교신저자：동헌종, 135-710 서울 강남구 일원동 50  성균관대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   기관지 천식과 만성 부비동염은 흔히 동반되는 질환으로 천식 자체가 부비동염을 악화시킬 수 있으며¹⁾²⁾ 부비동염을 치료하면 천식의 증상도 함께 호전되는 경우가 많다.²⁾³⁾ 반면 천식 또한 만성 부비동염의 수술 후 경과에 영향을 미치는 인자로 알려져 있으며, 천식을 동반한 부비동염 환자를 수술할 경우 천식이 없는 환자에 비해서 수술 후 경과가 좋지 않다는 보고들이 많다.⁴⁾⁵⁾ 저자들은 이미 천식을 동반한 만성 부비동염 환자의 경우 수술 후 경과가 좋지 못하며 병리조직학적 검사상 기저막 두께의 증가, 배세포 증식, 호산구 침윤이 천식이 동반되지 않은 환자들에 비해 현저하다고 보고한 바 있다.⁶⁾
   기관지 천식과 부비동염은 만성 염증반응이라는 공통된 특징을 지니고 있으며 최근에는 이러한 염증반응의 매개물질인 cytokine의 역할이 주목받고 있다. Cytokine에 대해서는 많은 연구들이 있지만 주로 알레르기 비염이나 비용종을 동반한 만성 부비동염에만 국한하여 연구한 것들이 대부분이며 천식을 동반한 만성 부비동염에 대한 연구는 거의 없다. 하지만 천식과 만성 부비동염은 기도의 염증반응이라는 공통된 특징을 지니고 있을 뿐 아니라, 천식이 부비동염을 악화시킨다든지 부비동염의 치료가 천식의 증상을 호전시키는 등의 상호의존적인 관계를 보이고있다. 이에 저자들은 천식을 동반한 만성 부비동염 환자군과 천식을 동반하지 않은 환자군에서 비용종의 cytokine 발현 양상이 어떠한 차이를 보이는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

   천식을 동반한 만성 부비동염으로 삼성서울병원 이비인후과에서 1997년 9월부터 1998년 11월까지 부비동 내시경 수술을 시행받은 환자 20명을 천식군으로 하였으며, 남자가 10명, 여자가 10명이었고 평균 나이는 47세였다. 천식은 호흡기내과 전문의에 의해 환자의 병력 및 이학적 소견, 그리고 폐기능 검사 소견 등으로 진단 하였으며, 폐기능 검사상 기관지 천식의 진단기준은 metacholine 유발검사(provocation test)에서 1초간 노력성 호기량(forced expiratory volume in 1 second：FEV1)이 정상치의 80% 이하일 때로 하였다. 천식군의 환자들은 최소한 1년 이상의 천식 병력을 가지고 있었으며, 기관지 확장제와 스테로이드 등으로 천식치료를 최소 6개월이상 시행받았다.
   비천식군은 같은 기간동안 천식이 없는 만성 부비동염으로 부비동 내시경 수술을 시행받은 환자 25명을 대상으로 하였으며, 남자가 17명, 여자가 8명이었고 평균 나이는 37세였다.
   만성 부비동염은 양군 모두에서 화농성 비루, 후비루, 두통, 후각장애, 안면충만감, 비폐색 등과 같은 환자의 증상과 내시경으로 관찰한 부비동 소견 및 부비동 전산화단층 촬영 소견으로 진단하였으며, 최소한 3개월이상의 항생제를 포함한 내과적 치료에도 호전이 없는 환자들이었고, 모든 환자들은 부비동 내시경 수술전 최소 1주이상의 항생제 치료를 시행 받았다. 진균성 부비동염, 알레르기성 진균성 부비동염(allergic fungal sinusitis), 점액낭종(mucocele), 상악동 후비공 용종(antrochoanal polyp)으로 수술을 받은 환자들은 제외하였으며, 18세 이상의 환자들만 포함시켰다.
   각각의 환자들에 대해서 수술전 비용종의 정도를 평가하여 수술전 병변의 정도를 평가하였다. 수술전 비용종의 정도는 비용종이 없는 경우를 0, 비용종이 중비도를 부분적으로 막고 있는 경우를 1, 중비도를 완전히 막고 있는 경우를 2, 비용종이 비전정까지 확장되어 있는 경우를 3으로 점수화 하였다.
   천식군과 비천식군에서 수술 중 채취한 비용종을 즉시 액체질소로 급속 동결 시킨 후 실험 전까지 -70℃ 냉동고에 보관한 후 다음의 순서에 따라 cytokine 발현 여부를 조사하였다. 본 연구에서 관찰한 cytokine은 IL-3(interleukin-3), IL-4, TGF-β1(transforming growth factor-β1), GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), INF-γ(interferon-γ)이며, 양성 대조군으로 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다.

