교신저자：이재훈, 570-711 전북 익산시 신용동 344-2  원광대학교 의과대학 이비인후과교실
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서     론

   알레르기 비염은 비점막에 호산구, T 림프구의 축적을 특징으로 하는 염증성 질환이다.¹⁾ 염증성 세포들 즉 호산구, T 림프구들이 알레르기 점막의 축적에 chemotactic cytokines인 chemokine들이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.¹⁾ CC chemokines 중의 하나인 MCP-1은 염증성 세포들 중 주로 단핵세포(monocytes), 기억 T 세포(memory T cells) 및 자연살 세포(natural killer cells)에 작용하는 중요한 화학주성 인자(chemotactic factor)로 알레르기 병변에 이러한 세포들의 선택적인 동원(selective recruitment)에 관여한다.²⁾ 또한 히스타민의 유출을 증가시켜 과민 반응을 야기하고 류코트리엔 C4-중개성 경로(leukotriene C4 -mediated pathway)를 유도할 수 있다. 이러한 매개체들은 알레르기 질환을 악화시키는데 중요한 역할을 한다.³⁾ MCP-1은 호산구의 화학주성 및 방출을 직접적으로 유도하지는 않으나 Th2형 세포에서 생산하는 IL-4, 5를 통해 호산구의 활성화와 화학주성에 영향을 줄 수 있다.⁴⁾
   여러 가지의 항원에 의한 염증성 자극에 반응하여 MCP-1 발현 수준이 증가 될 수 있으며 유전자 다형성의 아형에 따라 전사 활동(transcriptional activity)에 영향을 받을 수 있다.⁵⁾ MCP-1의 position -2518(distal gene regulatory region)에서 양측 대립유전자 adenine/guanine(biallelic A/G)의 유전자 다형성에 따라서 MCP-1의 생산에 영향을 준다.⁵⁾ IL-1β와 같은 사이토카인으로 염증 자극을 준 후 A/A 동형접합체(homozygote)로부터의 단핵세포보다 G 대립인자를 가진 개인들에서의 단핵세포에서 MCP-1의 생성량이 증가하게 되는데,⁵⁾ 이는 MCP-1의 position -2518 에서 adenine이 guanine으로 돌연변이가 일어나게 되면 이 유전자의 전사 활동에 영향을 주기 때문이다.⁵⁾ MCP-1의 수용체인 CCR2의 codon 64에서 isoleucine이 valine으로 바뀌는 단독 누클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism)이 보고 되었다.⁶⁾
   이러한 유전자 다형성은 인종에 따라 차이가 있는 것으로 알려져 있으며,⁵⁾⁷⁾⁸⁾ 지역 및 노출된 항원에 따른 환경적 요인들에 의해서도 차이가 있을 수 있다. 최근에 천식 및 아토피성 피부염과 같은 알레르기 질환들에서 다른 인종의 MCP-1 유전자 다형성에 대한 연구들이 보고 되었으나,⁹⁾¹⁰⁾ 알레르기 비염을 대상으로 한 연구는 없었다. 그래서 본 연구는 한국인의 정상 대조군의 빈도를 기본으로 하여 MCP-1 및 CCR2의 다형성 유형 빈도를 조사하여 각 아형간의 상대적 위험도를 측정함으로써 한국인 알레르기 비염 환자에서 개인의 유전적 감수성과의 연관성을 규명하고 유전적 감수성이 상대적으로 높은 고위험군으로서의 중요한 표식자(marker)로 이용할 수 있는지 알아보고자 하였다. 또한, 돌연변이형(mutant type)인 MCP-1 -2518G 대립인자와 CCR2 A 대립인자의 한국인 정상대조군에서의 빈도를 구하여 다른 인종들과 비교하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험군은 2002년 1월부터 2002년 12월까지 알레르기 비염의 증상으로 원광대학병원 이비인후과를 방문하여 피부반응검사에서 알레르기 비염으로 확진된 198명을 대상으로 하였다. 대조군은 건강 검진을 위해 본 병원을 방문한 278명을 대상으로 하였고 설문지를 통해 알레르기 질환의 증상을 포함한 기타 질환들과 피부 단자 검사에 음성을 보인 경우로 하였다. 평균 연령은 대조군에서 27.2±11.6세, 실험군에서 28.3±9.5세로 통계학적 차이가 없었으며, 남녀성비는 대조군은 남：여=145：133, 실험군은 남：여=102：96으로 통계학적 차이가 없었다.

