교신저자：정원호, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   NO(nitric oxide)는 여러 조직에서 신경전달물질의 역할을 하면서, 혈관긴장도를 조절하고 내림프와 이온의 항상성을 유지하는데 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ NO는 L-arginine으로부터 NOS(nitric oxide synthase)라는 효소의 작용으로 생성된다. NO는 이어서 soluble guanylate cyclase를 활성화시켜서 cyclic GMP를 생성하게 된다. 이러한 NO/cGMP 경로에 의하여 NO의 생리학적인 역할이 이루어진다(Fig. 1). 
   내이에서의 NO/cGMP 경로는 와우와 전정기에서 모두 보고되고 있다.²⁾³⁾⁴⁾ 와우에서의 NO는 와우 혈류량을 조절할 뿐 아니라, 유모 세포와 구심성 신경간에 작용하여 NMDA 수용체를 통한 신경전달물질로서의 역할을 하게 된다. 또한 NO는 정상 상태에서 생리학적인 역할을 하는 것 외에, 병적인 상태에서 세포 독성을 일으키는 데 중요한 역할을 담당한다.^5)6)7)8) 예를 들어 이독성 약물을 주입시나 내림프수종을 만들었을 때 NO의 양이 증가하여, 세포 파괴의 역할을 담당한다. NO에 의한 세포 독성의 과정은 NMDA 수용체의 과자극에 의하거나, NO의 증가로 인한 유리 라디칼의 증가로 peroxynitrite의 양이 증가하여 세포 파괴를 일으키는 것으로 알려져 있다.¹⁾
   NO를 생성하는데 필요한 NOS(nitric oxide synthase)에는 3가지의 이형체(nNOS, eNOS, iNOS)가 존재한다. Neuronal NOS(nNOS, NOS I)는 칼슘이온에 의존적인 효소로서 적은 양이나마 항상 존재하고, 합성된 NO는 주로 신경전달물질로서의 역할을 담당한다. Inducible NOS (iNOS, NOS II)는 칼슘이온과는 무관하게, 주로 감염등의 병적인 상태에서 발현된다. 이 효소에 의해 생성된 NO는 과량으로 발생되면서 주로 유리 라디칼로 작용하여 세포에 독성 작용을 일으키게 된다. Endothelial NOS(eNOS, NOS III)는 nNOS와 같이 칼슘이온에 의존적으로 작용하면서 항상 조직내에 존재한다. 이 효소에 의해서 합성된 NO는 주로 혈관을 확장시키는 역할을 하게 되어, 혈류량을 조절하는 것으로 알려져 있다.²⁾
   NOS 효소의 정상 내이에서의 분포는 보고자마다 차이를 보이고 있다. 따라서 향후 이독성 약물 손상기전시 관여하는 NO의 역할에 대한 연구를 위해서는 정상 내이에서의 NOS의 분포에 대한 기초 연구가 필요하였다. 본 연구는 기니픽의 정상 내이에서 NOS의 분포양상을 면역화학염색을 통하여 확인하고, 기존에 발표된 결과와 비교하여 보고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   Preyer 반사가 정상인 250 gm의 기니픽 5마리를 사용하였다. 각각의 동물을 4% paraformaldehyde의 고정액을 이용하여 심장관류를 시행한 후에 측두골을 채취하였다. 측두골에서 와우를 노출시킨 후 와우의 첨부골과 등골을 제거하고, 정원창을 뚫은 후에 고정액을 와우내부로 관류 고정시켰다. 와우를 4℃ 같은 고정액속에서 밤새 고정시킨 후 10% EDTA 용액에서 탈칼슘화 시켰다. 파라핀 포매를 시행하고 4 μm 두께의 절편을 만든 후 면역조직화학적 염색을 시행하였다.

면역조직화학적 염색
   면역조직화학적 염색은 Histostain^TM-Plus kit(Zymed laboratory, USA)를 이용하였다. 두께 4 μm의 절편을 poly-L-lysine-coated slide에 mounting하였다. 각 조직절편을 xylene에서 파라핀을 제거하고 단계적 에탄올로 재함수화 시켰다. 각 조직을 3% H₂O₂로 실온에서 30분간 처리하고, 이어서 0.1% triton X-100으로 15분간 처리하였다. 그리고 비특이적 반응을 없애기 위하여 non-immune serum에 30분 이상 두었다. 일차 항체로는 anti-nNOS (1：30, polyclonal, Zymed laboratory, USA), anti-eNOS(1：50, monoclonal, Zymed laboratory, USA), anti-iNOS(1：30, monoclonal, Zymed laboratory, USA)을 사용하여 각각 실온에서 2시간 반응시켰다. PBS로 3번 깨끗이 세척한 다음 biotinylated secondary antibody를 15분간 반응시켰다. 다시 PBS로 깨끗이 세척한 다음 Streptavidin-peroxidase에서 15분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 DAB(Diaminobenzidine)를 넣고 발색시킨 후 Hematoxylin으로 대조염색하고 permount로 봉입하였다. 

