교신저자：윤주헌, 120-752 서울 서대문구 신촌동 134  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1(NAG-1)은 최근에 발견된 유전자로 여러 비스테로이드성 소염제에 의해 활성화 된다. 염기서열 분석상 이 유전자는 TGF-β superfamily 사이토카인 유전자를 특징짓는 서열과 동일한 서열을 가지고 있어 TGF-β superfamily에 속하는 사이토카인이다.¹⁾ NAG-1은 placenta bone morphogenic protein,²⁾ placenta TGF-β,³⁾ prostate derived factor,⁴⁾ macrophage inhibitory cytokine-1⁵⁾ 또는 novel TGF-β superfamily HP00269⁶⁾ 등의 여러 이름으로 불리지만, 염기서열 분석을 통해 이 다섯 가지 유전자는 새로운 TGF-β superfamily에 속하는 동일한 유전자라는 것이 밝혀졌다.¹⁾
   TGF-β superfamily 사이토카인은 세포의 증식과 고사, 분화, 세포외 기질의 형성 또는 면역 억제와 관련이 있다고 알려져 있으며,⁷⁾ 강력한 성장 억제를 일으켜 세포주기를 G1 후기에 머물게 하거나, 세포고사를 일으키며 세포 부착물질의 발현에도 작용한다.⁸⁾ 이제까지 NAG-1 유전자는 뼈의 형성과 대식세포의 비활성화, 세포고사를 통한 대장암 세포의 증식 억제를 하는 것으로 알려졌으며,¹⁾²⁾⁵⁾ 쥐를 이용한 생체내 유도실험상 비스테로이드성 소염제에 의한 NAG-1의 조절이 가능함이 밝혀져,⁹⁾ 대장-직장암에서 비스테로이드성 소염제의 항암기전중 하나로 알려져 있다.
   세포분화는 코점막 상피세포의 성숙에 필수 과정이며 코점막 상피세포는 분화되어 섬모상피세포와 분비세포가 되는데,¹⁰⁾ 이런 분화과정에서 레티노익산은 중요한 분화 유도체이다.¹¹⁾ NAG-1이 속해 있는 TGF-β superfamily 사이토카인은 여러 세포에서 분화에 관련되어 있기 때문에 NAG-1이 코 상피세포의 분화에 관련되었을 가능성이 있으나 NAG-1과 분화의 관계는 아직 연구된 바가 없다.
   한편 NAG-1 유전자와 단백의 존재에 대하여 태반이나 전립선, 폐, 대장에서 이의 발현이 보고되었지만, 사람 코점막 상피세포에서의 발현과 국재화(localization)에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.
   이에 저자들은 NAG-1이 사람 코점막에서 발현되는지 알아보고 만약 발현된다면 그 국재화에 대해 조사하고자 하였으며, 세포 분화에 관련하여 코점막과 배양된 코점막 상피세포에서 NAG-1의 발현과 코점막 상피세포의 대표적 분화인 점액섬모 상피분화 및 편평 상피분화가 어떤 관계가 있는지 알고자 하였다. 

대상 및 방법

조직 채취 및 면역조직화학염색
   비중격 성형술을 시행 받은 사람의 하비갑개 전단부와 중간부를 환자의 동의하에 가능한 한 손상없이 채취하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 실험의 전 과정은 연세대학교 의과대학 임상실험 위원회(Institutional Review Board of Yonsei University College of Medicine)의 승인 하에 이루어 졌다. 하비갑개의 전단부는 편평화생된 조직을, 중간부위는 점액섬모 상피조직을 연구하는데 사용하였다. 채취된 조직은 10% 중성 포르말린액에 고정한 뒤 파라핀에 포매하였으며 4 μm 두께로 절편을 자른 뒤 xylene으로 파라핀을 제거하였다. 내인성 과산화 효소의 억제를 위해 실온에서 메탄올에 섞인 3% 과산화수소 용액에 10분간 처리한 후, 2% 탈지분유와 0.2% Triton이 함유된 인산완충 식염수(phosphate buffered saline)에서 배양하여 비특이 반응을 억제하였다. 이후의 단계는 Vectastain Elite ABC peroxidase kit(Vector Laboratories：Burlingame, CA, USA)로 시행하였다. 실온상태로 인산완충 식염수에 희석된 정상 차단항체(normal blocking antibody)에 20분간 담군 다음, rabbit anti-NAG-1 항체(a generous gift from Dr. Thomas E. Eling：NIEHS, RTP, NC, USA)(1：5,000 농도)에 4°C로 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 절편을 실온에서 5분간 인산완충 식염수로 3회 세척한 뒤 biotinylated goat anti-rabbit IgG 용액에 실온으로 30분간 배양한 다음 3,3’-diaminobenzidine substrate kit(Vector Laboratories)로 발색하였다. 면역 염색된 슬라이드는 광학 현미경으로 관찰하였다. 

