교신저자：홍성화, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   난청은 전 인구의 4~10%의 유병율을 보이는 가장 흔한 감각성 및 유전성 질환으로¹⁾²⁾ 선천성 난청은 50~60%가 유전적 요인에 의한 것이며 이 중 70%가 비증후군성 양상으로 나타나고 비증후군성 난청의 80%는 상염색체 열성유전을 하는 것으로 알려져 있다.³⁾ 인간에서 상염색체 열성 유전을 하는 난청 유전자를 밝히는 것은 많은 어려움이 있어 인간과 유사한 내이병변을 가진 돌연변이 마우스는 내이의 유전자 연구에 있어서 주요한 모델이 되어왔다.⁴⁾ 현재까지 인간 비증후군성 난청과 관련된 64개의 유전자 위치가 밝혀졌고 20여개의 유전자가 관련된 것으로 보고되었으나 그것과 연관된 마우스 모델은 현재 8개에 불과하다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾ Ames waltzer(av), Bronx waltzer(bv), shaker-1(sh-1), spinner(sp), and bustling(bus) mice를 포함한 몇몇 돌연변이 마우스들이 선회 행동과 내이 이상을 보이는 것으로 보고 되었다. Shaker-1 마우스는 myosin VIIA에 돌연변이를 가진 것으로 인간에서 Usher 1B 증후군과 DFNB2와 관련된 마우스 모델이다. Shaker-2는 DFNB3의 마우스 상동체로 여겨지고 있다.⁵⁾⁶⁾ 이러한 돌연변이 마우스에서 나타나는 독특한 행동양상은 내이 이상에 의한 것으로 여겨지고 있어, 내이의 형태학적 변화 역시 기대할 수 있다.
   최근 저자들은 우리나라에서 처음으로 circler mouse(Shaker-Waltzer 증후군의 증상을 보이며 'cir' 마우스라 명명함)를 발견하였다.⁷⁾ 이 cir 마우스는 상염색체 열성 유전을 하며 출생 약 7일경부터 선회행동을 보인다. 마우스 유전체에 대한 유전자 지도의 완성은 새로 발견되는 돌연변이 마우스에서의 원인 유전자 위치를 쉽게 알수 있게 해주었는데 cir 유전자의 위치는 미세위성 지표에 의해 정교하게 작성되었으며 완성된 유전자 지도를 통해 원인 유전자가 다른 돌연변이 마우스와 다르게 9번 염색체의 60.1 cM(D9mit116과 D9mit38 사이)에 존재함을 알 수 있었다.⁷⁾ 이 유전자 지도의 완성은 위치적 클로닝을 용이하게 할 뿐만 아니라 사람에서 발생하는 비증후군성 난청 유전자가 cir와 상동인지 밝히는데 도움을 줄 수 있을 것이다.
   Spinner 돌연변이 마우스(sr)는 C57BL 마우스 군체에서 40여년전 우연히 발견되어으며 양방향으로의 선회 행동과 머리 동요를 포함한 행동 이상을 보인다.⁸⁾ 최근 Mitchem KL 등에 의해 원인 유전자가 9번 염색체의 60.1 cM(D9mit348과 유전자 pthr1(parathyroid hormone receptor) 사이)에 존재함이 밝혀졌다.⁹⁾
   저자들은 cir 돌연변이 마우스의 생물학적 특성을 알아보기위해 순종 circler 마우스의 행동학적 양상 및 광학 및 전자현미경을 이용한 순종의 circler 마우스(cir/cir)와 spinner 마우스(sr/sr), 두 유전자의 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr)의 나이에 따른 조직형태학적 변화를 정상 마우스와 비교분석하였으며 중합효소연쇄반응 및 complementation 실험을 포함한 유전학적 분석을 통해 spinner 유전자와 근접한 부위에 위치한 circler 마우스에서의 유전자를 밝히고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물

cir 마우스
   cir 마우스는 ICR 이종 교배에 의해서 처음 발견되었고 이환된 형제들 사이의 교배로 15대까지 가톨릭대학교 의과대학 의과학연구소 실험동물실에서 유지하였다. 실험에 사용된 cir 마우스는 상업용 사료와 수돗물 및 적정 온도, 습도 그리고 광원(24±0.5℃, 55±5%, and 12：12 light/dark cycle with lights on at 08：00)에서 사육되었다. 동물처치는 동물관리 및 사용 연구소(IACUC)의 동의를 얻어 시행되었다.

