교신저자：이상학, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   비강의 상피층은 먼지, 화학적 자극물질 그리고 미생물등에 대하여 효과적인 방어작용을 하며, 이 기능은 섬모 세포 활성에 의한 점액섬모수송능력에 의하여 이루어 진다. 상피세포의 섬모는 점액층과 접하고 있으며 점액섬모수송기능은 점액, 수액층 그리고 섬모의 조화된 활성으로 이루어지며 이 기능은 비인강으로 점액을 배출시킴으로써 코점막의 방어기능을 제공한다. 코점막상피를 통한 수분 및 이온의 수송은 콧물의 질과 조성을 조절하는데 중요하다.¹⁾²⁾ 그러나 현재까지 코점막의 상피층을 통한 수분 및 이온의 이동에 관한 다양한 특징은 인체 비점막에서 충분하게 연구되어 있지않다. 또한 낭성섬유증 환자와 낭성섬유증이 없는 환자에서 채취한 비용종 상피는 정상 비갑개 상피보다 더 빠른 수분 및 이온수송 능력을 가지고 있으며 이 결과는 코점막의 상피세포를 통한 이온 및 수분의 흡수가 비용종의 형성에 기여한다는 것을 제시하였다.³⁾⁴⁾
   Guanylin과 uroguanylin은 각각 소장과 소변에서 검출된 열에 안정한 펩타이드로 장관이나 신장에서 전해질과 수분의 수송을 조절하는 기능을 가지고 있다고 제시되어 왔다.⁵⁾⁶⁾ 그외에도 이 펩타이드들은 췌장과 타액선 같은 장기에서도 생성됨이 확인되었다.^7)8)9)10) 이 펩타이드들은 guanylate cyclase-C 수용체에 결합한 후 cyclic guanosine 3', 5'-monophosphate와 같은 매개체를 통해 상피의 수분과 이온의 수송을 조절한다. 이것은 낭성 섬유증 막투과성 전도 조절자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator：CFTR)를 경유하여 상피세포를 통한 염소이온, 나트륨이온, 그리고 중탄산염이온의 분비를 증가시키고 수분의 이동을 유도한다.⁹⁾¹⁰⁾ 이런 관점에서 보았을 때 이러한 펩타이드들은 인체 코점막의 상피층과 점액층의 양 및 성분을 조절하는데 중요한 생리적 기능을 할 수 있다고 추측된다.
   그러나 현재까지 인체 코점막의 정상 생리기능 및 병적상태에서 guanylin과 uroguanylin의 병태생리학적 역할은 연구되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서 저자들은 역전사중합효소반응과 in situ hybridization을 이용하여 인체 코점막과 비용종에서 인체 guanylin과 uroguanylin mRNA의 발현양상을 관찰하였다.

재료 및 방법

조직 채취 및 처리
   융비술을 받은 10명의 환자들에서(남자 5명, 여자 5명, 22~40세) 하비갑개 조직을 얻었다. 그들은 비감염이나 알레르기, 흡연 또는 복용중인 약물의 기왕력이 없었고 코증상이 없었으며 비경검사에서 어떠한 해부학적 이상이나 점막손상은 관찰되지 않았다. 또한 알레르기성 비염, 천식 또는 아스피린 과민성을 가진 환자는 없었다. 비용을 가진 만성부비동염 환자(남자 6명, 여자 4명, 20~45세) 10명에서 내시경 부비동 수술을 하는 중에 비용종 조직을 채취하였다. 이 환자들도 알레르기성비염, 천식 또는 아스피린 과민성의 기왕력은 없었다. 비용종은 내시경적 사골동절제술을 시작할 때 모든 환자들의 중비도에서 발생한 비용조직을 채취하였다. 이 실험은 미리 환자들로부터 동의를 얻은 후 시행되었으며 고려대학교 의과대학 윤리 위원회의 승인을 얻은 후 시행되었다.
   채취한 조직은 두 부분으로 분리되어 한 부분은 액체질소에서 급속냉각된 후 -70℃에 보관되었고 총 RNA 분리를 위하여 사용되었다. 다른 부분은 4% 파라포름알데히드에 고정된 다음 30% 수크로오스에 넣어 보관되었고 in situ hybridization에 사용되었다.

