교신저자：오승하, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   미토콘드리아 유전자 점 돌연변이(point mutation)는 증후군성과 비증후군성 유전성 난청에서 중요한 역할을 한다고 이미 여러 보고에서 밝혀진 바 있다. 1989년 Higashi 등¹⁾이 모계 유전되는 이독성 난청 환자를 보고한 이래로, 1993년 Prezant 등²⁾은 아미노글리코시드 이독성 난청의 소인을 보이는 중국의 2가계와 모계 유전되는 선천성 난청을 보이는 아랍-이스라엘계 1가계에서 정상인에서는 전혀 발견되지 않으면서 3가계에 공통적으로 나타나는 미토콘드리아 유전자 1555 A→G 염기 서열 변이를 발견하였다. 이 미토콘드리아 유전자 변이는 Fischel-Ghodsian(1993),³⁾ Usami(1997),⁴⁾ Estivill(1998) 등⁵⁾에 의하여 재차 증명되었다. 
   청력 손실과 관련된 미토콘드리아 유전자의 변이 중, 1555A→G의 돌연변이는 아미노글리코시드 이독성에 대한 선천적인 소인을 설명하는 중요한 변이로 생각되며, 아미노글리코시드에 대한 노출이 없이도 이 돌연변이를 가진 사람에서 심각한 청력 손실이 올 수 있다는 보고들이 발표되었다.⁴⁾⁵⁾
   한국인에서는 모계 유전되는 난청을 보이는 한 가계에서 미토콘드리아 유전자 1555 A→G 염기 서열 변이가 보고된 바 있다.⁶⁾
   이외에도 미토콘드리아 유전자 3243 A→G의 변이는 당뇨, MELAS(mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) 등의 질환과 연관되며 역시 청력의 손실을 초래할 수 있는 변이로 알려졌고,⁷⁾⁸⁾ 7445 A→G의 변이는 손발바닥 각피증(palmoplantar keratoderma)과 연관되며, 청력 손실을 가져올 수 있다고 보고되었다.⁹⁾¹⁰⁾ 
   현재 난청과 연관된 미토콘드리아 유전자 변이에 대한 연구는 크게 세 분야로 나눌 수 있는데, 첫째 비증후군성 감각신경성 난청 환자에서 그 실제 빈도가 어느 정도인가, 둘째 선별 검사(screening test)에 의하여 미리 이러한 유전적 소인을 가지고 있는 사람을 파악하고 예방하는 방법은 무엇인가(genetic counselling), 셋째 미토콘드리아 유전자의 변이가 고도의 난청으로부터 정상 청력까지 다양한 표현형을 나타내는 병리 기전(pathogenesis) 또는 그 결정 요소가 무엇인가를 밝혀내는데 초점을 맞추어 진행되고 있다. 
   이에 본 연구는 위와 같은 일련의 연구의 첫 단계로서 한국인 비증후군성 감각신경성 난청 환자에서 미토콘드리아 유전자 점 돌연변이의 빈도를 알아보기 위하여 고안되었다.