sr 마우스
   모든 spinner는 circler 마우스와 같은 조건에서 유지 및 사육되었다. 동물처치는 동물관리 및 사용 연구소(IACUC)의 동의를 얻어 시행되었다.

Complementation 실험
   몇몇 번식된 쌍들이 서로 교차되었다：(+/sr×+/cir), (+/cir×+/sr) and(sr/sr×cir/cir). 각각의 돌연변이에 대해, 정상 표현형의 마우스와 알려진 이형 접합체끼리 교차실험을 함으로써 돌연변이 대립형질을 가진 이형 접합체들을 확인하였다.

청능 뇌간 유발 검사
   청력은 청능 뇌간 유발 검사(Spirit, Nicolet, WI, USA)에 의해 평가되었다. 생후 3개월된 성인 마우스가 검사에 사용되었으며 마취는 xylazine(5 mg/kg)과 ketamin(40 mg/kg)의 혼합물에 의해 근육내 주사로 행하여졌다. 청능 뇌간 유발 검사 파형의 기록을 위해 피하 전극들을 검사하고자 하는 귀의 귀바퀴 뒷면(reference electrode), 두정부(active electrode), 그리고 경부의 뒷면(ground electrode)에 각각 부착하였다. Rarefaction 클릭음이 착용한 이어폰을 통해 귀안으로 전달되었다(Pulse width, 100 μs；repetition rate, 11.1 Hz). 대조 정상군과 순종의 circler 마우스(cir/cir)에서 확실한 파형을 얻기위해 60, 80, 100 dB SPL의 순음 청력을 주었다. 반응은 주로 150 Hz와 3000 Hz의 경계를 가진 bandpass 필터를 사용하여 유용하게 기록할 수 있었다.

조직병리학적 분석
   순종의 circler 마우스(cir/cir)와 spinner 마우스(sr/sr), 두 유전자의 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr)에서, 나이별로 내이 조직병리를 분석하기 위해 서로 나이가 다른 다섯 군(생후 10일, 18일, 21일, 35일, 90일)의 돌연변이 마우스가 실험에 사용되었다. 각 군별로 세 마리의 마우스를 사용하였으며 대조군으로 세마리의 정상 마우스를 사용하였다. 모든 마우스는 xylazine(5 mg/kg)과 ketamin(40 mg/kg)의 혼합물에 의한 근육내 주사로 마취하였다. 심장을 통하여 2.5% glutaraldehyde와 4% paraformaldehyde로 관류 고정 후 측두골을 채취하였다. 4℃의 같은 고정액에서 하루밤, 1% OsO₄에서 1시간 동안 고정시킨 후 10% EDTA용액에 탈회를 시행하였다. 내이 조직은 광학현미경하에서 코르티기관과 주변 조직들을 조심스럽게 박리한 이후 파라핀 블록을 제작하였다. 파리핀 블록에서 4 mm 두께의 절편을 중심 와우축 방향으로 박절하여 Hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 시행한 후 광학현미경하에서 코르티기관과 나선 신경절의 퇴행변화를 반정량적으로 분석하였다. 여러 중심 와우축 방향의 절편중, 가장 대표적인 세개의 절편을 한 마우스로부터 임의적으로 선택하였다. 와우 기저회전부와 중간회전부의 코르티기관과 나선 신경절 세포가 정량적인 측정을 위해 포함되었으며 구조적인 형태 변화가 심한 첨부회전부는 정량적인 측정에서 제외하였다. 나선신경절 세포의 수적 감소를 알아보기 위해 circler 마우스와 정상 마우스의 Rosenthal’s canal 안 신경세포 부피비를 point counting방법으로 측정하였다. 코르티기관이 평가된 같은 절편에서 광학현미경을 400배로 확대하여 Rosenthal’s canal을 관찰하였다. 10×10 μm counting grid를 사용하여 나선 신경절 세포들의 부피 비는 신경세포체와 교차되는 총 grid 선을 센 값을 주어진 절편에서 전체 Rosenthal’s canal의 범위안에 들어있는 총 grid 선 수로 나누어서 구하였다. 말초 평형기관을 평가하기 위해 생후 90일된 circler 돌연변이 마우스의 팽대부릉과 구형낭반을 선택하였다. 이 절편들의 전반적인 해부학적 형태를 광학현미경상에서 분석하였다. 또한 내이의 각 부위를 임계점 탈수시킨 후에 주사전자현미경(scanning electron microscopy, Hitachi, S-2460N)을 이용하여 와우 및 전정기관의 손상 정도와 형태를 반정량적으로 관찰하였다.