Total RNA 추출
   Total RNA는 Trizol(GIBCOBRL, USA)을 사용하여 추출 하였다. 냉동 보관된 조직 50~100 mg을 1 ml Trizol 용액에 넣고 잘 분쇄한 후 상온에서 5분간 방치한 후 0.2 ml CHCl3을 넣고 잘 섞어준 후 4℃에서 12,000 g로 15분간 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 여기에 0.5 ml isopropyl alcohol을 넣고 실온에서 10분간 방치하였다. 이것을 4℃에서 12,000 g로 10분간 원심분리 시킨 후 상층액은 버리고 1 ml 75% alcohol로 침전물을 씻어주었다. 이렇게 얻은 RNA는 0.1% DEPC에 용해시켜 UV spectrophotometer로 정량하였다. 추출한 RNA의 integrity는 1% agarose gel에서 전기영동 시킨 후 28S와 18S band의 존재 유무로 확인하였다.

역전사 효소반응(Reverse transcription reaction)
   추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하기위해 1 μg total RNA와 1 μl random hexamer(25 μM)를 혼합하고 70℃에서 10분간 열을 가한 후 즉시 얼음에서 식혔다. 여기에다 4 μl 5×First Strand Buffer, 2 μl 0.1 M DTT(Dithiothreitol)와 1 μl 10 mM dNTP Mix를 첨가하여 25℃에서 10분간 방치한 다음 42℃에서 2분간 반응 시킨 후 1 μl SUPERSCRCRIT II(2000 U/μl)와 잘 섞어 준 후 42℃에서 50분간 반응시켰다. 반응 종결을 위해 70℃에서 15분간 가열하였다. 이렇게 만들어진 cDNA는 PCR반응을 위한 주형(template)으로 사용하였다.

PCR(Polymerase chain reaction)
   각 조직에서 발현되는 cytokine을 검출하기 위해 역전사 효소반응에서 얻은 cDNA를 이용해서 PCR을 시행하였으며, 이때 사용한 각 cytokine의 specific primer는 Table 1과 같다(Table 1).
   PCR 반응물은 1×PCR reaction buffer(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 0.2 mM dNTP, 0.4μM upstream primer, 0.4 μM downstream primer, 2 U Taq DNA polymerase, 2 μl cDNA를 혼합하여 다음조건으로 반응시켰다. GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER, USA)을 이용하여 94℃에서 3분간 반응물을 변성시킨 후 94℃에서 45초, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분간 30회 cycle을 시행하였다. PCR 회수는 cycle수를 달리하여 PCR 증폭 산출량을 측정하여 적정횟수를 결정하였다. 또한 마지막 cycle은 72℃에서 5분간 연장반응 시켰다. 각 primer의 annealing온도는 IL-3, GM-CSF, INF-γ는 62℃, IL-4는 52℃, IL-8은 60℃, TGF-β1는 59℃를 사용하였다.

PCR 생성물에 대한 Southern blot 분석
   RT-PCR 결과를 재확인하기 위해 PCR 생성물에 대한Southern blot hybridization을 시행하였다. PCR 생성물을 1.2% agarose gel에 전기영동 시켜 분리한 후 gel을 변성, 세척, 중화단계를 거친 후 capillary diffusion방법을 사용하여 Nylon membrane으로 transfer시켰다. membrane은 UV cross linker를 이용하여 DNA를 고정시켰고 hybridization buffer(50% formamide, 4×SSC, 50 mM Tris-HCl(pH7.5), 2.5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.25 mg/ml ssDNA, 5×Denhardt's solution)로 42℃에서 2시간 동안 pre-hybridization시켰다. 각 cytokine의 probe는 100 ng의 cDNA를 Random Primed DNA Labeling kit(Boehringer Mannheim GmbH, Germany)로 [α-32P]dCTP로 표지하여 사용하였다. probe를 넣은 후 42℃에서 24시간동안 hybridization시킨 후에 Sol I(2×SSC, 1% SDS), Sol II(2×SSC, 0.5% SDS), Sol III(0.1×SSC, 0.5% SDS)로 잘 세척한 후 Phophoimager screen에 노출 시켜 MCID software를 이용하여 각 cytokine의 상대적인 mRNA 발현량을 측정하였다. 이 membrane 위에 X-선 필름을 얹어서 -70℃ 냉동고에 방치시킨 후 감광된 필름을 현상하였다.

