Therapy using 5-Aminolevulinic Acid(ALA): The Study of the Anti-Tumor Effect on in vitro and in vivo Experiments.
Ji Sun Kim, Phil Sang Chung, Sang Joon Lee, Chung Hun Oh, Sang Yong Chung, Ji Yeon Park, Young Saeng Kim
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Dankook University College of Medicine, Cheonan, Korea. pschung@dankook.ac.kr
2Medical Laser Research Center, Dankook University College of Medicine, Cheonan, Korea.
3Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Jeju University College of Medicine, Jeju, Korea.
5-Aminolevulinic Acid(ALA)를 이용한 광역학 치료:<i>in vitro</i>, <i>in vivo</i>에서의 항암효과에 관한 연구
김지선1 · 정필상1,2 · 이상준1,2 · 오충훈2 · 정상용3 · 박지연2 · 김영생1,2
단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;의학레이저연구센터2;제주대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실3;
주제어: ALA광역학치료광감작제.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
ALA is a precursor of heme and converted to protoporphyrin IX used as effective photosensitizer. The aim of this study was to find the ideal concentration and incubation time of ALA for PDT on in vitro and in vivo experiments and to assess the anti-tumor effect of PDT using ALA on CT-26 colon cancer cell line.
MATERIALS AND METHOD:
CT-26 cell was cultured with serum free media including ALA in the dark room to show the intracellular accumulation of PpIX. The fluorescence of PpIX in the cell was detected under confocal laser scanning microscope. Also CT-26 cell was incubated with various concentration of ALA (1.0-0.001 mg/ml) and was irradiated with LED at 0 hr, 3 hr, 6 hr, 9 hr, 12 hr and 24 hr after application of ALA. The cell viability was assessed by MTT assay. in vivo PDT was done with optimal treatment condition and the anti-tumor effect of PDT using ALA was measured by tumor volume change.
RESULTS:
The fluorescence of PpIX was saturated at 6 hour after the ALA application to CT-26 cell and the optimal incubation time with ALA for PDT was 6 hours. For in vivo Study, 632 nm laser irradiation was done around the tumor 6 hours after ALA injection. The PDT using ALA on transplanted CT-26 tumors shows 40% cure rate and 40% partial remission and significant decrease of tumor volume.
CONCLUSION:
The peak accumulation of PpIX in the cell and in the tumor was reached 6 hours after the application of ALA. The PDT using ALA for CT-26 cells was very effective and this findings suggest that ALA is one of candidate for photosensitizer in head and neck solid tumors.
Keywords: Aminolevulinic acidPhotodynamic therapyPhotosensitizer

교신저자:정필상 330-715 충청남도 천안시 안서동 산 16  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
              전화:(041) 550-3975 · 전송:(041) 556-1090 · E-mail:pschung@dankook.ac.kr

서     론


  
광역학 치료(photodynamic therapy;PDT)는 종양에 비교적 집중적으로 침착하는 광감작제를 투여하고 광감작제에 흡수가 잘 되는 특정 파장의 빛으로 광감작제를 활성화 시켜 종양을 파괴하여 암을 치료하는 방법으로 1970년대부터 활발히 연구되어 왔다.1) 현재 많이 사용되고 있는 Hematoporphyrin계통의 광감작제를 이용한 광역학 치료는 피부 광독성이 오래 지속되고 종양에 대한 선택성이 좋지 않은 단점이 있다.2)
   최근들어 각광받고 있는 aminolevulinic acid(ALA)는 헴(heme)의 생합성 경로 중 광감작제인 protoporphyrinⅨ(PpⅨ)으로 전환 된다. 이 때 외부에서 ALA가 많이 투여되면 체내에 과량의 헴이 생성되어 PpⅨ을 헴으로 바꾸어 주는 효소인 ferrochelatase의 활성도를 저하시켜 세포 내에 PpⅨ이 많이 축적된다(Fig. 1).3) 이 PpⅨ은 강력한 광감작제로 활성화 되었을 때 형광을 내고 세포 독성을 나타내므로 ALA는 암의 광역학진단과 치료에 사용되었다.4) 또한 ALA는 전신 투여 뒤 24시간에서 48시간 내에 대사되어 장기간의 피부 광독성 위험을 줄일 수 있고 종양 선택성이 있어 피부, 위장기관, 폐, 방광, 구강 등의 암 병변을 치료하는데 사용되고 있다.5) 그러나 ALA는 모든 병변에 다 효과가 있지는 않다. 친수성이라 피부로 적용할 때는 효율성이 떨어지며 PpⅨ이 축적 되지 않는 경우에는 사용이 불가능하여 이러한 단점을 개선하고 효과적인 광역학 치료를 하기 위해 여러 연구가 시행중이다.
   본 연구에서는 쥐의 대장암 세포(CT-26)와 이를 실험 쥐에 이식하여 만든 종양에서 효과적인 광역학 치료를 위해 ALA를 투여한 뒤 PpⅨ이 축적되는 시간, ALA의 농도, 레이저 조사 방법에 따른 치료 효과를 관찰하여 두경부 종양에서 ALA를 이용한 광역학치료의 기초자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