유전자적 분석

Genomic DNA의 추출
   Circler 돌연변이 마우스 꼬리에서부터 유전체 DNA를 분리시키기 위해, 꼬리 조직을 55℃, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM EDTA, 0.5% SDS와 500 μg/ml proteinase K가 들어 있는 lysis buffer에서 하루밤 동안 배양하였다.¹⁰⁾ 그후 DNA는 phenol과 phenol/chloroform으로 발췌하여 정제시킨 다음 두배의 ethanol을 이용하여 침전시켰다. 침전된 DNA는 500 μl의 TE buffer(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹인 후, RNA를 없애기 위해 37℃, 10 μl의 1 mg/ml DNase-free RNase와 함께 5시간 동안 배양한 후 DNA의 농도를 260 nm와 280 nm의 파장에서 측정하였다.

Genomic 중합효소연쇄반응 분석
   중합효소연쇄반응시 사용한 primer는 Tmie 유전자의 전체 coding 염기서열을 포함하는 5'-AGCGCGCGGCAAAGCAGAGAAC-3'：5'-GACAACCTGTTCAGTCTTGCCATCCTA-3'이었다. 체취한 DNA의 경우 1 μl의 DNA(100 nm/μl)는 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl , 1 to 2 mM MgCl₂, primer 각각 10 pmol, 및 1.75 U Taq DNA polymerase(Takara Co., Korea)를 첨가하여 총 25 μl가 되도록 하였다. MgCl₂의 농도는 이상적인 중합효소연쇄반응 산물을 얻기 위해 primer 각각마다 보정하였다. 중합효소반응은 thermocycler(GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer, Minnesota, USA)에서 시행하였으며 조건은 denaturation, annealing, extension 위하여 각각 98℃에서 1분, 65℃에서 1분, 72℃에서 1분을 한 cycle로 35 cycle 시행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 유지시켰다.

Total RNA의 추출
   Total RNA을 추출하기 위해 각 마우스의 뇌, 간, 및 와우 조직을 멸균된 tube에 넣고 Trizol 반응액(Gibco BRL 10296-010, Gaithersburg, MD)을 첨가하여 세포를 균질화시키고 RNA는 제조사의 설명서에따라 분리하였으며 -70℃에서 80% ethanol에 보관하였다. Formaldehyde agarose 젤에서 total RNA의 순도를 정할 수 있었다.

RNA 표본에서 cDNA의 합성
   정상, spinner 그리고 circler 마우스에서reverse transcription system을 이용하여 Tmie 전사 분석을 위해 추출한 뇌, 간, 및 와우 RNA를 대상으로 first strand cDNA Synthesis Kit(Promega, Madison, USA)를 이용하여 first strand cDNA를 합성하였으며, 역전사 중합효소연쇄반응의 조건은 다음과 같았다. 10×reaction buffers 2 μl, oligo p(dT)15 primer 1.6 ng, avian myeloblastosis virus(AMV) reverse transcriptase 20U로 구성된 시약에서 시행되었으며 25℃에서 10분간, 42℃에서 60분간, 99℃에서 5분간 유지하여 역전사효소를 무력화시킨 뒤 -20℃에 냉장시켜 보관하였다.