방  법

MCP-1 유전자형 분석
   혈액에서 genomic DNA를 추출하여 제한효소 Pvu II를 사용하였으며 restriction fragment length polymorphism(RFLP)으로 확인하였다. PCR primer 는 Pvu II 제한 부위를 생성하는 두 가지 primer, 즉 Forward primer 5'-TCT CTC ACG CCA GCA CTG ACC-3' Reveres primer 5'-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3'를 사용하였다. PCR 증폭 후 234 bp의 산물을 얻었다. PCR 반응 조건은 genomic DNA 100 ng, dNTP 혼합체 0.25 mM, MgCl₂ 2.0 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, Taq polymerase 1.0 unit을 섞어 총 용량이 20 μl로 하였다. 온도 조건은 초기 denaturation 95℃, 5분 반응 후 94℃ 30초, 63℃ 30초, 72℃ 30초를 35회 반복한 후 마지막 extension 75℃ 5분 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물 2 μl에 Pvu II 5 unit를 섞어 총 용량이 20 μl가 되게 하여 37℃에서 6시간 반응시켰다. 다음날 반응산물 10 μl을 12% PAGE gel에서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색 후 최종 유전자형을 확인하였다(Fig. 1).

CCR2 유전자형 분석
   혈액에서 genomic DNA를 추출하여 제한효소 BsaBI를 사용하였으며 restriction fragment length polymorphism(RFLP)으로 확인하였다. PCR primer는 BsaBI 제한 부위를 생성하는 두 가지 primer, 즉 Forward primer 5'-TTG TGG GCA ACA TGA TGG-3' Reveres primer 5'-CTG TGA ATA ATT TGC ACA TTG C-3’를 사용하였다. PCR 증폭 후 183 bp의 산물을 얻었다. PCR 반응 조건은 genomic DNA 100 ng, dNTP 혼합체 0.25 mM, MgCl₂ 2.0 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, Taq polymerase 1.0 unit를 섞어 총 용량이 20 μl로 하였다. 온도 조건은 초기 denaturation 95℃ 5분 반응 후 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 35회 반복한 후 마지막 extension 75℃ 5분 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물 2 μl에 BsaBI 5 unit를 섞어 총 용량이 20 μl가 되게하여 37℃에서 6시간 반응시켰다. 다음날 반응산물 10 μl을 2.5% agarose gel에서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색 후 최종 유전자형을 확인하였다(Fig. 2).

통계처리
   MCP-1 및 CCR2의 다형성 분포 차이에 대한 평가 및 상대적 위험도 차이의 평가를 위해 χ²를 사용하였으며 odds ratio를 구하여 각 유전자 다형성 및 유전자 다형성의 조합에 따른 상대적 위험도를 측정하였다. 모든 통계 처리는 SPSS program version 10(SPSS Inc. Chicago, IL, U.S.A.)를 이용하였다.

결     과

MCP-1 유전자 다형성 유형 분포
   환자군에서 MCP-1 유전자형은 G/G형이 45.0%, G/A형이 42.9%, A/A형이 12.1%였고, 대조군에서는 G/G형이 40.0%, G/A형이 48.5%, A/A형이 11.5%로 두 군사이에 유의한 차이는 없었으며 두 군의 A/G 대립인자의 비교에서 환자군에서 대조군에 비해 G 대립인자의 증가된 소견을 보였으나 두 군사이에 유의한 차이는 없었다(Table 1). 유전자 유형에 따른 상대적 위험도는 G/G 유형에 대해 G/A가 0.94배, A/A가 0.79배로 나타났으며 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(Table 1).

CCR2 유전자 다형성 유형 분포
   환자군에서 CCR2 유전자형은 G/G형이 53.0%, G/A형이 41.4%, A/A형이 5.6%였고, 대조군에서는 G/G형이 50.7%, G/A형이 43.2%, A/A형이 6.1%로 두 군사이에 유의한 차이는 없었으며 두 군의 A/G 대립인자의 비교에서 대조군에서 환자군에서 비해 돌연변이형(mutant type)인 G 대립인자의 증가된 소견을 보였으나 두 군사이에 유의한 차이는 없었다(Table 2). 유전자 유형에 따른 상대적 위험도는 G/G 유형에 대해 G/A가 0.92배, A/A가 0.87배로 나타났으며 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(Table 2).

인종에 따른 MCP-1 -2518G 대립인자의 비교
   한국인 대조군의 MCP-1 유전자의 -2518G 대립인자 빈도는 64%로 서양인(American Caucasian)(29%), 멕시코인(47%), 동양인(47%)보다 높았다.⁵⁾ 이런 결과는 같은 동양인에서 보다 높은 빈도를 보였으며 서양인에 비해 매우 높은 빈도를 높였다(Table 3).

인종에 따른 CCR2 A 대립인자의 비교
   CCR2 유전자의 A 대립인자 빈도는 한국인의 대조군에서 28%로 서양인(12%)¹¹⁾보다 증가되었으며, 같은 동양인인 일본인(24%)¹²⁾과는 유사한 결과를 보였다(Table 4).

