교신저자：김영호, 156-707 서울 동작구 신대방2동 395  서울대학교 의과대학 서울특별시립보라매병원 이비인후과학교실
              전화：(02) 840-2461 · 전송：(02) 831-0714 · E-mail：yhkiment@yahoo.co.kr

서     론

   와우는 소음, 이독성 약물, 허혈 등 다양한 stress들에 노출되고, 이러한 stress들은 와우에 잠재적인 손상을 일으켜 일시적 또는 영구적인 청력역치 변화가 나타날 수 있다. 세포나 기관이 이러한 stress에 노출되면 대부분의 다른 단백질의 합성은 억제되나, 소수의 세포내 단백질인 heat shock proteins(HSPs)가 빠르게 합성된다. HSPs는 1974년 Tissieres 등에 의해 열을 가한 초파리에서 발견된 단백질로 그 크기와 역할에 따라 HSP 60 family, HSP 70 family, HSP 90 family, low molecular protein family 등의 isoform들로 분류되며 모든 isoform들의 양은 전체 세포단백량의 5% 정도를 차지한다고 알려져 있다.¹⁾ 그 중에서도 가장 많이 연구되고 중요한 family인 HSP 70 family는 4종 이상으로 이루어져 있다. HSPs의 기능은 아직 명확히 알려져 있지 않지만 Stress들로부터 세포와 기관(organism) 의 보호, 손상의 복구, 생존에 관계한다고 보고되고 있다.²⁾ 또한, 손상된 단백질에 대해서는 misfolding이나 변성된 단백을 refolding 시키거나 수용화시켜 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다.³⁾ 그 중에서도 HSP70 family의 구성원들은 다양한 세포내 구획(compartment)을 통해 새로이 합성된 단백질을 따르는 molecular chaperone의 역할을 하여 다양한 세포내 장벽(intracellular barrier)을 통한 단백질의 통과를 용이하게 하고 새로이 합성된 단백질의 적절한 folding을 유지시키고 부적절하게 합성되거나 결합된 단백질의 제거를 돕는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 포유동물의 와우에서 HSP72의 발현은 소음자극 뿐만 아니라 열, 일시적 허혈에 의해서도 나타나고, 특히 소음에 의해 유발되는 HSP72는 강한 소음자극에 반응하여 세포의 보호역할을 담당하는 것으로 추측되고 있다.⁵⁾
   HSP의 기능을 확인하기 위하여 HSP합성의 억제자와 유발자를 사용한 많은 연구가 진행되었다. 그 중에서도 식물에 널리 분포되어 있는 bioflavonoid 계통의 하나인 quercetin(3, 3', 4', 5, 7-Pentahydroxyflavone)은 heat shock transcription factor(HSF)가 target DNA에 결합하는 것을 억제함으로써 heat shock 자극 후 heat shock gene의 전사를 차단하여 자극을 받은 세포에서 stress반응을 억제하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 또한, 이것은 HSP 합성의 억제 뿐만 아니라 배양에서 세포성장의 억제,⁷⁾ glycolysis의 손상,⁸⁾ 대분자합성(macromolecular synthesis)의 억제⁹⁾ 등을 포함하여 포유동물 세포에서 다양한 생물학적 활성을 가진다고 보고되었다. 그러나 동물실험에서 HSP합성에 대한 quercetin의 효과와 그 기능적 연관성에 대한 연구는 많지 않았다.
   본 연구는 HSPs 발현의 억제물질로 알려진 quercetin을 이용하여 소음 노출시 HSPs가 와우세포와 청력변화에 미치는 영향과 그 기능을 예측하기 위하여 시행되었다.

재료 및 방법

   실험동물은 현미경하 고막검사에서 정상 소견을 보이고 이개반사가 정상인 체중 200~250 gm의 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley rat) 30마리(60귀)를 대상으로 하였다. 이들 중 무작위로 10마리씩 실험군과 2개의 대조군으로 분류하였다.
   각 실험군 및 대조군(n=30)은 약물주입 및 청성뇌간유발반응 검사를 위하여 ketamine(50 mg/kg)과 xylazine(20 mg/kg)을 근육주사하여 마취시켰다.
   Quercetin 용액은 5 mg의 quercetin(3, 3', 4', 5, 7-Pentahydroxyflavone, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.)을 0.05 ml의 ethanol(CARLO ERBA reagenti, France)에 용해시킨 후 1.0 ml의 멸균 생리식염수로 희석시켜 만들었다. 소음원은 자체 제작한 white-noise generator를 사용하였고, amplifier 및 loudspeaker를 통하여 소음을 증폭하였으며 SL-1350 noise level meter로 intensity와 spectrum을 측정하여 최대 110 dB 음압수준의 백색잡음을 확인하였다. 소음노출은 방음이 된 chamber내 speaker 앞 10 cm에 실험동물을 소음원을 향하여 고정시킨 후 시행하였다.
   실험군(n=10)은 마취 후 quercetin 용액(15 mg/kg)을 정맥을 통해 주사하였고, 마취에서 회복 후 3시간동안 110 dB 음압수준의 백색잡음에 노출되었다. 대조군1(n=10)은 quercetin 용액의 주입없이 같은 소음환경에 노출되었으며, 대조군2(n=10)는 마취 후 quercetin 용액의 용매인 ethanol 만 0.05 mL 주입하고 마취에서 회복 후 같은 소음환경에 노출되었다.