역전사 중합효소연쇄반응
   합성된 cDNA는 primer pair로 증폭하였다. 200 ng/μl의 DNA에 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1~2 mM MgCl₂, primer 각각 10 pmol과 1.75 U Taq DNA polymerase(Takara Co., Korea)를 첨가하여 전체 검체가 25 μl가 되도록 만들었다. 중합효소반응은 thermocycler에서 시행하였으며 조건은 denaturation, annealing, extension 위하여 각각 98℃에서 1분, 68℃에서 10분, 72℃에서 1분을 한 cycle로 35 cycle 시행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 유지시켰다.

결     과

행동학적 양상
   모든 이환된 circler마우스들은 정상적으로 태어났으나 생후 7일경부터 점점 과잉 활동을 보였다. 7일 이후부터 고개를 흔드는 행동이 처음으로 관찰되었으며 다음 3~4일 동안 행동은 더욱 명확해졌다. 걷기 시작하는 생후 12일부터 14일까지 이러한 행동은 아주 쉽게 관찰되었다. 이환된 마우스는 특히 새로운 환경에서 주위를 선회하는 모습을 쉽게 관찰할 수 있었으나 선회 방향은 양방향으로 특별히 정해져 있지 않았다. cir 마우스의 행동 평가를 위해 비교수영실험이 시행되었다. 정상 마우스의 경우 수영 실험시 수면 위로 고개를 유지하며 정상적인 수영이 가능하였으나 이환된 마우스의 경우 방향감각의 소실로 인해 물에 쉽게 가라앉고 코와 꼬리를 수면 위로 유지할 수 없는 비정상적으로 헤엄치는 모습을 관찰할 수 있었다.

Complementation 실험
   cir 유전자는 9번 염색체 60~61 cM에 sr 유전자와 근접한 부위에 위치하고 있었다. 각군의 마우스에서 서로 다른 쌍을 교배하는 complementation 실험이 시행되었다. 양군의 이환된 암컷 마우스에서 자연 수정이 쉽게 이루어 지지 않아 in vitro 수정이 자연 교배 실험과 동시에 이루어졌다. 각군의 순종 교배시 21 마리 전체가 이환됨(기대비=0：1)을 알 수 있었다. Spinner 마우스 이형접합체와 circler 마우스 순종의 교배시 자식세대에서 6：9의 비율(기대비=1：1, 0.30sr×수컷+/cir과 암컷+/cir×수컷+/sr의 교배시 각각 자식세대에서 28：3(0.05<p<0.10)과 32：5(0.10<p<0.20)의 비로 혼합되어 나타났다(Table 1). 혼합 이형접합체(cir/sr) 역시 같은 형태의 전달을 보여 주었다(Fig. 1). 이러한 결과로 circler 마우스와 spinner 마우스는 서로 대립형질임이 드러났다.

청능 뇌간 유발검사
   이형접합체와 정상 마우스는 60 dB SPL의 청능뇌간유발 검사에서 정상적인 파형을 보였다. 반면에 성인 circler 마우스의 경우 100 dB SPL에서도 아무런 파형을 보이지 않아 농임을 알수 있었다(Fig. 2).