고     찰

   알레르기 질환의 발생은 유전적 성향이 강하지만 단독 유전자좌(single gene locus)에 국한된 전형적인 멘델유전(Mendelian inheritance)방식을 보이지는 않으며, 다양한 유전자들의 상호 작용과 환경적인 요인들의 복합적인 과정에 의해 발생할 수 있다.¹³⁾ 또한 노출된 기인 항원에 따른 환경적인 요인들에 의해 연구 집단들 사이에서 차이가 발생할 수 있다.¹³⁾ 이러한 점들이 알레르기 질환의 원인 및 악화에 한가지의 특정한 유전자만이 국한되지 않으므로 유전자 연구에 어려움을 야기할 수 있다. 이런 점에도 불구하고 최근에 알레르기 질환에 대한 유전자 다형성의 감수성에 대한 연구들이 많이 보고 되었다. 이런 연구들은 각각 다른 인종을 대상으로 하는 경우가 많아 인종간의 유전자 다형성 유형이 다름을 알 수 있다.⁵⁾⁷⁾⁸⁾
   최근에 알레르기 질환들에서의 chemokine 들의 역할에 관한 관심이 많아지고 있다.¹⁾ 이러한 chemokine들은 염증세포에 대한 화학주성인자로 작용하며 염증 점막으로의 염증세포의 축적을 야기할 수 있는데 regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted(RANTES), I-309, monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), MCP-2, MCP-3, macrophage inflammatory proteins(MIP)-1α, MIP-1β 그리고 eotaxin 등이 대표적으로 알려져 있다.¹⁴⁾ MCP-1은 단핵세포에 대한 강력한 화학주성인자로 증명되었고,¹⁵⁾ 또한 미분화된 T 림프구들을 Th 2형 세포로 분화을 유도할 수 있다.⁴⁾ 생체 내 및 외 결과에서도 기관지폐포 세척액(bronchoalveloar lavage fluid)에서 MCP-1 수준이 정상 대조군에 비해 천식군에서 높았다.¹⁶⁾ 아토피성 피부염 환자에서도 MCP-1 수준이 정상 대조군에 비해 높았다.²⁾ MCP-1 수준이 dexamethasone을 처리한 군은 낮게, lipopolysaccharide(LPS)를 처리한 군에서는 높게 측정되었다.¹⁷⁾ 이러한 연구결과들은 MCP-1이 알레르기 염증 질환에서 중요한 역할을 하고 있음을 알려준다.
   알레르기 질환들에 대한 MCP-1 유전자 다형성에 대한 최근의 연구결과를 보면 상반된 결과를 보이고 있다.⁹⁾¹⁰⁾ 헝가리인들을 대상으로 한 아토피성 피부염과 천식에서 MCP-1 유전자 다형성과 아토피성 피부염 환자의 유전적 감수성과는 연관이 없는 것으로 보고한 반면,¹⁰⁾ 천식 환자의 유전적 감수성과는 연관이 있는 것으로 보고하였다.⁹⁾ 또한 천식 환자의 증상의 심한 정도와도 연관이 있는 것으로 보고하였다.⁹⁾ 이러한 결과는 알레르기 질환들에서 복합적인 유전적 이질성(genetic heterogeneity)으로 인해 다른 인종들 사이에서 뿐만 아니라 같은 인종에서도 유전자 다형성에 대한 감수성의 차이가 있음을 시사한다.
   본 연구에서 MCP-1과 CCR2 유전자형 분포에 있어서 한국인에서의 대조군과 알레르기 환자군 사이에 유의한 차이가 보이지 않았다. 국내, 외에서 알레르기 비염 환자들을 대상으로 하는 MCP-1 유전자 다형성 연구가 현재까지는 보고 되어 있지 않아 한국인 알레르기 비염 환자들을 대상으로 하는 MCP-1 유전자 다형성 연구 결과를 다른 연구 결과들과 직접적인 비교는 할 수 없었다.
   최근, 인종에 따른 RANTES의 유전자 다형성 연구에서 돌연변이형인 -403A 대립인자가 서양인에 비해 아프리카인에서 통계학적으로 유의하게 증가되어 있음이 밝혀졌으며,¹⁸⁾ 또 다른 연구에서 서양인에 비해 동양인에서 RANTES -403A 및 -28G 대립인자의 높은 빈도를 보고하였다.⁸⁾ 본 연구의 인종에 따른 비교에서 한국인의 MCP-1 유전자의 -2518 G 대립인자 빈도 및 CCR2 유전자의 A 대립인자 빈도가 타인종과 차이가 있음을 알 수 있었다. 이러한 인종에 따른 인구 집단들에서의 대립인자의 차이는 유전자간 혹은 유전자와 환경적인 요소간의 상호작용에 의하여 알레르기 질환의 발생 및 악화에 대한 감수성에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.⁸⁾¹⁸⁾
   본 연구의 저자들은 본 연구의 결과가 다른 인종의 알레르기 비염환자와 비교되기를 바라며 다양한 유전자의 다형성 연구를 통해 알레르기 질환들의 병인과 기전에 대해 더 밝혀져 유전자적인 치료 접근에 도움이 되길 바란다.

결     론

   본 연구의 결과로 보아, MCP-1 및 CCR2 유전자 다형성이 한국인 알레르기 비염의 발생에 있어 개인의 유전적 감수성 결정에 중요한 요소로 작용하지는 않을 것으로 사료된다. 그러나 돌연변이형인 MCP-1 -2518G 대립인자와 CCR2 A 대립인자의 한국인 정상군에서의 발생 빈도가 다른 인종들과 차이가 있음을 알 수 있었다.

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