총 RNA 분리와 역전사중합효소연쇄반응
   동결된 조직(50~100 mg)은 TRIzol^® Reagent(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) 1 ml를 넣어 혼합시킨 다음 기계적으로 파쇄하여 균질화된 다음 총 RNA는 Chomczynski의 방법¹¹⁾에 따라 분리되었다. 각 표본으로부터 얻은 총 RNA는 M-MLV 역전사 효소(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA) 2.5 U과 random hexanucleotides 50 pm을 포함하는 반응 혼합액 20 μl에 첨가한 다음 42℃에서 60분간 각각 역전사되었다. 그 후 각 반응 산물 1 μl은 Taq DNA polymerase 0.125 U와 각 시발체 12.5 pmol을 포함하는 PCR 혼합액 25 μl에서 증폭되었다. RNA integrity와 역전사 반응의 정확성은 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하여 이루어 졌으며. 음성 대조군은 각 검체의 cDNA에서 역전사중합 효소를 생략한 결과를 분석함으로써 이루어졌다. 이 연구에서 사용된 각 guanylin과 uroguanylin 그리고 GAPDH 유전자의 시발체 서열은 Table 1에 열거되었고, 중합효소연쇄반응 후 각각 증폭된 생성물은 2% agarose gel에 녹여 ethidium bromide로 염색하고 자외선하에 관찰되었다. 각 유전자에 대한 생성물의 특이성은 예상된 크기와 DNA 서열화로 검증되었다.

In situ hybridization
   Riboprobe를 제작하기 위하여 guanylin과 uroguanylin의 유전자에 대하여 각각 증폭된 중합효소 연쇄반응의 산물들을 PCR II-TOPO Cloning vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에 삽입되어 크로닝되었다. 그후 정제된 플라스미드를 HindⅢ(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 선형화되었고 T7 polymerase promotor로부터 전사반응을 시켜 antisense 소식자를 제작하였다. Sense 소식자는 Not I과 SP6 polymerase를 이용하여 제작되었다. 전사 반응은 DIG RNA labeling kit(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용함으로써 이루어 졌으며 Dig가 riboprobe에 표지되었다.
   조직 절편은 Poly-L-lycine-coated slides에 부착된 후 30분 동안 37℃에서 proteinase K 1 μg/ml로 처리되었다. 그 다음 10분 동안 0.25% acetic anhydride로 처리된 후 prehybridization buffer로 30분 동안 반응을 시켰다. 정제된 riboprobe들을 1×Denhart's solution, 50% deionized formamide, 0.3M NaCl, 20mM Tris(pH 8.0), 5mM EDTA, yeast tRNA 0.5 mg/ml, denatured salmon sperm DNA 80 μg/ml, 10 mM sodium phosphate, 10% dextran sulphate 그리고 0.1M dithiothreitol을 포함한 보합결합 용액으로 1：100으로 희석한 다음 42℃에서 약 16시간 동안 조직과 반응시켰고. 보합결합 후 조직 절편은 37℃에서 2×SSC와 1×SSC로 세척하고 NTE buffer[0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5 mM EDTA]로 처리하였다. 보합결합된 세포의 관찰은 DIG nucleic acid detection kit를 사용하여 이루어 졌다.

결     과

   인체 하비갑개 점막과 비용조직에서 추출한 총 RNA를 이용하여 역전사중합효소반응을 시행한 결과 guanylin과 uroguanylin mRNA가 모든 조직에서 발현되었다(Fig. 1). 이 조직으로부터 얻어진 역전사중합효소 연쇄반응결과 얻어진 생산물은 예상했던 크기(guanylin：158 bp, uroguanylin：241 bp)였으며 각각의 유전자에 대한 생산물의 염기서열을 분석한 결과 기존에 알려진 서열과 완전하게 일치하였다(guanylin：Genbank M97496, uroguanylin：Genbank U34279). 따라서 이 결과들을 종합하여 보았을 때 인체 비갑개 점막과 비용조직에서 guanylin과 uroguanylin의 mRNA가 발현됨을 제시한다.
   Guanylin과 uroguanylin mRNA의 분포양상을 파악하기 위하여 in situ hybridization을 이용하여 검색한 결과 guanylin과 uroguanylin mRNA는 주로 비갑개의 상피층 및 점막하선 그리고 비용의 상피층에서 발현되었다(Figs. 2A, C, 3A and C) 조직 절편이 antisense riboprobe와 보합결합하였을 때 보합결합 신호는 하비갑개의 상피층 및 점막하선에서 강하게 나타난 반면(Figs. 2A and 3A), 비용조직에서 두 펩타이드의 mRNA는 기저 세포층에서 약하게 염색되고 중간과 표층에서는 더 약하거나 염색이 되지않은 상태로 상피층에서 관찰되었다(Figs. 2C and 3C). 또한 두가지 펩타이드에 대한 mRNA는 비용조직의 상피층과 비교해서 비용종에 침윤된 염증세포에서 강하게 발현되었다. Sense probe로 보합결합된 양 조직에서 특별한 발현이 관찰되지 않았다(Figs. 2B, D, 3B and D).