조직병리학적 소견
   생후 90일된 성인 돌연변이 마우스들(순종 circler 마우스(cir/cir), 순종 spinner 마우스(sr/sr), 두 유전자의 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr), 두 유전자의 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr))의 외이와 골미로를 포함한 내이는 육안적으로 정상적인 모습을 갖추고 있었다. 하지만 광학현미경 검사상 이들 돌연변이의 코르티기관은 정상 마우스에 비해 외유모세포가 보이지 않는 와우 전장에 걸쳐서 심한 퇴행을 보이고 있었다(Fig. 3) 세 돌연변이 모두에서 와우 기저회전부와 중간회전부의 코르티기관은 완전히 단층의 입방형 세포로 변환되었으며 첨회전부에는 일부 남아있는 코르티기관을 관찰할 수 있었다. 몇몇의 경우 pillar 세포는 정상이었으며 오직 외유모세포만 소실되었다. 정상 마우스와 비교하여 세 돌연변이 모두에서 나선신경절세포수의 확연한 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 4). Reissner’s membrane은 원래의 자리에 있었으며 Stria vascularis는 손상되어 있지 않았다.
   나이에 따라 코르티기관의 유모세포는 퇴화하는 변화를 보였다. 생후 10일째 코르티기관의 유모세포, 지지세포 및 코르티기관 안의 공간 모두가 정상(Fig. 5)인 반면 생후 21일째 정상 마우스와 비교하여 코르티기관의 높이가 감소되었고 Nuel's space도 소실되었다(Fig. 6). 특히 순종의 circler 마우스(cir/cir)와 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr)에서 순종 spinner 마우스(sr/sr)보다 더 심한 퇴행이 관찰되었다. 생후 18일 및 21일째, 코르티기관은 특히 기저부에서 단층의 입방형 세포로 변환되어 있는 심한 퇴행을 관찰할 수 있었으며 35일째, 코르티기관의 모양은 생후 90일째의 성인 돌연변이와 거의 같은 모양을 유지하고 있었다. 즉, 코르티기관은 기저부에서부터 퇴행을 보여 생후 35일째 완전한 퇴화가 일어남을 알 수 있었다. 나선신경절세포 역시 생후 10일째는 정상(Fig. 7)인 반면, 생후 18일경부터 세포막의 손상 등 부분적 퇴행이 확인되었다. 특히 생후 21일째 조직절편의 경우, 순종의 circler 마우스(cir/cir)와 혼합 이형접합체 마우스(cir/sr)에서 순종 spinner 마우스(sr/sr) 보다 더 심한 나선신경절세포의 수적 감소가 관찰되었다(Fig. 8). Circler 마우스의 경우, 정상 마우스와 비교하여 와우 기저회전부와 중간회전부의 경우 나이가 들수록, 나선신경절 세포의 부피비가 확연히 감소하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 9).
   채취가 가능하였던 circler 마우스의 첨부 와우 조직을 대상으로 시행한 주사전자현미경 검사상, 12, 17, 24일째의 circler 마우스에서 3열 외유모세포의 입체섬모는 정상적인 W자 모양으로 비교적 잘 보존되어 광학현미경의 소견과 다소간의 차이를 보이고 있었다(Fig. 10). 12일째 내유모세포의 입체섬모는 손상되지 않았다. 17일째와 24일째의 circler 마우스에서는 퇴행에 의한 조직 수축 등으로 잘 보존된 와우를 얻기 어려워 내유모세포의 관찰에 어려움이 있었다.
   전정기관의 경우, 광학현미경상 circler 마우스의 팽랭부릉과 구형낭반의 외관상 모양(Fig. 11)은 정상적이었으나, 팽랭부릉과 구형낭반의 제 1 과 제 2 유모세포의 비가 비정상적으로 보였다. 24일째의 circler 마우스에서 난형낭반의 입체섬모는 겉보기에는 정상이었으나 팽대부릉의 입체섬모의 수는 특히중앙부에서 감소되었으며 주사현미경 관찰시 배열 역시 변형되어 있었다. 하지만, 구형낭반의 입체섬모와 난형낭반의 otoconia층은 정상으로 관찰되었다(Fig. 12).

중합효소연쇄반응 분석
   정상, +/cir, 및 +/sr 마우스에서 Tmie 유전자의 3~6번exon인 약 7.5 kB band가 있음이 확인되었다(Fig. 13). 뇌와 간에서 나온 Tmie 전사체에서 같은 primer로 증폭시, 오직 정상군의 전사체에서 나온 뇌와 간에서만 789 bp band가 존재함을 알 수 있었다.