대상 및 방법

   1995년 6월부터 2001년 6월까지 감각신경성 난청을 주 증상으로 서울대병원 이비인후과 외래를 방문한 환자 129명을 대상으로 하였고 이중 46명에서 난청의 가족력을 가지고 있었다. 대상 환자 129명에 대하여 유전자 검사를 위한 말초 혈액을 채취하였고, 난청의 가족력을 가지는 환자 46명의 가족 90명에 대하여서도 환자와 보호자의 동의를 얻어 말초 혈액을 채취하였다(Fig. 1).
   감각신경성 난청과 함께 증후군성 신체 이상 소견을 보이는 환자는 대상 환자에서 제외를 하였고, 정상 대조군으로 난청을 보이지 않고 가족력이 없는 정상인 70명의 혈액을 동시에 검사하였다. 모든 환자에 대하여 경구 또는 주사 형태의 항생제 투여 여부 및 난청의 발생시기에 대하여 조사하였으며, 청력검사를 시행하였다. 한편 일반 혈액검사를 통하여 간기능과 신장기능이 정상임을 확인하였다. 
   말초 혈액에서 분리된 유핵 세포로부터 genomic DNA를 추출하고자 말초 혈액내 유핵 세포를 3% dextran이 들어있는 생리 식염수로 분리하였다. 남아 있는 적혈구는 저장(0.2%) 식염수를 이용하여 용혈시켜 제거하고 얻어진 백혈구를 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)로 처리한 후 phenol/chloroform/isopropanol을 이용하여 genomic DNA 를 추출하였다. 
   백혈구로부터 추출된 genomic DNA를 template로 하여 mitochondrial 12S rRNA 유전자의 3’쪽 일부와 인접한 tRNAVAL유전자의 전장 및 16S rRNA 유전자의 5'쪽 일부를 포함하는 약 359 bp fragment의 미토콘드리아 DNA 를 PCR법으로 증폭하였다. PCR의 primer는 forward：5' AGA CGT TAG GTC AAG GTG TA 3', reverse：5' GTT TAG CTC AGA GCG GTC AA 3'(한국생공, 청원)을 주문제작하여 사용하였다. PCR산물은 우선 Bsm A1 (New England Biolabs, UK) 제한 효소로 처리하고 겔 전기영동하여 제한 절편 양상을 확인하였다. 제한 절편 양상이 정상과 다른 PCR 산물은 pT7 Blue T-vector(Novagen, USA)로 cloning한 후 DNA sequencing을 하여(ABI automatic sequencer, USA) 12S rRNA 유전자 내 1555번 염기 서열에서의 돌연 변이를 확인하였다.
   3243번의 염기 서열의 변이는 PCR primer로 forward：5' AGG ACA AGA GAA ATA AGG CC 3', reverse：5' TAG AAG AGC GAT GGT GAG AG 3'(한국생공, 청원)을 사용하여 mitochondrial DNA를 증폭시켰다.(AccuPowerTM PCR PreMix, Bioneer, USA) 증폭된 428 bp 단편은 제한효소 Apa I(Beohringer-Mannheim, Germany)을 사용하였고 제한 절편의 양상이 정상과 다른 PCR 산물은 직접 염기 서열 분석(ABI 373 DNA Sequencer, USA)으로 변이를 확인하였다.
   7445번의 염기 서열의 변이는 PCR primer로 forward：5' CTT CCC ACA ACA CTT TCT CG 3', reverse：5' GTA AAG GAT GCG TAG GGA TG 3'(한국생공, 청원)을 사용하여 mitochondrial DNA를 증폭시켰다.(AccuPowerTM PCR PreMix, Bioneer, USA) 증폭된 664 bp 단편은 제한효소 Xba I(Beohringer-Mannheim, Germany)을 사용하였고 제한 절편의 양상이 정상과 다른 PCR 산물은 직접 염기 서열 분석(ABI 373 DNA Sequencer, USA)으로 변이를 확인하였다.

결     과

   비증후군성 감각신경성 난청 환자 129명 중에서 1555 A→G 미토콘드리아 점 돌연변이는 3명에서 발견하였으며(3/129, 2.3%), 3243 A→G 미토콘드리아 점 돌연변이는 1명에서 발견되었으나(1/129, 0.78%) 7445 A→G 미토콘드리아 점 돌연변이는 발견되지 않았다(0/129, 0%).
   환자의 가족을 포함하여 46가계 총 219명 중에서는 1555 A→G 미토콘드리아 점 돌연변이는 위의 3명을 포함하여 3가계 13명이었고 3243 A→G 미토콘드리아 점 돌연변이는 1명이었다(Fig. 2).
   각 가계의 구성원들은 청력검사를 통하여 청력을 평가하였는데 각 구성원의 청력 정도는 고도의 난청에서부터 정상 청력까지 다양하게 나타났다(Fig. 2).
   난청을 보이지 않고 가족력이 없는 정상 대조군 70명을 대상으로 미토콘드리아 점 돌연변이 여부를 위와 동일한 방법으로 검사한 결과 미토콘드리아 점 돌연변이는 관찰되지 않았다.