고     찰

   펩타이드 호르몬인 guanylin과 uroguanylin은 위, 장, 신장, 췌장 그리고 타액선에서 높게 발현되며 상피의 이온과 수분의 이동을 조절하는 강력한 인자이다.^7)8)9)10) 이런 점에서 인체의 코점막에서 guanylin과 uroguanylin의 mRNA가 발현될 가능성이 기대되었다. 이번 연구에서는 인체 코점막과 비용조직에서 guanylin과 uroguanylin mRNA의 발현과 분포양상을 본 결과 인체의 정상적인 코점막과 비용조직에서 발현되었다. Guanylin과 uroguanylin이 여러가지 장기의 점막상피에서 이온과 수분 분비의 펩타이드성 조절자로 작용한다고 알려져 있어^7)8)9)10) 이 펩타이드들은 내인성 분비 자극제로서 인체의 코점막에서 콧물의 분비 조절에 관여할 가능성이 있다.
   상피세포를 통한 이온과 수분의 이동은 상피세포에 존재하고 있는 특정한 막성 단백질에 의하여 이루어진다. 즉, 상피 세포의 첨단부와 외측기저부에 있는 co-transport 체계, 예를 들면 aquaporin과 이온 통로들을 포함해 다수의 이송 단백질들이 있다.^{12)13)14)16)18)} 그러나 다양한 이온 및 수분의 이동을 조절하는 조절인자에 대한 연구결과들은 인체의 코점막에서는 미미한 형편이다. 코점막에 존재하는 조절인자에 대한 연구결과들을 보면 hENaC subunit에 대한 mRNA에 대해 정량적 중합효소연쇄반응을 한 결과 인체의 코점막상피가 기관지나 폐말단부위 보다 더 많은 α-hENaC mRNA를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 비강 상피에서 α-hENaC mRNA는 β-hENaC와 γ-hENaC보다 더 많다.¹⁴⁾ IL-4가 γ amiloride sensitive Na⁺ channel에 대한 mRNA의 발현양을 7배정도로 감소시키고 CFTR mRNA를 증가시켜 염증 상태에서 분비물이 과분비된다는 것을 제시하였다.¹⁵⁾ 중합효소연쇄반응과 in situ hybridization을 이용한 연구에서는 NHE1(Na⁺/H⁺ exchanger)와 AE(Cl^-/HCO^-3 exchanger)에 대한 mRNA가 인체 비갑개 점막의 상피층과 점막하선에 국한되어 발현되었다.¹⁶⁾ Aquaporin(AQP)에 대한 단백과 mRNA 발현에 대한 연구결과는 aquaporin 아형중 aquaporin 3, 4, 5형이 인체 코점막의 상피층과 점막하선에 존재함을 보여주었다.¹²⁾ 아데노바이러스 감염으로 유발시킨 쥐의 폐염증과 부종을 이용한 연구결과는 폐 조직에서 AQP1과 AQP5발현이 현저하게 감소된다는 것이 증명되었다.¹⁷⁾ 다양한 장기의 상피 세포에서 CFTR은 Cl-channel로 작용하며 Cl^-/HCO^-3 exchanger 를 포함한 다양한 이온 및 수분조절인자를 조절한다고 알려져 있으며, 낭포성 섬유증환자의 코점막에서 이온 및 수분의 분비가 손상되기 때문에 CFTR이 코점막의 분비 기능에 관여함한다는 것이 알려져있다.¹⁸⁾ 기존에 알려진 코점막에 존재한다고 알려진 위와 같은 조절자들과 더불어 본 연구에서 밝혀진 guanylin과 uroguanylin mRNA가 인체의 코점막에서 발현된다는 사실은 이들이 정상 코점막의 생리 작용에 참여할 뿐만 아니라 이들의 기능이나 발현의 변동이 코점막의 분비성 질환의 병리작용에도 관여함을 추측할 수 있다. 그러나 인체 코점막의 이온 및 수분의 이동에 관여하는 복잡한 조절 과정을 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.