사람 정상 코점막 상피세포의 배양
   계대배양된 2세대 사람 코점막 상피세포를 Transwell-clear 배양기(직경 24.5 mm, 0.45 mm pore)(Costa Co.：Cambridge, MA, USA)에 배양기당 10⁵ 세포의 밀도로 배양하였다. 배양액은 BEGM과 DMEM을 동일한 양으로 혼합하고 보충 영양소와 fetal bovine serum을 이전의 연구¹¹⁾와 같이 첨가하였다. 세포는 레티노익산을 첨가배양한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누었다. All-trans 레티노익산(Sigma Co：St.Louis, MO, USA)을 사용하였으며 농도는 10^-7 M이었다. 세포는 배양액에 담긴 채로 9일간 배양한 후 상층의 배양액은 제거하였고 이후 세포아래의 막을 통하여 영양분을 공급하여 Air-liquid interface 배양을 시행하였다.

점액섬모 및 편평 상피분화 기능과 NAG-1의 발현
   레티노익산의 존재에 따른 세포의 형태 변화에 대한 연구를 위해 air-liquid interface 배양 후 14일 동안 배양한 다음 10% 중성 포르말린 용액에 고정한 뒤 2% agarose 젤에 일차 포매하였다. 젤을 파라핀에 이차 포매한 다음, 4 μm 두께로 절편을 잘라서 hematoxylin과 eosin 염색을 시행하였다.
   분화 정도에 따른 NAG-1의 발현을 연구하기 위해 air-liquid interface 시작일, 7일 후, 14일 후에 배양된 세포를 각각 radioimmunoprecipitation assay buffer(1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)로 세포 용해액을 얻었다. 이 세포 용해액을 4°C에서 20분간 10,000×g로 원심분리하여, 침전된 총단백으로 Western blot을 시행하였다. 단백농도는 bovine serum albumin을 이용하는 BCA protein assay로 농도를 결정하였다. 단백질(30 μm)을 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)로 분리한 후 니트로셀룰로즈막(Amersham Pharmacia Biotech：Piscataway, NJ, USA)에 전이하였다. 막을 10% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)용액에서 4°C로 하룻밤 동안 담가두어 비특이 반응을 억제하였고, 2% 탈지분유가 포함된 TBST를 이용하여 1：5000의 농도로 anti-NAG-1 항체 및 1：500의 농도로 anti-actin 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.：Santa Cruz, CA, USA)를 사용하여 실온에서 4시간 동안 막을 상기 항체와 반응시켰다. 세척을 시행한 후 막은 TBST에 1：5000으로 희석한 HRP-결합 anti-rabbit 항체(Amersham Pharmacia Biotech)로 한 시간 동안 처리하고 수차례의 세척 후 enhanced chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech)와 autoradiography를 이용하여 밴드를 확인하였다. 