Cytokine의 상대적 양 분석
   각 조직에서 발현되는 각 cytokine의 상대적 양은 Phosphoimager에서 읽은 동위원소의 활성도값(radioactivity)으로 분석하였다. 동일한 RNA 양에서 발현되는 각 cytokine 양은 각 조직에서 발현되는 cytokine 양을 그 조직에서 발현되는 GAPDH 양으로 나누어준 값으로 계산하였다(cytokine/GAPDH).
   각각의 환자들에 대해 비용종의 정도 및 각 cytokine 발현에 대해 천식군과 비천식군에서 차이가 있는지를 비교하였으며 통계적 분석은 Wilcoxon rank sum test를 사용하였고 유의수준 5%를 적용하였다.

결     과

   수술 전 비용의 정도는 천식군에서 3.07±1.6, 비천식군에서 2.76±1.63으로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.468, Fig. 1).
   비용에서의 IL-3의 발현정도(IL-3/GAPDH)는 천식군에서는 0.73±0.78, 비천식군에서는 0.92±0.46으로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.067, Figs. 2 and 3). IL-4의 발현정도(IL-4/GAPDH)는 천식군에서는 0.61±0.59, 비천식군에서는 0.59±0.54으로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.784, Figs. 2 and 3). TGF-β1의 발현정도(IL-3/GAPDH)도 천식군에서는 0.18±0.21, 비천식군에서는 0.23±0.32로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.906, Figs. 2 and 3). IFN-γ 또한 천식군에서는 0.41±0.44, 비천식군에서는 0.36±0.22로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.651, Figs. 2 and 3). 마지막으로 GM-CSF 또한 천식군에서는 0.85±0.95, 비천식군에서는 1.10±0.80으로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.125, Figs. 2 and 3).