면역조직화학염색
   소음노출 6시간 후 실험군 및 대조군 1과 대조군 2에서 무작위로 5마리를 선택한 후 pentobarbital sodium을 복강 내 주사하여 마취시키고 고정액(4% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer solution, pH 7.4, Sigma, USA)으로 관류고정시켰다. 관류고정 직후 측두골을 적출하였고 면역조직화학 검사를 위해 미세해부기구로 와우를 분리하였다. 와우조직내 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위하여 0.3% hydrogen peroxide에서 10분간 반응시켰고, 인산완충식염수용액(0.1M phosphate buffered saline, PBS)으로 세척하였다. 조직내 비특이적 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 정상 말 혈청으로 조직을 40분간 처리 및 PBS 세척 후 1차 항체인 HSP72 antibody(StressGen)를 1：500으로 희석하여 하룻동안 반응시켰다. PBS에 세척 후 2차 항체로 biotin과 결합된 biotinylated anti-mouse IgG(Vector Laboratory Inc. Burlingame, CA)로 2시간 동안 반응시킨 후 PBS에 세척하였다. Avidin-peroxidase(Vector Laboratory, USA)에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 항체결합의 확인을 위해 diaminobenzidine(DAB) hydrochloride로 염색하였다. 미세해부기구로 와우의 second turn을 분리하여 50% glycine으로 도포된 슬라이드에 놓고 광학 현미경으로 관찰하였다.

뇌간유발반응 청력검사
   실험군 및 대조군 1과 대조군 2에서 무작위로 5마리를 선택하여 마취 후 소음에 노출되기 전과 소음피폭 후 8시간, 16시간, 24시간, 32시간, 40시간, 48시간에 ABR(Auditory brainstem response)이 시행되었다.
   ABR은 Navigator SE(Bio-Logic Systems Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하여 측정되었다. 마취는 ketamine(30 mg/kg)과 xylazine(6 mg/kg)을 근육주사하였고 ABR 측정을 위하여 피하 침전극의 활동전극은 두정부에, 기준전극은 검사측 외이도 연골부위에, 접지전극은 반대측 외이도 연골부에 삽입하였다. 실험동물의 외이도에 insertion headphone을 삽입하고 bandpass 100 Hz에서 3000 Hz까지 filtering한 click음을 자극율 11.1회/초, 자극횟수 1024 회로 주어 90 dB HL의 강도부터 10 dB 간격으로 역치까지 측정하였고 역치 근처에서는 3 dB 간격으로 구하였다. wave V를 기준으로 최소 2회 이상 ABR을 시도하여 반복적인 파형을 나타내는 가장 낮은 자극강도를 청력역치로 정의하였다.

통계학적 검정
   본 연구에서 얻은 측정치는 SPSS for windows version 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL) 프로그램의 one way ANOVA 에서 Scheffe를 이용한 Post Hoc Test를 이용하여 분석하였고 p값이 0.05 미만인 경우에만 통계적으로 유의성이 있는 것으로 고려하였다.

결     과

면역조직화학적 검사소견
   소음노출 6시간 후 대조군 1과 대조군 2에서는 외유모세포의 거의 모든 열에서 HSP72의 발현이 관찰되었는데 특히 와우 제 2 회전부의 발현이 뚜렷하였다(Fig. 1A). 외유모세포들 중에도 제 3 열의 발현율이 가장 높았고 제 2 열, 제 1 열순이었다. 그러나 내유모세포들의 HSP72 발현은 거의 관찰되지 않았다. 실험군의 외유모세포에서는 HSP72가 발현된 세포수의 현저한 감소가 관찰되었는데 대부분 제 3 열에서 발현되었고 대조군과 마찬가지로 내유모세포들의 HSP72의 발현은 관찰되지 않았다(Fig. 1B).