결     과

와우에서의 NOS의 분포

Neuronal NOS(nNOS, NOS I)
   정상 기니픽의 와우를 저배율로 관찰시 주로 와우의 코르티 기관과 외측벽에 nNOS에 의한 강한 반응을 확인할 수 있다(Fig. 2B). 코르티 기관의 내유모세포에서는 세포질 전체가 강한 양성 반응을 보였고, 외유모세포도 주로 핵 아래의 기저부를 포함하여 양성 반응을 보였다. 특히 cuticular plate 아래 부위에도 강한 염색을 보였다. Deiter 지지세포에서도 강한 염색과 함께 외유모세포와의 경계가 불분명하였다. 이외에도 pillar 세포와 Hensen 세포 및 limbus 세포와 같은 지지세포에서도 양성 반응을 보였다(Fig. 3A). 
   와우 외측벽에는 stria vascularis와 spiral ligament의 세포에 강한 양성반응을 보였다. Stria vascularis는 전체적으로 양성 반응을 보이면서, 특히 intermediate 세포에 강 양성을 보였다. Spiral ligament는 주로 peripheral region의 세포에 염색되었다(Fig. 3B). 나선신경절세포의 세포질도 강양성을 보이면서 와우신경섬유에도 염색되고 있었다(Fig. 3C). 그러나 골내피세포는 일부의 동물에서 약한 반응을 보였다. 

Endothelial NOS(eNOS, NOS III)
   와우에서의 eNOS 항체에 대한 강한 반응은 저배율로 볼 때 주로 와우의 외측벽과 spiral limbus, 코르티 기관 및 spiral ganglion 부위에서 나타났다(Fig. 2C). 와우의 외측벽은 주로 spiral ligament에 강한 양성을 보였다. Spiral ligament의 혈관내피세포에서 양성 반응을 보였다(Fig. 3E). 그러나 stria vascularis에는 강한 반응을 보이지 않았다. 코르티 기관의 유모세포는 내유모세포는 일부 cuticular plate에 양성반응을 보이고 세포질 전체에 반응을 보인 동물은 없었다(Fig. 3D). 또한 외유모세포도 주로 cuticular plate와 기저부위에 양성 반응을 보이고 있었다. Deiter 세포와 pillar 세포, Hensel 세포에서는 nNOS와 마찬가지로 양성 반응을 보였다. 대부분의 나선 신경세포절세포도 양성 반응을 보였고(Fig. 3F), 와우신경섬유와 신경섬유 주위의 satellite 세포에 양성반응을 보였다. 

Inducible NOS(iNOS)
   iNOS는 정상 와우에서는 어디에서도 발현되는 것을 확인할 수 없었다(Fig. 2A). 

말초전정기의 NOS의 분포

Neuronal NOS(nNOS)
   정상 기니픽의 crista와 macula utriculi에서는 제 1 형과 제 2 형 유모세포의 일부에서 강한 양성 반응을 보이고 있었다(Fig. 4C and D). 또한 상피 세포층의 상층 주변으로 양성 반응이 증가하는 경향을 보이고 있다. 신경섬유에는 비교적 약하지만 반응을 보이고 있었다. 대부분의 전정 신경절 세포들도 양성 반응을 보이고 있었다(Fig. 4G).

Endothelial NOS(eNOS)
   Crista와 macula에서 모두 제 1 형 유모세포의 calyx를 비롯하여 신경섬유에 강한 염색을 보이고 있다(Fig. 4E and F). 일부 유모세포에서는 약하게 양성반응은 보이고 있었고, 상피 세포층의 상층부를 따라 양성반응을 보였다. 전정기의 신경절 세포는 대부분 양성반응을 보였고, 주변의 신경섬유도 강한 염색반응을 보였다(Fig. 4H). 