광감각제 및 레이저
  
광감각제는 ALA를 사용하였고 광원은 in vitro에서는 632 nm LED(APRO M.&S. Co.Ltd)를 in vivo에서는 632 nm diode laser(Biolitec, Germany)를 사용하였다.

세포 배양
  
대장암 세포주인 CT-26 cell을 culture flask(Nunc, USA)에서 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액 500 ml에 우태혈청(Gibco, BRL) 50 ml와 antibiotic-antimycotic(Gibco, BRL) 5.5 ml를 섞은 세포배양액으로 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다.

세포 독성능 측정

세포 내에서의 광감작제의 축적 관찰
  
지수 성장시기의 CT-26 세포를 105 cells/ml이 되게 배지로 희석한 뒤 6 well plate에 well당 2.8 ml를 분주하고 24시간을 5% CO2배양기에서 배양하였다. 1 mM의 ALA를 포함한 혈청이 없는 배지로 교환하고 0시간, 3시간, 6시간, 9시간까지 빛을 차단하고 배양하였으며 confocal laser scanning microscope하에서 세포내 형광의 세기를 관찰하여 PpIX의 농도를 측정하였다.

세포 독성능 검사
  
지수 성장기의 CT-26세포를 105 cells/ml이 되게 배지로 희석한 후 96well plate에 well당 100 μl 분주하고 24시간 동안 5% CO2가 유지되는 항온 항습기에서 배양하였다. 혈청이 없는 배지와 있는 배지를 구분하여 ALA를 1.0 mg/ml부터 0.001 mg/ml까지 2배수 간격으로 희석하고 세포에 투여하였다. ALA 투여 후 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간의 시간대 별로 632 nm LED를(3.6 J/cm2, 2.3 mW/cm2) 30분간 microplate 상방 10 cm에서 조사하였고 MTT assay로 ALA만 투여한 대조군과 비교하여 세포 생존율(cell viability)을 계산하였다.

종양의 광역학 치료

세포주의 이종이식
   37℃가 유지되는 5% CO2 항온 항습기에서 단층(monolayer)을 이루도록 배양된 CT-26 세포주를 트립신으로 처리하여 세포를 분리하고 세포의 농도를 108 cells/ml개로 만들었다. 그리고 30 gauge(G) 인슐린 주사기로 6주령의 BALB/C 수컷 실험 쥐의 등에 0.1 ml씩 피하로 주입하고 종양의 형성 유무를 관찰하여 1주일에 2번씩 종양의 부피를 측정하였다.

광역학 치료 예비 실험(Preliminary study)
   광역학 치료에 가장 적합한 ALA의 농도와 ALA 투여 뒤 레이저조사까지의 시간, 적절한 레이저 조사법 등을 찾기 위하여 예비 실험을 시행하였다. 실험 쥐에 250 mg/kg, 375 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg의 다양한 농도의 ALA를 복강 내 주입하고 ALA 주입 후 3시간, 6시간, 24시간이 지난 뒤 생존 여부 및 광역학 치료 효과를 관찰하였다. 레이저 조사는 차폐를 하지 않고 종양의 직상방에서 632 nm 다이오드 레이저로 20분 간(132 J/cm2, 400 mW)의 에너지를 조사하는 방법을 사용하다가 종양을 제외한 부분에는 차폐를 하고 종양의 둘레 4방향에서 5분씩 조사하는 방법으로 바꾸어 ALA의 전신적 투여에 따른 부작용을 줄여보고자 하였다(Fig. 2).