   본 연구에서는 guanylin과 uroguanylin mRNA가 주로 비갑개 점막의 상피 세포와 점막하선 그리고 비용종의 상피 세포에서 국한되어 관찰되었다. 그러나 하비갑개 점막과 비교해 보았을 때 비용조직의 상피세포에서 낮은 농도로 발현되었다. 이와 같이 인체의 정상코점막과 비용조직에서 분포양상이 다르다는 것을 보여주는 결과는 인체 코점막에 대한 다른 연구 결과와 유사한데 CFTR 면역반응은 하비갑개 점막의 섬모 상피 세포의 첨단 표면에 주로 국한되었지만 비용조직에서는 첨단 부위에는 덜하고 세포질에 더 흩어져 발현되는 특성을 띤다¹⁹⁾고 하고 있다. Anion exchange(Cl^-/HCO^-3) riboprobe를 이용한 in situ hybridization 방법은 비용조직에서는 anion exchange에 대한 교합 신호가 존재하지 않음을 보여주었는데 이는 상피 세포를 통한 전해질과 수분의 수송이 비용조직에서는 손상되었음을 시사한다.¹⁶⁾ 본 연구에서 인체 비용조직에서 guanylin과 uroguanylin mRNA가 발현양이 적다는 것이 관찰된 결과를 유추해석하였을 때 비용조직에서 펩타이드의 병태생리학적 역할은 아직 불확실하지만 다음과 같은 가설이 제안된다. 인체 비용조직의 전형적인 조직학적 소견은 조직의 심한 부종이며 손상된 이온 및 수분의 이동이 부종성 변화의 가능한 기전으로 여겨져 왔다.²⁰⁾²¹⁾ 따라서 guanylin과 uroguanylin mRNA의 발현이 비용조직의 상피세포에서 낮아진 결과를 보면 상피 세포를 통한 이온 및 수분의 이동이 손상되어 결과적으로 부종성 변화가 유발된다고 생각된다. 한편 비용조직에 침습된 염증세포들에서 이 펩타이드들에 대한 mRNA가 강하게 발현되었는데 이와 같은 강한 발현은 in situ hybridization 방법에서 비특이적일 수 있다는 의문을 불러 일으킨다. 그러나 sense probe로 보합결합을 시켰을 때는 양성 교합 반응이 나타나지 않았다. 따라서 염증 세포들에서도 이 펩타이드 유전자가 발현된다는 것을 확신하며 비용조직에서 의미있는 역할을 함을 제시해 준다고 생각된다. 이러한 추측은 백혈구에서 아직 밝혀지지 않은 수많은 이온 channel들이 있다는 사실에서도 뒷받침된다.²²⁾
   수분과 이온이동을 조절하는 조절자로서의 역할뿐만 아니라 이 펩타이드들은 상피 세포의 증식과 분화를 조절하는 기능을 가지고 있다는 것을 시사하는 연구 결과들이 늘어나고 있다.²³⁾²⁴⁾ 최근의 실험들은 인체 대장의 선암과 용종에서 guanylin과 uroguanylin mRNA 발현이 현저히 억제되어 있음을 증명하였고 uroguanylin을 이용한 치료는 cGMP에 의존하는 기전에 의해 인체 T84와 CaCo-2 대장암 세포들의 소멸되었다는 것을 보여주었다.²³⁾ 대장암 Min/+ 쥐 모델에서 uroguanylin 경구 투여는 용종 형성을 억제했을 뿐만 아니라, 이러한 cGMP 조절 펩타이드는 치료중 대장 용종 발생을 확실하게 지연시켰다.²⁴⁾ 이러한 결과들은 근거로 유추하면 이들 두 펩타이드 유전자 발현이 비용조직에서 낮아진 것은 비용조직에서 상피 세포 증식을 유발할 수 있고 비용종 형성에 기여할 수 있다고 생각된다. 이러한 고찰은 정상 코점막과 비교해 비용조직에서 상피 세포 증식이 의미있게 증가된 결과들에 의해 뒷받침된다.²⁵⁾

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