Inducible NOS(iNOS)
   말초 전정기의 어떠한 세포도 양성 반응을 보이지 않았다(Fig. 4A and B). 

고     찰

   정상 내이에서의 면역조직염색을 통한 NOS 분포에 대한 보고는 많지 않다.^{1)2)3)4)9)10)11)} 또한 보고자마다 NOS 발현 분포의 차이를 보이고 있다. 기니픽의 와우에서 nNOS는 나선신경절과 와우 외측벽의 spiral ligament와 spiral vascularis에서는 모든 보고에서 공통적으로 양성 반응을 보이고 있다. 그러나 유모세포에서의 발현은 차이를 보여 내, 외유모세포의 세포질에서 모두 발현되거나,⁹⁾ 외유모세포의 세포질 모두¹¹⁾와 기저부의 일부,¹⁰⁾ 혹은 어떠한 유모세포에도 발현되지 않았다.⁴⁾ 그 외에도 와우의 내골피막⁴⁾과 코르티 기관의 지지세포와 limbus 세포,⁴⁾¹¹⁾ 그리고 신경섬유¹¹⁾에도 양성 반응을 보인다고 보고되고 있다. 
   와우의 eNOS는 공통적으로 와우 외측벽의 혈관내피세포와 일부의 나선신경절에서 분포되어 있었다. 그러나 보고에 따라서 모든 유모세포에 분포¹¹⁾되거나 와우신경섬유와 limbus에 발현⁴⁾¹¹⁾되기도 하였다. 그러나 iNOS가 정상 기니픽의 와우에서 보고된 바는 없다. 
   본 연구자들의 결과와 보고된 연구결과의 비교를 Table 1에 정리해 보았다(Table 1). 다른 보고에서 공통적으로 발현된 부분은 본 연구에서도 똑같이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 다른 보고자마다 차이가 보이는 부위에서도 5마리의 기니픽을 이용하였을 때 균일하게 발현되는 양상을 보이고 있다. 특히, 발현양상 중 와우의 외유모세포에서는 주로 주로 기저부에서 nNOS가 발현되면서 지지세포인 Deiter 세포와의 구별이 어려웠고, 내유모세포에서의 세포질 전체에서 발현이 되었다. 그러나 이는 Fessenden 등의 연구에서 보여준 NADPH diaphorase 염색을 시행하였을 때 발현이 주로 외유모세포의 기저부에 나타난다는 결과가 같다.¹⁾ 그러나 eNOS의 경우에는 내유모세포의 발현은 보이지 않았고, 단지 외유모세포의 기저부에서 발현되는 것을 확인하였다. 또한 nNOS의 경우 Michel 등은 내골피막에 강한 양성을 보인다고 하였으나, 본 연구에서는 내골피막에서의 발현을 확인할 수 없었다.
   기니픽의 전정기에 대한 정상 NOS 분포에 대한 연구는 많지 않다. Hess 등에 의하면 nNOS는 주로 전정기의 상피세포와 신경절 세포의 내골피층에 발현되고, eNOS는 전정 신경절과 신경 세포, 특히 제 1 형 세포를 덮고 있는 calyx에도 발현이 강하다고 보고 하였다.²⁾ 본 연구에서는 nNOS, eNOS 모두 제 1, 2 형 유모세포에 염색되고, calyx를 비롯한 신경섬유에 염색되는 양상을 보였다. 특히, 신경 섬유와 calyx, 혈관 내피세포에는 eNOS가 nNOS 보다 강한 양성 반응을 보였고, 유모세포에서의 발현은 주로 nNOS에서 eNOS 보다 뚜렷한 양상을 보이고 있었다. 그러나 내골피층에서는 모든 동물에서 양성 반응을 보이지 않았다. 이러한 보고자간의 발현 양상의 차이는 사용한 항체와 염색기법의 차이로 생각할 수 있다. 그러나 사용한 5마리의 기니픽에서 비슷한 염색양상을 보이는 것으로 보아 본 결과가 향후 본 연구진에서 행해질 병적인 상태에서의 연구결과의 비교 자료로 이용할 수 있을 것이다. 