종양의 광역학 치료
  
실험 쥐(n=22)에 이종이식 된 종양의 크기가 약 100
~300 mm3에 도달하였을 때 총 4개의 실험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 제 1 군은(n=10) 광역학 치료군으로 실험 쥐에 375 mg/kg 농도의 ALA를 복강 내 주입한 후 6시간 뒤에 종양의 주변 네 방향에서 632 nm 다이오드 레이저로(132 J/cm2, 400 mW)의 에너지로 광역학 치료를 하였다. 제 2 군(n=4)은 ALA만 투여한 군이고 제 3 군(n=4)은 레이저만 조사한 군, 제 4 군(n=4)은 아무런 처치를 하지 않은 군이었다.

항암효과의 판정
  
각 군에서 치료 후 일주일에 2번씩의 종양의 부피를 측정하여 항암효과를 판정하였다. 부피의 계산은 다음의 공식을 이용하였다.

   V=(4/3×A×B×C)×1/2(V:부피, A:장축, B:단축, C:높이)

통계처리
  
통계처리는 ANOVA test를 사용하였으며 p-value는 0.05미만을 유의한 수준으로 채택하였다.

결     과

세포 독성능 측정

세포 내에서의 광감작제의 축적 관찰
   0시간, 3시간 뒤 형광 검출은 저명하지 않았으나 6시간 이후에는 PpIX이 거의 포화된 수준에 이르러 9시간까지 plateau를 형성하였다(Fig. 3).

ALA의 농도 및 배양 시간에 따른 세포 독성능
  
혈청이 없는 배지를 사용하고 PDT를 시행한 실험군이 ALA만 투여한 대조군보다 배양 시간이 6시간 이상부터, ALA의 농도는 0.016 mg/ml 이상부터 세포 생존률이 전체적으로 유의하게 낮았고 ALA의 농도가 증가할수록 세포 생존율의 감소가 있었다(Fig. 4).

혈청 유무에 따른 세포 독성능
   ALA를 혈청을 포함한 배지와 포함하지 않은 배지에 구분하여 투여한 뒤 광역학 치료를 하였다. 혈청이 없는 배지를 사용한 실험군에서는 용량-광독성 곡선이 일정하게 그려진 반면 혈청이 포함되어 있는 배지를 준 실험군에서는 광독성은 거의 일어나지 않았다.

이종 이식된 종양의 광역학 치료

광역학 치료의 예비 실험(Preliminary study)
  
250 mg/kg의 ALA에는 PDT효과가 적고 500 mg/kg이상의 농도에는 치사율이 높았으며 두 농도의 중간인 375 mg/kg의 ALA로 3마리를 PDT한 결과 6시간 동안 배양한 뒤 시행한 결과가 가장 좋았다(Table 1).
   하지만 전체적인 쥐의 치사율이 높아 전신적인 광독성을 의심하고 레이저를 직상방에서 계속 종양에 조사하는 것이 아니라 종양이 아닌 부분은 호일로 차폐를 시키고 종양 주변 네 방향에서 5분씩 조사해 보았다. 이 때도 ALA의 농도가 375 mg/kg일 때, 배양 시간이 6시간일 때 가장 효과가 좋았으며 생존율도 증가되었다(Table 1).

종양의 광역학 치료 
   예비 실험의 결과를 토대로 실험 쥐의 수를 늘려 광역학 치료를 하였다.
   1군에서는 10예 중 완전 관해가 4예(Fig. 5), 부분 관해가 4예, 반응 없음이 2예(Fig. 6)였고, 다른 군에서는 부분관해 1예 이외에는 모두 반응이 없었다(Table 2).
   광역학 치료를 시행하기 전부터 치료 후 14일간 종양의 크기를 비교해보면 1군은 광역학 치료를 시행한 실험군으로 대부분 치료 후 10
~15일에 완치 혹은 부분 관해를 관찰할 수 있었다. ALA만 투여한 2군에서는 종양의 크기가 치료 전 평균 144 mm3에서 2주 뒤 5602 mm3로 증가함을 관찰하였다. 그리고 3군은 레이저 조사 후 7일까지 대부분의 종양이 광역학 치료를 한 1군과 비슷하게 종양의 크기가 감소하였지만 대부분 10일 이후에는 종양의 크기가 급격히 증가함을 볼 수 있었다. 4군은 아무 처치를 하지 않은 종양 조직으로 종양의 크기가 치료 전 235 mm3에서 2주 뒤에는 6592 mm3로 급격한 종양의 증가를 확인하였다(Fig. 7). 이 실험결과 광역학 치료를 시행한 1군이 다른 세 군에 비하여 의미있게 종양의 완전관해가 증가하였고 또한 종양의 부피변화에 있어서도 의미있는 감소가 있었다.