고     찰

   본 연구는 한국인 비증후군성 감각신경성 난청 환자에서 미토콘드리아 유전자 점 돌연변이의 빈도를 알아보기 위하여 고안되었다.
최근 일본에서 발표된 바에 의하면 감각신경성 난청을 주소로 외래로 내원한 환자를 대상으로 미토콘드리아 유전자 점 돌연변이의 빈도를 조사한 결과 1555 A→G는 3.45%(11/319), 3243 A→G는 0.314%(1/319), 7445 A→G는 0%의 빈도를 보였다. 또한 인공와우 이식을 받은 환자를 대상으로 하였을 경우 140명 중 14명(10%)에서 1555 A→G 변이가 발견되었다.¹¹⁾
   같은 저자의 다른 발표에서 아미노글리코시드 이독성 난청을 보이는 5가계 32명 중에서 28명에서 1555 A→G 변이가 증명되었고, 대조군 100명의 미국인에서는 1555 A→G 변이가 발견되지 않았다는 사실을 기초로 동양인과 아랍계에서 이 변이가 많다고 추정하였다.⁴⁾
   하지만 Estivill 등⁵⁾은 감각신경성 난청을 가진 스페인계 70가계를 분석한 결과 19가계에서 1555 A→G 변이를 발견하여 이 변이가 특정 인종에만 선택적으로 나타나는 변이가 아니라고 발표하였다. 특정 인종에서만 많이 발견되었다는 보고는 선천성 난청에 국한하여 연구하였을 때 나타나는 오류라고 지적하였으며 후천성 난청(late-onset hearing loss)의 상당부분이 1555 A→G 변이에 의하여 나타날 수 있다고 하였다.⁵⁾
   1555 A→G 변이에 대한 보고는 이후에 여러 나라, 다양한 인종에서 보고되어서 특정 인종에 국한되어 나타나는 변이가 아니라는 사실은 현재 보편적으로 인정되고 있다.¹²⁾
   3243 A→G 변이의 빈도는 당뇨병 환자의 약 1%, 당뇨와 난청을 같이 가진 환자에서 4.76%에서 발견되며, 3243 A→G 변이를 가지고 있는 당뇨 환자의 61%에서 난청을 보인다.¹¹⁾¹³⁾
   7445 A→G 변이는 비증후군성 감각신경성 난청과 관련되어 동양권에서 발견된 보고는 아직 없다.¹¹⁾
   본 연구에서는 외래로 내원한 환자 중 동반된 다른 질환이 없고 감각신경성 난청을 보이는 환자를 대상으로 1555 A→G 변이는 2.3%, 3243 A→G 변이는 0.7%, 7445 A→G 변이는 0%로 빈도가 조사되었다. 이 결과는 위에서 언급한 Usami 등의 발표와 비교하여 볼 때 거의 유사한 빈도를 보여,¹¹⁾ 일본인과 한국인 간 유전적 배경의 유사성에 의한다고 생각된다. 하지만, 대상 모집단의 차이와 충분치 못한 모집단의 설정, 대상이 되는 병원의 성격 및 그에 따른 내원 환자의 특성 등에 의하여 빈도의 차이가 나타날 수 있으므로 더 많은 수의 모집단을 정확한 기준으로 조사하는 연구가 향후 필요하리라 생각된다.
   미토콘드리아의 유전자 변이를 가진 환자의 난청 발현에 대하여는 지금까지 여러 연구가 발표되었지만 여전히 확실한 기전이 밝혀지지는 않은 상태이다.
   Prezant 등²⁾은 1555 A→G 변이가 미토콘드리아 12S rRNA 구조를 E. coli의 16S rRNA와 유사하게 변형을 시켜서, 아미노글리코시드와 정상보다 강하거나 비가역적인 결합을 유발하고 그 결과 단백질 합성을 저해함으로써 난청을 발현한다고 하였다. 특히 정상인에게는 이독성이 없는 소량의 아미노글리코시드가 투여되더라도 1555 A→G 변이를 갖는 환자에서는 와우 유모 세포와 같은 특정 조직에서 미토콘드리아 단백질 합성 체계의 장애가 발생하여 난청이 나타난다고 설명하였다. 또한 같은 연구에서 아랍-이스라엘 가계의 분석을 통하여 1555 A→G 변이의 발현에 어떤 열성 조절 인자(recessive modifying nuclear factor)가 관여하리라 추정하였다. 위의 두 기전에 의해 미토콘드리아의 전사(translation)가 감소하고 표현형이 결정된다고 생각하였다.²⁾
   Estivill 등⁵⁾은 후천성(late onset) 감각신경성 난청을 가진 가계 구성원에서 1555 A→G 변이를 발견하였고 30세까지 약 50%, 65세까지 약 88%의 표현 정도(penetrance)를 보고하였다. 이 결과를 바탕으로 1555 A→G 변이는 연령과 연관된 표현 정도(age-dependent penetrance)를 보이며 난청의 발현에 보조적인 역할을 한다고 결론을 내렸다.⁵⁾