고     찰

   인간의 기도는 전통적으로 상기도와 하기도로 분류되며, 이 둘 사이에는 기능적이고 구조적인 차이가 있다. 하지만 이러한 상하부 기도에 발생하는 질병사이에 연관성이 있는 경우가 있으며, 천식과 비부비동염이 그 좋은 예가 될 수 있다. 천식환자의 80% 정도가 비부비동에 관련된 증상을 나타내며, 반대로 비염을 가진 환자의 5~15% 정도가 천식을 가지고 있다. 
   천식과 부비동염 사이의 이러한 연관성을 설명하기 위한 기전으로 비-부비동-기도 반사(nasal-sinus-bronchial reflex)나 염증매개물질, 호산구의 침윤 등이 중요한 것으로 알려져 있다.¹⁾ 이중 호산구는 천식에서 기도 점막의 파괴에 중요한 역할을 하며, 호산구를 비롯한 여러 염증세포의 침윤에 있어 interleukin(IL)-4, IL-5, IL-6, tumor necrosis factor-а(TNF-а) 등의 여러 cytokine이 중요한 역할을 한다.⁷⁾
   또한 천식과 만성부비동염을 동시에 지니고 있는 부비동 점막의 경우 호산구가 광범위하게 침습되어 있는 것이 관찰되나, 천식이 없는 부비동 환자에서는 그렇지 않으며, 면역형광염색을 이용한 연구에서 호산구에서 관찰되는 MBP (major basic protein)의 세포 외 침착정도와 부비동 점막의 파괴정도 사이에 대단히 밀접한 연관성이 있다.⁸⁾ 또한 비용종의 병리조직학적 검사상 IL-5, GM-CSF, RANTES가 모두 증가해 있으며, 이 중 알레르기성 비용종의 경우는 IL-5가 비알레르기성 용종에 비해 증가해 있으며, 비알레르기성 용종의 경우 GM-CSF가 더 증가한다.⁹⁾ 게다가 아토피가 있는 부비동염 환자의 비용종에서는 아토피가 없는 환자에 비해 INF-γ가 낮다는 보고도 있어¹⁰⁾ 여러 cytokine이 비부비동염에 관여함을 알 수 있다.
   본 연구에서는 천식을 동반한 비부비동염 환자와 천식을 동반하지 않은 비부비동염 환자에서의 cytokine 발현 양상의 차이를 알아보기 위하여, 각각의 비용종에서 IL-3, IL-4, TGF-β1, IFN-γ, GM-CSF의 발현 양상을 알아보았다. 이 중 IL-4는 IgE 생성에 중요한 역할을 하며 vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)의 생산을 촉진시킨다.¹¹⁾ 또한 B 임파구에서 isotype switch를 유발함으로써 IgE의 생산을 증가시키며 IL-3와 함께 인간의 호염기구와 호산구의 성장을 촉진시키는 반면 IFN-γ는 IL-4의 이러한 작용을 방해한다.¹²⁾ GM-CSF는 비만세포의 분화, 증식에 관여하며 IL-5등과 함께eosinophilia를 야기시킨다.¹³⁾ TGF-β1은 상피세포의 증식을 조절하고 세포외 기질형성을 촉진시키며 혈관형성을 유발하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾
   본 실험에서는 모든 cytokine이 천식군과 비천식군 사이에서 차이를 보이지 않았으며, 수술 전 전산화단층촬영상 병변의 정도도 차이가 없었다. 저자들은 이전의 임상적 관찰이나 연구를 통하여 비부비동염이 천식과 흔히 동반되고, 천식 자체가 부비동염의 증상을 악화시키며, 비점막의 병리조직학적 연구에서 천식군에서 비천식군에 비해 현저한 기저막 두께의 증가 및 배세포 증식, 그리고 심한 호산구 침윤의 소견을 관찰하였다.^3)6)15) 하지만 조직학적인 소견에 비하여 이에 관계된 것으로 생각되는 cytokine들의 차이는 관찰되지 않았다. 이에 대한 원인은 여러 가지 면에서 생각해 볼 수 있다. 먼저 생각해 볼 수 있는 것은 비용종의 병리기전이 일반 비점막에서의 그것과 다르다는 점이다. 실지로 Lee 등¹⁶⁾은 비용종에서 IL-3, -4, -6와 TGF-β1이 일반 비점막보다 증가해 있음을 보고하였으며, 알레르기성 비용종과 비알레르기성 비용종의 차이는 관찰할 수 없었다고 보고하였다. 또한 Hamilos 등도 비용종에서 일반 비점막에 비하여 RANTES, IL-3, GM-CSF 등이 증가해 있음을 보고하였다.⁹⁾¹⁷⁾ 그러므로 비용종의 병리기전에 의해 발생하는 cytokine의 수준에 의해 천식군과 비천식군의 차이가 가려질 수 있고, 또한 수술 후 경과에 영향을 미치리라 생각되는 요인은 비용종보다는 비점막에서의 병리소견이 더 중요할 것이라 생각되어 이에 대한 추후 연구가 필요하다고 생각된다.
   다음으로 생각해볼 수 있는 요인은 천식군 환자들에 있어서 간헐적이기는 하지만 천식조절을 위한 술 전 6개월 이상의 스테로이드 사용병력이다. 비용종 환자에 있어 prednisolone 등의 스테로이드의 사용은 호산구의 apoptosis를 조장하여 비용종 내의 호산구 수를 감소시키며, 또 GM-CSF, IL-5 등의 cytokine의 양도 감소시킨다.¹⁸⁾¹⁹⁾ 본 실험에서 천식환자에 있어서 술 전 스테로이드의 사용이 비용종의 호산구증다증이나 cytokine 발현을 감소시켰을 가능성이 있다.
   또한 생각해 볼 수 있는 요인으로 천식군에서도 알레르기 피부반응검사상 양성인 atopic asthma 군과 그렇지 않은 intrinsic asthma 군 사이에서는 cytokine 수준의 차이가 날 수 있다는 것이다. 실지로 Hamilos 등의 연구에서 천식을 동반한 비부동염 환자에서 알레르기 피부반응 검사상 양성인 군과 음성인 군 사이에서 IL-5 수준의 차이를 보고하였으며,¹⁷⁾ Jyonouchi 등도 비부비동염의 cytokine에 대한 연구에서 IFN-γ 수준이 높은 군에서 그렇지 않은 군보다 atopy를 가질 확률이 높다고 보고하였다.¹⁰⁾ 하지만, Riccio 등은 천식을 동반한 만성 부비동염환자 중 atopic asthma 군과 그렇지 않은 intrinsic asthma 군 사이에서 IL-4와 IFN-γ 수준의 차이가 없다고 보고하여²⁰⁾ 논란의 여지가 있다고 생각한다.

결     론

   천식을 동반한 만성 비부비동염 환자의 비용종에서 발현되는 cytokine들 중 IL-3, -4, TGF-β1, IFN-γ, GM-CSF의 발현 양상을 조사하였으며, 천식을 동반한 환자와 그렇지 않은 환자 사이의 발현 양상에 있어 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았고, 술전 비용종의 정도에서도 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 

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