청력역치의 변화
   소음노출 전후 각 군의 평균청력역치변화는 Table 1과 같다. 소음노출 전에 측정된 각 군 사이의 평균청력역치는 각 군간에 통계적으로 의미있는 차이가 없었고, 소음노출 직후 평균청력역치에 의한 통계학적 분석 결과에서도 대조군 1, 대조군 2 및 실험군 모두 소음노출 직후 약 40 dB 정도의 청력역치의 감소를 보였으나 각 군간에 통계적인 유의성은 없었다. 소음노출만 시행된 대조군 1의 평균청력역치는 소음노출 직후 18.8 dB에서 58.2 dB로 증가하였고 ethanol 투여 후 소음노출이 시행된 대조군 2도 18.2 dB에서 60.6 dB로 증가하였다. Quercetin 투여 후 소음노출이 된 실험군도 17.6 dB에서 59.4 dB로 대조군들과 유사하게 평균청력역치가 증가하여 quercetin의 투여에 따른 소음노출 직후 청력역치의 변화는 없는 것으로 나타났다.
   그러나, 소음노출 이후 각 군의 청력역치가 회복되기 시작하였는데 두 대조군은 24시간까지 소음노출 이전의 수준으로 회복한 반면 실험군에서는 소음노출 24시간까지 완만한 청력역치의 회복을 보이다가 점차 회복속도가 증가하여 48시간에는 소음노출 이전의 수준으로 회복하였다(Fig. 2). 대조군 1과 대조군 2는 8시간 후부터 청력역치의 회복이 나타나기 시작하였는데 실험군과 대조군 1에서 유의한 차이가 있었고(p=0.002), 실험군과 대조군 2에서도 유의한 차이가 확인되었다(p<0.00). 대조군 1과 대조군 2에서는 p=0.494로 두 군간에 통계적인 유의성이 없었다. 소음노출 16시간 후에도 실험군과 대조군 1 및 실험군과 대조군 2에서는 유의한 차이가 유지되었고(p<0.00), 대조군 1과 대조군 2에서는 p=0.114로 두 군간에 통계적인 유의성이 없었다. 소음노출 24시간, 32시간, 40시간 후에도 실험군과 대조군 1 및 실험군과 대조군 2에서는 p<0.00으로 유의한 차이가 있었고, 대조군 1과 대조군 2 사이에서는 통계적인 유의성이 없었다(24시간 p=0.377, 32시간 p=1.000, 40시간 p=0.195). 소음노출 48시간 후에는 각 군에서 이전의 청력역치 정도로 회복되었는데 각 군간에 통계적으로 의미있는 차이가 없었다(실험군과 대조군 1 p=0.903, 실험군과 대조군 2 p=0.232, 대조군 1과 대조군 2 p=0.116).