고     찰

   심한 청력손실과 head tossing, 양방향의 선회운동을 보이며 내이 이상을 동반한 새로운 돌연변이 마우스인 cir 마우스가 밝혀졌으며 이러한 행동양상은 와우와 전정 기관 이상을 추측하게 한다. 새로운 돌연변이 마우스가 되기위해서는 내이의 특징 및 유전자적 이상을 반드시 살펴보아야 한다. 이전에 시행한 예비유전학적 연구에서 cir 유전자는 9번 염색체(55~62 cM)에 위치하고 있는 것이 밝혀졌다.⁷⁾ 다른 돌연변이 마우스인 Ames waltzer(av), Waltzer(v)와 Jackson circler(jc)의 경우 원인 유전자가 10번 염색체에 위치하고 있다.¹¹⁾ 열성 유전 및 난청을 보이는 Snell's waltzer(sv)와 Spinner(sr) 마우스의 원인 유전자는 9번 염색체 44 cM과 64 cM에 각각 위치하고 있다.⁸⁾ Spinner 마우스의 sr 유전자와 cir 유전자는 서로 비슷한 위치에 존재하고 있어 대립형질여부를 결정하기 위해 본 연구에서 두 군간의 교배를 통한 complementation 실험이 시행되었으며 서로 대립형질임이 확인되었다.
   cir 마우스 내이의 조직병리학적 소견에서는 시간에 따라 내이의 감각상피세포의 소실이 관찰되었다. 선회행동을 보이는 생후 10일째 코르티가관의 구조 및 는 나선신경절세포의 수는 정상이었다. 이러한 소견은 비록 광학현미경적 검사상 코르티기관은 정상을 유지하고 있으나, 유모세포가 정상적인 기능을 하지 않는 것으로 보여 결과적으로 소리 전달 과정, 즉 구조적 이상보다는 분자생물학적 이상을 의미한다고 할 수 있다. 생후 18일째, Nuel's space는 좁아 보였고 외유모세포들 또한 관찰되지 않아 광학현미경 상으로는 와우 내의 병변 발생이 이 기간 중에 일어날 수 있음을 보여주고 있다. 결국 코르티기관은 시간이 갈수록 납작해짐을 알 수 있었으며 이와 같은 일련의 과정은 와우기저부에서부터 시작되었다. 나선신경절세포 역시 시간의 흐름에 따라 퇴화가 진행되었으나 이러한 신경절세포의 변화는 유모세포의 퇴화 후 2차적으로 일어나는 변화로 생각되어진다. Circler 마우스에서의 이러한 손상 과정은 난청을 보이는 다른 돌연변이 마우스의 신경상피손상과 유사하였으며 주로 감각상피의 이상을 초래하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 위의 결과에서 보여준 퇴화의 과정은 상염색체 열성유전 및 난청을 보이는 사람에서도 흔히 일어날 수 있을 것으로 생각된다.¹²⁾ Shaker-2 마우스의 경우, 유모세포들이 아주 작은 입체섬모를 가지고 있으며 긴 actin을 함유한 돌출을 보이고 있다.¹³⁾¹⁴⁾ Snell's waltzer마우스의 경우, 생후 12일까지 코르티기관의 발생은 정상적이었으나, 유모세포의 입체섬모는 myosin IV 발현의 결핍으로 형태학적 이상을 보이고 있다. 하지만, 나선선경절은 생후 6주째에도 정상으로 관찰되었다.¹⁵⁾ Ames waltzer 돌연변이는 생후 14일째까지 코르티기관 및 나선신경절의 퇴화가 일어난다.¹¹⁾