   NO의 내이에서의 역할은 크게 신경전달물질로서의 역할과 와우혈류량의 조절 및 임파액의 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 와우내 혈관내피세포에서에서 생성된 NO는 NO/cGMP 기전을 통해 혈관내피세포나 smooth muscle cell에 작용하여 와우의 혈류를 조절한다. 이는 NOS 억제제를 투여시 혈관내피세포에서의 NO 발현이 줄어들고, NOS의 기질로 이용되는 L-arginine을 투여 시 NO 발현이 늘어나는 것을 보고 확인할 수 있다.¹²⁾ 특히, 와우의 외측벽의 혈관내피세포에서는 eNOS가 주로 발현되고, soluble guanylate cyclase가 spiral ligament의 pericyte에 발현됨으로서 eNOS에 의해서 생성된 NO가 주로 혈류량 조절에 관여할 것으로 생각된다.¹⁾¹¹⁾ 그러나 혈관내피세포이외의 위치에서 생성되는 NO도 혈관의 긴장성 조절에 관여할 것이다.¹¹⁾
   NO는 또한 와우의 유모세포와 구심성 신경섬유간에 작용하여, glutamate 같은 신경전달물질의 분비를 조절하여 NMDA 수용체와의 작용을 조절하는 역할을 하게 된다. 내유모세포의 자극으로 분비된 glutamate는 NMDA 수용체와 결합하여 NOS를 활성화시켜서 NO을 생성하고, 생성된 NO는 negative feedback 과정을 거쳐서 NMDA 수용체의 역할을 억제시킨다. 이러한 가설은 NO가 내유모세포의 신경전달물질로서의 역할이 가능하다는 것을 보여준다.¹¹⁾ 또한 외유모세포를 지배하는 신경섬유의 시냅스 부위에 NOS의 발현이 확인되었고, soluble guanylate cyclase가 Deiters 세포나 Hensen 세포 등의 지지세포에 발현됨이 확인됨으로서 와우에서 NO/cGMP 경로가 주로 지지세포를 통해서 이루어진다고 알려져 있다.¹⁾
   NO는 일종의 자유 라디칼이므로 생리적인 양으로 존재 시에는 독성을 보이지 않지만 과량으로 생산될 때는 세포에 독성을 미칠 수 있다. 과량의 NO는 자유 라디칼로서 ROS(reactive oxygen species)와 반응하여 peroxynitrite을 합성하여 주변 세포를 파괴한다.¹²⁾ NO는 정상 상태에서는 nNOS와 eNOS에 의해서 생성되는 일정한 양으로 생리적인 역할을 하게되지만, 유모세포의 과도한 자극이나 염증 반응이 생기게 되면 NO의 양이 증가하게 된다. NO가 과량으로 증가되는 기전은 두가지로 생각할 수 있다(Fig. 5). 첫째는 유모세포가 과도한 자극을 받게 되어 신경전달물질인 glutamate의 분비가 증가하게 되면 신경섬유에 존재하는 NMDA 수용체의 과자극으로 정상적으로 존재하는 nNOS의 양이 증가하여 NO의 생성이 증가된다.¹⁾ 또한 내이의 염증 반응이나 외부자극에 의하여 iNOS의 생성이 유발되면, Ca⁺⁺과 무관하게 다량의 NO를 생성하게 되므로 세포의 독성작용에 관여하게 된다.⁶⁾⁷⁾ 기니픽의 내이에서의 iNOS의 발현은 정상에서 보고된 바 없고, 고실내 LPS(lipopolysaccharide)를 투여시나,⁷⁾¹³⁾ 내림프수종을 만들었을 때,⁵⁾ 그리고 gentamicin을 투여시에⁶⁾⁸⁾ 발현이 유발된다고 보고되었다. Takumida 등은 외부 자극의 초기에는 NMDA 수용체를 통한 nNOS에 의해 생성된 NO에 의해서도 세포독성이 일어나고, 후기에는 iNOS에 의한 NO의 생성으로 세포독성이 일어난다고 보고하였다.¹³⁾

결     론

   정상 기니픽의 내이에서 nNOS와 eNOS는 와우의 외측벽과 유모세포 및 신경절, 혈관내피세포에 특징적인 분포를 보이고 있으며, iNOS는 정상 내이에서의 발현이 확인되지 않았다. 이러한 nNOS와 eNOS의 분포는 이미 보고된 NO의 역할에 대한 증거로 이용될 수 있다. 또한 본 연구는 이독성 물질에 의한 내이의 손상 시 관여하는 NO에 대한 기초 연구자료로서 정상 기니픽에서 NOS의 분포의 양상을 확인한 결과이다. 따라서 다른 보고와는 다소 차이는 있지만 본 연구진의 결과의 기초자료로서 이용이 가능할 것으로 생각한다. 

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