고     찰

   HSP72는 소음자극 후 와우내 유모세포와 뇌간 와우핵에서 발현되고 자극에 대한 세포의 방어작용에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 세포가 안정된 상태에서는 구성형 heat shock transcription factor(HSF)는 구성형 HSP에 의해 억제되어 있으나 HSP을 유발하는 자극들에 의해 증가된 세포수준의 변성된 단백질들은 HSP와 결합을 하게 되고, HSF의 활성을 유발시키면서 결과적으로 HSP gene들의 전사(transcription)가 증가하게 된다.¹⁾
   Heat shock이나 다른 자극들에 의한 HSPs의 유도는 전사과정(transcription)과 번역과정(translation)의 수준에서 이루어진다. Heat shock gene의 transcription은 promotor region의 cis-acting heat shock element(HSE)와 trans-acting heat shock factor(HSF)에 의해 조절된다.⁶⁾ 그리고 일반적으로 세포들은 stress를 받은 초기에 다른 단백질의 정보(message)보다 먼저 HSP의 정보(messages)들을 번역(translation)하기 시작한다.¹¹⁾ 이러한 우선적인 HSP 번역작업은 전사(transcription) 및 후전사(posttranscription) 조절기전을 반영하고 있다.¹²⁾
   그 동안 많은 연구가 진행된 HSP family의 발현된 구성원들은 미성숙한 단백질에 결합하고 부적절한 결합과 접힘(folding)을 예방한다고 알려져 있으나, 세포복구과정 동안에 HSP의 역할은 충분히 밝혀져 있지 않다.¹⁾ 최근의 연구에서 HSP가 능동적 세포사(active cell death)와 관련된 signal transducer들과 상호작용하여 apoptosis 경로를 억제한다고 알려졌는데¹³⁾ 이로써 HSP는 세포에 자극이 가해진 상태에서 증가하여 손상된 단백질들을 돕는 '구조자'의 역할을 하고 능동적 세포사 경로를 억제하는 '억제자'의 역할을 하면서 세포를 보호하는 '보호자'의 역할을 한다고 보고되었다.¹⁴⁾ 또한, HSP72는 다양한 자극에 반응하면서 세포질에서 핵으로 이동한다고 알려져 있고 stress를 받은 세포의 핵 내 HSP72의 농도가 그 단백질의 보호반응의 일부라고 생각되고 있다.¹⁵⁾ 본 연구에서는 소음에 노출된 대조군에서 대부분의 외유모세포의 핵 내 HSP72 농도가 증가된 데 반하여 quercetin이 투여된 실험군에서는 소수의 외유모세포질 내 HSP72의 발현만 관찰되어 quercetin의 강한 HSP72 발현억제 및 핵으로의 이동억제 작용을 추측할 수 있었고 이에 대한 추가적인 연구를 고려하고 있다.
   Quercetin(3, 3', 4', 5, 7-Pentahydroxyflavone)은 식물에 널리 분포하는 매우 흔한 flavonoid로서 경구나 정맥으로 투여되었을 때 독성이 거의 없는 것으로 알려진 polyphenolic compound이다.¹⁶⁾ Quercetin은 다양한 실험모델에서 HSP70의 발현을 억제하기 위해서 널리 사용되고 있는데 heat shock factor(HSF)와 상호작용하여 heat shock factor(HSF)가 heat shock element(HSE)에 결합하는 것을 차단하여 HSP70 발현을 억제하고 HSP70 mRNA 축적을 감소시키는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 또한, heat shock과 quercetin의 병합이 HSP70 DNA fragmentation을 야기하여 HSP70의 발현이 감소한다는 보고도 있다.¹⁷⁾ 그러나 quercetin은 HSP70 발현 억제기능 외에도 세포에 대한 다양한 효과를 가지고 있고 HSP 발현 억제기능도 HSP70에 대해서만 특이적이지는 않다.
   Quercetin의 이러한 HSP 발현억제 효과를 이용하여 열치료와 화학요법의 항암병합요법에서 HSP의 세포보호기능의 억제를 통한 암세포 살상능력의 증가 기능을 가진 thermosensitizer로서의 가치가 연구되고 있다.¹⁸⁾ 본 연구에서 quercetin이 투여된 실험군에서는 대조군에 비하여 외유모세포의 HSP72 발현이 현저히 감소되었는데 이는 quercetin이 시험관 실험에서 뿐만 아니라 동물실험에서도 HSP72의 합성억제가 확인되는 것으로 생각된다.
   소음노출 직후 실험군 및 대조군 모두 약 40 dB의 청력역치변화를 나타냈다. 이러한 결과로 볼 때 quercetin에 의한 HSP 합성억제가 소음자극 초기에 대조군에 비하여 더 큰 청력역치변화를 유발시키지는 않는 것으로 예상되고 이것으로 소음자극에 대한 HSP의 보호역할을 설명할 수는 없다. 그러나 자극 후 시간경과에 따라 quercetin이 투여된 실험군에서 청력역치변화의 회복개시는 대조군에 비하여 지연되었고, 소음노출 이전 수준으로 회복되는 시간도 지연되었다. 즉, quercetin에 의해 유발된 외유모세포의 HSP72 합성억제와 더불어 대조군보다 더 심하거나 영구적인 청력역치변화(permanent threshold shift, PTS)를 일으키지 못하였으나 청각역치의 기능적 회복을 지연시켰다. 이상으로 볼 때 HSP72가 일반적으로 알려져 있는 청각의 보호기능 외에 기능적 회복의 빠른 개시와 완료에 대한 기능이 있을 것으로 사료되었다. 이러한 양상의 기능적 청력회복은 영구적 청력역치변화(permanent threshold shift, PTS)를 일으킬 수 있는 수준 이하의 소음에 의한 HSP72 합성이 일시적 청력역치변화(temporary threshold shift, TTS)의 신속한 회복과 관련될 수 있음을 의미하지만 quercetin의 HSP72 합성억제효과가 한시적일 수도 있다는 점을 고려해야 할 것이다.
   Fraenkel 등¹⁹⁾은 3~4개월된 흰쥐와 2년 된 흰쥐의 귀에 TTS와 PTS를 유발하여 노화에 따른 소음성 난청의 susceptibility 차이를 비교하였는데 1시간 동안 113 dB 음압수준의 broad-band noise에 노출되고 24시간 후 소음자극 노출 이전의 역치를 회복하였고 이것은 3시간 동안 110 dB 음압수준의 광역대소음(broad-band noise)에 노출시켰던 본 연구의 결과와도 유사하였다. 그러나 110 dB의 광역대 소음에 90분간 노출시켰던 Lim²⁰⁾의 실험결과는 약 30~40 dB의 청력역치 상승이 3~4시간 동안 지속된 후 정상으로 회복되어 본 연구결과와 차이를 보였는데 이것으로 보아 110 dB의 소음에 90분과 3시간의 노출시간 사이에서 청력역치 회복속도의 급격한 감소가 나타나는 것으로 생각되었다.
   결론적으로 quercetin은 HSP의 합성을 억제하고 소음에 의한 일시적 청력역치변화의 회복개시와 완료시기를 지연시켰다. HSP72 합성의 신속한 청력회복과 관련된 기능을 제시하면서 HSP 합성의 다양한 억제자에 대한 연구가 HSP의 다른 기능과 소음에 의한 일시적 청력역치변화의 기전을 이해하는데 도움이 되리라 생각한다.