결     과

사람 코점막 상피조직에서 NAG-1의 국재화
   하비갑개 중간부에서 얻은 코점막 상피조직의 면역조직화학염색상 상피조직은 점액섬모 상피조직이었으며, NAG-1 단백은 섬모세포에서 강하게 발현 되었고 특히 세포질의 상층부에 강하게 염색되었다. 그러나 배세포에서는 발현되지 않았다(Fig. 1B). 하비갑개의 전단부는 편평 상피 세포로 이루어져 있었으며, NAG-1 단백은 상부의 세포에서만 발현되고 기저부에서는 발현되지 않았다. 한편 편평 상피조직과 점액섬모 상피조직의 NAG-1 발현을 비교시 편평 상피조직에서 약하게 발현되었다(Fig. 1C). 점막하 선조직에서 NAG-1 단백 발현은 장액선에서 관찰되었으나 점액선 에서는 관찰되지 않았다(Fig. 1D). 면역전 혈청(preimmune serum)으로 일차항체를 사용한 음성 대조군의 경우 양성 반응이 보이지 않았다(Fig. 1A). 

레티노익산 첨가 여부에 따른 사람 정상 코점막세포의 분화
   사람 정상 코점막세포의 분화를 유도하기 위해 레티노익산을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누어 air-liquid interface 이후 14일간 배양하였다. 레티노익산을 첨가한 군에서는 hematoxylin과 eosin 염색상 섬모원주 상피세포로 분화하였다. 그러나 레티노익산을 첨가하지 않은 군에서는 각질화 편평상피세포가 발견되었다(Fig. 2). 따라서 레티노익산을 첨가하여 배양한 사람 정상 코점막 상피세포는 점액섬모 상피세포로 분화되나 그렇지 않은 군에서는 편평 상피세포로 분화하는 것을 알 수 있었다. 

레티노익산 첨가 여부 및 배양 기간에 따른 NAG-1 단백 발현의 변화 
   분화 정도에 따라 레티노익산을 첨가한 군과 미첨가군에서의 NAG-1 단백 발현을 연구하기 위해 Western blot analysis를 시행하였다. 레티노익산을 첨가한 군에서 미첨가군에 비해 NAG-1 단백이 강하게 발현되었으며, 단백 발현은 배양 기간에 따라서 증가하였다. 레티노익산을 공급하지 않은 군에서 NAG-1 단백의 발현은 air-liquid interface 시작일과 비교시 배양 7일과 14일째 증가되어 있는 양상이었으나, 7일째와 14일째의 NAG-1 발현양에는 차이가 없었다(Fig. 3).