   C3H/He, Jackson shaker, and Jerker 돌연변이 마우스의 입체섬모 손상은 생후 10~12일째 유모세포 보다 먼저 일어나 결국 나선신경절세포의 퇴화를 가져 온다.¹⁶⁾ 본 연구에서 cir 마우스의 코르티기관은 비록 정상으로 발생되었으나, 결국 정상 소리전달 과정에 이상을 초래해 기능적인 장애를 가져오는 것으로 보인다. 생후 10일 이후 코르티기관과 나선신경절세포의 퇴화가 관찰되었으며 이러한 일련의 과정은 2~3주 정도로 비교적 빨리 진행되었다. 주사현미경상 외유모세포의 입체섬모가 적어도 생후 22일까지는 정상적으로 관찰되어 입체섬모보다 유모세포의 세포체가 먼저 손상됨을 알수 있었다. 이와 반대로 Ames waltzer 돌연변이는 유모세포가 죽기전인 생후 10일경 입체섬모의 손상이 먼저 관찰된다고 보고하고 있다.¹¹⁾ Stria vascularis 및 Reissner's membrane은 정상적으로 보였다. 전정기관의 팽대부릉과 구형낭반의 제 1 과 제 2 유모세포, 지지세포는 광학현미경상 정상적인 모습을 갖추고 있었다. Shaker-Watzer syndrome 돌연변이의 평형기관에 대한 병리조직학적 연구는 많지 않다. Ames waltzer 돌연변이의 경우 구형낭의 상피세포손상이 보고 되었다.¹¹⁾ 이러한 돌연변이 마우스의 선회행동은 전정기관의 이상과 밀접한 관련이 있을 것으로 생각된다. 하지만 이 cir 마우스의 경우 팽대부릉과 구형낭반의 제 1 과 제 2 유모세포 및 지지세포가 완전히 퇴화되지는 않아 보였으며 단지 팽대부릉의 유모세포의 육안적인 수적 감소만 확인할 수 있었다. 이전 예비연구에서 시행한 TUNEL 염색은 전정기관의 유모세포에서 일어나는 apoptosis를 증명해주었고, 주사현미경관찰로 유모세포의 수적 감소를 확인할 수 있었다. 이러한 전정기관의 조직병리학적 이상소견은 cir 돌연변이의 행동에서 나타난 전정기능장애를 뒷받침 해주고 있으며 향후 전정기능에 대한 양적인 분석연구가 필요하리라 생각된다.
   이전 실험에서 cir 유전자는 9번 염색체의 60 cM에 위치하고 low-resoluation linkage 검사상 sr 유전자는 9번 염색체의 원위에 있음을 보여주었다.⁸⁾ ICR 종족에서 나온 circler 마우스와 C57BL/How에서 나온 spinner 마우스는 교차실험에의해 서로 대립형질임을 알 수 있었다. 앞에서 살펴본 조직학적 검사 역시 circler 마우스와 spinner 마우스는 서로 다른 특징적인 소견을 보이고 서로 다른 종족에서 발견되었으므로 결국 우연히 발견된 같은 염색체안에 존재하는 서로 다른 두 대립형질로 생각해 볼 수 있다. 즉, 두 원인 유전자의 돌연변이를 유발하는 범위가 중복되어 같은 유전자를 붕괴시키거나 유전자의 구조를 변화시키는 것으로 설명할 수 있다. 대립형질을 가지는 돌연변이를 예를 들어 보면, 다음과 같다：sy(shaker with syndactylism), Lp(loop tail), PKD(polycystic kidney disease), Lcc(light coat color). sy 돌연변이의 경우 3가지 서로 다른 대립형질은 가진다. sy^fp과 sy^fp-2J 마우스는 오직 합지증을 보이며 sy^ns 마우스의 경우만 난청을 보인다. 혼합 이형접합체의 표현형과의 비교를 통해, sy 돌연변이는 conginuous-gene-deletion syndrome으로 판명되었다.¹⁷⁾ 화학적으로 야기된 Lpm^1Jus 돌연변이는 Lp의 또다른 대립형질로 낮은 자손 이환율을 보이는 것을 제외하고 비슷한 표현형을 보이고 있다.¹⁸⁾ 표현형적으로 서로 다른 PKD 돌연변이의 두 대립형질로는 BALB/c 종족에서 자연발생한 bpk와 화학적으로 야기한 hybrid 종족인 jcpk을 들 수 있다.¹⁹⁾