1. Morimoto RI, Tissieres A, Georgopoulos C. The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press;1994. p.1-154.

2. Barbe MF, Tytell M, Gower DJ, Welch WJ. Hyperthermia protects against light damage in the rat retina. Science 1988;241:1817-20.

3. Heufelder AE, Wenzel BE, Bahn RS. Methimazol and propylthiouracil inhibit the oxygen free radical-induced expression of 72 kilodalton heat shock protein in Graves' retroocular fibroblasts. J Clin Endocrinol Metab 1992;74:737-42.

4. Benjamin IJ, McMillan DR. Stress(heat shock) proteins. Molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res 1998;83:117-32.

5. Lim HH, Jenkins OH, Myers MW, Miller JM, Altschuler RA. Detection of HSP 72 synthesis after acoustic overstimulation in rat cochlea. Hear Res 1993;69:146-50.

6. Hosokawa N, Hirayoshi K, Kudo H, Takechi H, Aoike A, Kawai K, et al. Inhibition of the activation of heat shock factor in vivo and in vtro by flavonoids. Mol Cell Biol 1992;12:3490-8.

7. Kim JH, Kim SH, Alfieri AA, Young CW. Quercetin, an inhibitor of lactate transport and a hyperthermic sensitizer of HeLa cells. Cancer Res 1984;44:102-6.

8. Suolinna EM, Lang D, Racker E. Quercetin, an artificial regulator of the high aerobic glycolysis of tumor cells. J Natl Cancer Inst 1974;53:1515-9.

9. Graziani Y, Chayoth R. Regulatioin of c-AMP level and synthesis of DNA, RNA and protein by quercetin in ehrlich ascities tumor cells. Biochem Pharmacol 1979;28:397-403.

10. Lim HH, Altschuler RA. Expression of 72kD heat shock protein with noise induced temporary threshold shift in rat cochlea. Korean J Otolaryngol 1994;37:1142-7.

11. Mizzen LA, Welch WJ. Characterization of the thermotolerant cell. I. Effects on protein synthesis activity and the regulation of heat shock protein 70 expression. J Cell Biol 1988;106:1105-16.

12. Beckmann RP, Mizzen LE, Welch WJ. Interaction of hsp70 with newly synthesized proteins: implications for protein folding and assembly. Science 1990;248:850-4.

13. Gabai VL, Sherman MY. Interplay between molecular chaperones and signaling pathways in survival of heat shock. J Appl Physiol 2002;92:1743-8.

14. Aufricht C. HSP: Helper, suppressor, protector(editorial). Kidney Int 2004;65:739-40.

15. Knowlton AA. Mutation of amino acids 566-572(KKKVLDK) inhibits nuclear accumulation of heat shock protein 72 after heat shock. J Mol Cell Cardiol 2001;33:49-55.

16. Lamson DW, Brignall MS. Antioxidants and cancer, part 3: quercetin. Altern Med Rev 2000;5:196-208.

17. Tsukimi Y, Fujishita T, Nakajima K, Okabe S. Effect of rebamipide on cell death induced by combined treatment of mild heat shock and quercetin in RGM-1 cells: A role for HSP70 induction. Pharmacology 2002;64:28-35.

18. Debes A, Oerding M, Wilers R, Gobel U, Wessalowski R. Sensitization of human Ewing's tumor cells to chemotherapy and heat treatment by the bioflavonoid quercetin. Anticancer Res 2003;23:3359-66.

19. Fraenkel R, Freeman S, Sohmer H. Susceptibility of young adult and old rats to noise-induced hearing loss. Audio Neurootol 2003;8:129-39.

20. Lim HH. Noise induced expression of HSP 90 in rat cochlea. Korean J Otolaryngol 1995;38:163-7.