고     찰

   NAG-1 단백은 새로 발견된 TGF-β superfamily 계통의 사이토카인으로 전립선과 대장, 신장 등에서 발현되며, 태반에서 가장 많이 검출된다.¹⁾ NAG-1 단백의 기능은 아직 명확히 알려져 있지 않지만 세포고사를 유발하며 대장암에 대해 항암효과를 가지고 있다.¹⁾⁹⁾ 세포고사는 세포분화의 최종 단계이며 TGF-β superfamily 사이토카인은 여러 기관의 분화와 발육에 관여한다.⁷⁾ 따라서 저자들은 NAG-1 단백이 사람 코점막세포의 세포고사나 분화 과정에 관련되어 있을 것으로 생각하여 연구를 하였다.
   코점막 상피조직의 분화에 따른 변화를 연구하기 위해서 하비갑개가 좋은 재료인데, 그 이유는 전단부는 편평 상피세포로 이루어져 있으며 그 이후로는 점액섬모 상피세포로 이루어져 있기 때문이다. 따라서 하비갑개의 전단부와 중간부를 채취하여 서로 다른 분화의 양상인 점액섬모 상피조직과 편평 상피조직에서 NAG-1의 발현을 비교하였다.
   분화 양상에 따른 NAG-1 단백의 발현을 보기 위해 점액섬모 분화와 편평상피 분화를 유도하고자 하였다. 레티노익산은 점액섬모 분화에 있어서 중요한 유도체로 레티노익산을 첨가배양한 세포는 점액섬모 상피세포로 분화하고, 레티노익산이 없이 배양된 세포는 각질화 편평 상피세포로 분화한다. 이처럼 상이한 분화 양상을 보이는 점액섬모 상피세포와 편평 상피세포에 대해 배양 기간을 달리하여 분화도에 차이를 두어 NAG-1 단백의 양을 측정하였다.
   점액섬모 분화 측면에서 보면, 면역조직화학염색 결과상 NAG-1 단백은 하비갑개의 점액섬모 상피세포의 상층에서 주로 발현되었고 기저부나 배세포에서는 발현되지 않았다. 또한 세포실험상 레티노익산을 첨가 배양한 경우 NAG-1 단백의 발현은 배양 시간이 길어질수록 증가하였다. 대장조직의 경우 세포고사가 일어나는 내강측 상피세포에서 NAG-1의 발현이 관찰되며, 세포 분열이 일어나는 미성숙 선와에서는 NAG-1 발현이 관찰되지 않는다는 연구⁹⁾와 맥을 같이한다. 즉, 코점막 상피세포에서 기저세포는 줄기세포의 역할을 하여 섬모 상피세포나 배세포로 분화하며,¹⁰⁾ 섬모 상피세포는 최종적으로 분화된 형태로 상피 재생과정의 일련으로 세포고사가 일어난다.¹²⁾ 이처럼 분화 및 세포고사의 측면에서 대장에서의 연구와 동일한 양상을 보였다. 또한 분화 기능에 따른 섬모세포의 숫자에 대한 저자들의 이전 연구¹⁰⁾를 생각해 볼 때 NAG-1 단백의 증가는 분화 과정의 진행이나 고사상태에 가까워지는 것으로 설명될 수 있을 것이다. 하지만 NAG-1 단백의 발현이 레티노익산에 의해 직접적으로 증가하는지 또는 세포형태 변화를 일으킨 후 이차적으로 증가하는지는 명확하지 않다.
   편평 상피분화 측면에서 보면, NAG-1 단백은 세포고사가 일어나는 부위인 각질화 편평 상피세포의 상층에서 발현되었다. 그러나 편평 상피세포에서의 NAG-1 단백의 발현 정도는 조직과 배양세포 모두에서 섬모 상피조직 및 세포보다 약하게 나타났다. 코점막 상피세포의 대표적 두 종류인 점액섬모 상피세포와 편평 상피세포에서 NAG-1단백은 세포고사가 일어나는 부위에서는 발현이 되었다. 이 결과는 NAG-1 단백이 사람 코점막 상피세포의 세포고사나 분화 과정에 관련되어 있다는 것을 의미한다. 하지만 발현되는 정도의 차이가 있기 때문에 점액섬모 상피세포에서의 역할은 편평 상피세포와는 다를 것으로 생각된다.
   한편 점막하선에서의 NAG-1 단백 발현을 보면, 발현은 점액선 조직에서는 관찰되지 않고 장액선 조직에서만 일어났다. 이 결과는 본 연구결과인 코 점막 상피세포중 배세포에서 NAG-1이 발현되지 않고 또한 점액세포로 구성된 사람 전립선 조직에서도 NAG-1이 발현되지 않는다는 결과⁴⁾와 비교시 상통하는 면을 보인다. 다른 예로 쥐 조직의 경우 턱밑샘과 유선 조직에서 NAG-1 단백의 발현은 in situ hybridization상 강하게 발현되었다.¹³⁾ 이러한 점으로 유추컨데 점액선 조직과 장액선 조직 간의 NAG-1 단백의 발현 차이는 분비세포 간의 기능 차이를 반영한다고 생각된다.

결     론

   본 연구의 결과로 NAG-1 단백은 코점막 조직 및 상피세포의 분화와 세포고사에 연관되어 있다고 생각된다. 그러나 분화 및 세포고사 과정에 대하여 NAG-1이 유도체인지 혹은 분화의 산물인지는 본 연구 결과만으로 결론짓기는 어렵다고 본다. 이런 측면에서 NAG-1 단백의 기능으로 분화와의 관계에 대한 연구가 더 필요하다고 생각한다.

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