고     찰

   광역학 치료를 수행하기 위해서는 특정 파장의 빛에 활성을 나타내는 광감작제와 광감작제를 충분히 활성화 시킬 수 있는 빛이 필요한데 이러한 광원으로 레이저가 주로 광역학 치료에 이용된다. 광역학 치료용 레이저는 다른 광원에 비해 광감작제를 활성화시킬 수 있는 충분한 에너지를 가지고 있으며 단일 파장의 빛을 방출할 수 있어 광감작제의 활성을 최대로 유도할 수 있는 장점을 가지고 있다.6) 본 연구에서는 광감작제로는 ALA(5-Aminolevulinic acid)를 광원은 632 nm diode laser 및 632 nm의 LED를 사용하였다. 
   세포주에 ALA를 주입하고 배양함으로써 생성되는 PpIX의 양은 PpIX의 형광 관찰로 알 수 있다. Regula 등은 ALA 투여 뒤 PpIX 형광의 최대치가 되는 시간이 서로 다른 조직에서 1시간에서 6시간 사이라고 하였으며7) Chung 등은 SNU1041세포주에서 ALA 투여 2시간에서 5시간 사이에 형광이 최대치가 되는 것을 관찰하였다.8) 본 연구에서는 혈청이 없는 배지에 1 mM로 희석한 ALA를 투여한 뒤 confocal laser scanning microscope을 이용하여 세포 내 PpIX의 형광검출을 관찰하였다. 이 때 3시간 후에 약한 분포를, 6시간 이후에는 PpIX이 거의 포화된 수준을 보여 3시간에서 6시간 사이에 세포에 PpIX의 축적이 일어나 포화되는 것을 알 수 있었다. 다른 연구에서 간암(hepatoma cell)세포, 섬유모세포종양(neuroblastoma)세포에서의 PpIX의 축적은 12시간까지 꾸준히 증가하였고 신경모세포종양(neuroblastoma) 세포는 8시간 정도부터 포화상태를 나타내었다는 결과 등이 있으며 이로써 세포의 종류에 따라 차이가 있음을 알 수 있다.9)
   본 연구에서는 ALA를 이용한 세포 독성능에 영향을 미치는 여러 요소를 살펴보았다. 그 중에 혈청이 여러 세포주에서 PpIX의 방출을 일으키는 것으로 보인다는 연구가 있어10) ALA를 혈청을 포함한 배지와 포함하지 않은 배지에 구분하여 투여한 뒤 PDT를 시행하였다. 혈청이 없는 배지에 있는 실험군에서는 용량-광독성 곡선이 일정하게 그려진 반면 혈청이 포함되어 있는 배지를 준 실험군에서는 광독성이 거의 일어나지 않은 것으로 보아 혈청이 PpIX의 축적과 유지에 영향을 준다는 것은 확인할 수 있었다. Riesenberg 등도 J82 cell에서 혈청을 뺀 배지와 포함한 배지에서 광역학치료를 한 결과 혈청이 첨가된 실험군에서 광독성이 2배로 감소하였다고 보고 하였다.11)
  