   최근 spinner 마우스에서 이상 결핍 단백의 원인 유전자로 Tmie 유전자가 밝혀졌다.⁹⁾ 전체 Tmie 유전자에서 네가지 가능한 전사 sequence를 포함하여 결손 크기는 약 40 kb로 추정된다. 또한, sr의 이형접합체인 sr^J도 존재하는데 이 이형접합체는 한 개의 염기쌍의 치환으로 기대되는 단백질 생성물을 잘라버리게 하는 돌연변이이다. 이환된 spinner 마우스 내이의 조직병리학적 소견은 Tmie 유전자가 입체섬포를 포함한 와우 유모세포의 태생이후 정상적인 세포성숙에 관여하고 있음을 보여주고 있다.²⁰⁾ 이러한 형태학적 연구는 두 돌연변이 마우스에서 유모세포와 나선신경절세포의 퇴화 및 소실 시기의 차이를 알려주었다. 혼합 이형접합체인 cir/sr는 circler 마우스와 비슷한 병리학적 소견을 보여주었다. 이러한 변화는 아마도 9번 염색체의 Tmie 유전자 자체의 종-특이적 대립형질의 차이(allelic heterogeneity)이거나 아니면 다른 유전자들로부터 기인한다고 할 수 있을 것이다. Kenneth 등은 서로 다른 마우스 종족에서 서로 다른 효과를 가지는 나이관련 난청 유전자를 기술하였다.²¹⁾ 예를들어, BALB/cByJ와 C57BL/6J 마우스보다 NOD/LtJ과 DBA/2J 마우스에서 어린 나이에 난청이 발견되었다. 이러한 현상들은 돌연변이 서로간의 차이가 Tmie 유전자 그 자체의 대립형질의 차이에 의해 일어난다는 것을 제시해주고 있다.
   저자들이 시행한 circler mouse의 중합효소연쇄반응 및 역전사-중합효소연쇄반응에서 Tmie 전사가 확인되지 않았다. 하지만, Tmie의 deletion을 확인하기 위해서는 southern blot 분석 및 향후 deletion map작성이 필요할 것으로 생각된다. 결국 cir 마우스 배아에 정상 마우스의 Tmie 유전자를 주입하여 정상적인 표현형으로 나타남을 확인하여야 한다.
   cir 유전자는 완전 자손이환 및 상염색체 열성유전의 패턴을 보이며, 위성표지자로 9번 염색체의 D9Mit116/15와 D9Mit38 사이에 위치하고 있는 것으로 알려져 있으나⁷⁾ 정확한 위치에 대해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것이다. 인간의 3번 염색체와 마우스의 9번 염색체의 유전자 순서는 서로 보존되어 있으며 인간에서 난청을 일으키는 위치인 DFNB6는 3번 염색체(3p21)에 지정되어 마우스 9번 염색체에 위치한 cir 유전자와 일치하고 있다. 이 비교 mapping 자료의 근거로 자연발증 돌연변이 마우스인 circler 마우스는 인간 DFNB6의 모델일 가능성이 높다. 그러므로, circler 돌연변이 마우스는 인간 난청 및 귀 발생에 관한 중요한 실험 동물모델로 생각된다.
   현재 저자들의 연구는 cir 유전자의 전사물질을 밝혀 분자생물학적 원인 규명에 중점을 두고있으며 선회행동을 보이는 유전자의 발견 및 그 원인 규명은 DFNB6 난청의 원리 및 과정을 명확하게 이해하는데 도움을 줄 것이라 생각한다.

결     론

   선회운동을 하는, 지나치게 활동적인, 머리를 쳐드는 행동과 난청을 보이는 새로운 자연발증 돌연변이인 circler 마우스는 인간 난청 유전자 및 신경상피이상 연구에 있어서 유용한 동물 모델로 생각된다. Circler 마우스 내이의 코르티기관 및 전정기관의 발달은 정상이었으나 시간적 흐름에 따른 형태적 이상이 관찰되었으며 이러한 특징을 야기시키는 원인으로 Tmie 유전자가 관련되어 있음을 알 수 있었다.

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