   Usami 등⁴⁾은 1555 A→G 변이를 가진 환자에서 아미노글리코시드의 노출 병력없이도 고음역의 진행성 난청이 나타남을 관찰하고 1555 A→G 변이가 난청에 직접적인 역할을 하기 보다는 일반적인 소인 만을 제공한다고 하였다. 개인 간 표현형의 다양성은 외부 요인에 반응하는 개인 간의 차이, 유전적 차이(genetic constitution) 등 여러 요소에 의하여 결정되며, 1555 A→G 변이가 유전자의 표현형의 결정에도 영향을 줄 수 있어서 1555 A→G 변이가 동반될 경우 더 심한 난청이 나타난다고 하였다. 그 기전으로 1555 A→G 변이가 전사(translation)의 효율을 감소시키고, 그 결과로 나타나는 와우 손상에 대한 복구 능력의 저하가 임상 양상의 발현에 중요하다고 추정하였다.⁴⁾
   Tsuiki 등¹⁴⁾은 1555 A→G 변이를 가지는 환자의 청력 양상을 기술하여 발표하였는데 임상 양상이 가족성 진행성 감각신경성 난청의 양상과 유사함을 보고하였다. 이러한 시간의존성 변화(time-dependent change)에 근거를 두고 1555 A→G 변이는 아미노글리코시드에 대한 민감성을 가지기 보다는 난청 전반에 대한 소인을 보인다고 추정하였다.¹⁴⁾
   미토콘드리아 돌연변이가 확인된 대상 환자에서 임상 양상의 차이를 확인하고자 본 연구에서는 1555 A→G의 변이를 가지는 3가계의 구성원들의 청력을 분석하였다. 그 결과 다른 연구 발표와 동일하게 다양한 청력 양상을 보였고 미토콘드리아 유전자 변이 자체가 표현형을 직접 결정하지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다. 하지만 위의 다른 연구에서 발표되었던 바를 근거로 1555 A→G 변이가 난청의 직접적인 요소가 아니고 시간에 따른 보다 일반적인 유전적 소인으로 작용한다고 생각한다면 동일한 가계 내에서는 한 개인의 표현형 발현 정도는 외부 조건이 유사할 경우 가계 내의 난청을 가진 다른 구성원의 난청 진행 양상과 유사하게 발현되리라 추정할 수 있다. 또한 나이에 따른 청력의 변화, 아미노글리코시드 등의 외부 요인에 대한 개인적 감수성 등이 가족 구성원 내에서는 유사하리라 생각된다.¹⁴⁾ 이러한 추론은 앞으로 더 많은 수의 미토콘드리아 유전성 난청 환자를 대상으로 하는 장기적 연구에 의하여 보다 명확하여 질 것이다.
   최근에 발표된 Giordano 등¹⁵⁾의 미토콘드리아와 핵(nuclear background)을 분리한 후 여러 조합의 혼합체(hybrid)를 만들어 비교한 논문을 보면, 1555 A→G 변이 자체는 미토콘드리아의 호흡 기능(respiratory chain) 장애를 유발하지 않는다는 결과를 발표하였고, 와우 내의 어떠한 조직 특이적 요소(tissue specific factor)가 핵과 미토콘드리아 상호작용(nuclear-mitochondrial interaction)에 영향을 미쳐 임상 발현을 제어하는 것이 아닌가 라고 추론하고 있다. 이러한 조직 특이성(tissue specificity)에 대한 연구로서는 최근 Kitamura 등¹⁶⁾이 3243 A→G 미토콘드리아 유전자 변이를 가지고 있는 환자의 사망 후 부검을 통하여 내이 내에서의 미토콘드리아 유전자 분석 결과를 발표한 바 있다. 아직 임상 양상 발현의 기전을 충분히 설명하지는 못하지만 향후 내이 조직 내의 미토콘드리아 DNA 연구가 그 기전을 설명하는데 중요한 단서를 제공하리라 생각된다. 

결     론

   외래로 내원한 비증후군성 감각신경성 난청 환자를 대상으로 미토콘드리아 유전자 점 돌연변이를 분석한 결과 1555 A→G 변이는 2.3%, 3243 A→G 변이는 0.78%에서 발견되었고 7445 A→G 변이는 관찰되지 않았다. 1555 A→G 변이를 가지는 동일한 가계 내의 구성원들에서는 동일한 미토콘드리아 유전자 점 돌연변이에도 불구하고 다양한 난청의 정도를 보였다. 미토콘드리아 유전자 변이에 의한 임상 양상의 발현 기전과 영향을 주는 요소에 대하여는 향후 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.

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