세포에서 ALA의 농도와 광감작제 투여 뒤 배양 시간에 따른 광독성의 차이를 보면 0.016 mg/ml이상의 농도에서 6시간 이상 배양한 뒤에 PDT를 시행한 군이 대조군과 의미 있는 세포생존율의 차이를 보였다. 이것은 본 연구에서 PpIX의 축적이 ALA 투여 뒤 6시간 이후의 실험군과 0시간, 3시간 이후의 실험에서 현저한 차이를 나타내는 것과 일치한다. 또한 ALA의 농도변화에 따라 광역학 실험군에서 지수적 감소현상을 보였는데 이는 세포 내로 흡수된 광감작제를 반응시킬 수 있는 광물리 현상이 증가되었기 때문이라고 생각된다. 형광검출이 가장 잘 되는 최적의 ALA농도에서는 PpIX이 계속 축적되나 역치농도가 지나면 PpIX의 생성은 감소하는 것으로 알려져 있다.12)
   in vivo의 예비 연구에서는 최대 항암효과를 보이는 ALA 농도를 찾기 위하여 다양한 농도로 복강내 주입하여 광역학 치료를 한 결과 250 mg/kg는 치료 효과가 적었고 500 mg/ kg은 체내 독성을 일으키는 것으로 보여 375 mg/kg으로 하였다. ALA를 주입하고 녹색 레이저(532 nm)를 사용하여 PpIX의 체내 분포를 관찰한 결과 6시간 째에 최대 형광을 나타내는 것을 확인하고 광역학 치료를 시행하였으며 이 때 가장 높은 항암효과를 나타내었다. 이는 in vitro연구에서의 PpIX의 최대 축적 시간이 6시간인 것과 일치한다.
   효율적인 광역학 치료를 위하여 앞의 요소들 외에 레이저 조사방법을 바꾸어 보았고 위에서 계속 조사하는 방법에서 종양만 노출하여 주변의 여러 방향에서 조사하는 방법으로 바꾼 결과 치사율은 감소하면서 의미 있는 종양의 감소를 얻을 수 있었다. 이와 같이 최근에는 레이저 조사 방법을 변형하여 광역학 치료 효과를 높이는 시도가 많이 행해지고 있다. 대표적으로 산소화를 증진시키기 위해 레이저의 fluence rate를 줄이거나13) 단시간 간격이나 장시간 간격을 두고 분할 조사하는 방법 등이 있다. 단시간 간격(몇 초, 몇 분)으로 시행하는 레이저 분할 조사법은 암실 기간에 재산소화를 시킴으로써 더 많은 단관체 산소(singlet oxygen)를 형성한다는 이론에 기초한다.14) 1시간 이상인 장시간 간격으로 시행하는 레이저 분할 조사법은 처음에 빛을 조사하였을 때 PpIX이 부분적 혹은 완전히 photobleach되고 암실에서 적당한 시간이 지나 새로운 PpIX이 생성된 뒤 두 번째 조사를 하는 이론이다.15) 본 연구에서는 ALA를 주입한 뒤 녹색 레이저를 사용하여 PDT 전과 PDT 시행 중에 PpIX의 형광을 관찰하였고 레이저 조사 5분 뒤에는 photobleaching이 시작 되고 20분 뒤에는 형광이 거의 관찰되지 않는 것으로 보아 지속적인 20분 이상의 레이저 조사는 의미가 없는 것으로 생각된다.
   이러한 결과를 바탕으로 in vivo에서 광역학 치료를 한 군에서 80%(8/10)는 완전관해 및 부분관해를 보였고 20%(2/10)에서는 효과가 없었으나 대조군에 비하여 의미 있는 종양 부피의 감소가 있었다. 또한 치료된 종양이 완치되는 경우는 종양의 크기가 줄어들고 변연부의 종양성장도 관찰할 수 없었으나 재발 또는 치유가 되지 않은 종양에서는 공통적으로 종양 변연부에서 빨리 성장하는 것으로 보아 레이저 조사시 종양의 주변부까지 치료하는 것이 중요하다. 
   앞으로 ALA가 광역학 치료에서 효과적인 광감각제로 사용되기 위해서는 향상된 종양 선택성과 잔존성, PpIX의 약동학적인 이해, 효율적인 레이저 조사법에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 

결     론

   세포주 및 마우스 종양에서 ALA 투여에 따른 PpIX의 최대 축적시간은 6시간이었고 이 때 in vivoin vitro에서 광역학 치료를 한 결과 의의 있는 항암 효과를 관찰할 수 있었다. 이 결과는 ALA를 이용한 PDT의 임상 적용의 기본 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.


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