교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   코티기관내에는 내이로 전달된 음 자극을 증폭하고 조절하여 청신경으로 전달하는 기능을 하는 유모세포들 외에도 여러 종류의 지지세포들이 존재하고 있다. 이들의 기능은 단순히 구조적으로 유모세포를 지지하여 형태를 유지하는 것뿐만이 아니라, 내이의 물리적인 성질을 능동적으로 조절하는 역할도 수행하는 것으로 추정되고 있다. 특히, 과도한 음 자극이 가해졌을 경우 외유모세포 주위의 지지세포인 Deiters 세포, Hensen 세포들이 와우 회전의 중앙부를 향해 기울어지며 수축한다.¹⁾ 이와 동시에 음 자극 후 발생하는 와우 미세 전압(cochlear michrophonic potential)이 감소하며, 음 자극에 대한 반응성이 일시적으로 감소하게 된다. 이는 과도한 크기의 소음에 의한 외유모세포의 손상을 방지하는 능동적 기전이 지지세포들에 의해 수행되고 있음을 시사하는 소견이다.
   최근에는 원심성 올리브와우 신경체계(olivocochlear efferent system)에서 유래하는 상핵성 섬유(supranuclear fiber)들이 외유모세포와 Deiters 세포에서 함께 발견되었다.²⁾ 원심성 신경 연접은 와우의 상부에서 주로 발견되는데 외유모세포뿐만 아니라 Deiters 세포와 직접 접합하기도 한다. 또한 Deiters 세포, Hensen 세포의 기저부에서 synaptophysin과 신경미세섬유(neurofilament)에 대한 강한 양성 염색반응이 관찰되었다.³⁾ 이는 원심성 신경의 조절 기전이 지지세포들에 존재한다는 증거이며, 이런 신경전달 경로의 다른 증거들로서, 일부 Deiters 세포에서 콜린형 신경연접(cholinergic synapse)의 존재 가능성을 시사하는 Ach-esterase 조직화학염색의 양성반응, Ach이나 ATP와 같은 신경전달물질에 대한 세포내 반응 등이 보고되어⁴⁾⁵⁾⁶⁾ 이들 세포가 외유모세포처럼 능동적으로 청각신호전달체계의 조절 기전에 참여하고 있을 가능성이 제기되고 있다.
   Ach과 ATP는 원심성 신경섬유접합에 co-package되어 있을 것으로 보여지며,⁷⁾ Deiters 세포 주변의 외림프액에도 ATP가 미량 존재한다. 또한, 소음이나 허혈에 의해 조직손상이 발생할 경우 세포주위의 ATP 농도 변화가 관찰된다. ATP의 작용에 의한 세포내 칼슘이온 농도의 증가는 tubulin의 중합화(polymerization)와 microtubule-associated protein의 교차결합(cross-linkage)을 조절하여 세포내 미세관(microtubule)의 길이를 단축시킨다.⁸⁾ 이에 따른 Deiters 세포의 경직도(stiffness)의 변화는 인접한 외유모세포의 운동성과 와우의 운동 역학에 영향을 미칠 것으로 생각된다.⁹⁾ Dulon 등¹⁰⁾은 ATP 투여시에 세포내 칼슘이온의 농도 증가가 관찰되며 이로 인한 Deiters 세포의 phalangeal process의 운동이 유발되는 것을 보고한 바 있고, Ach과 ATP에 의하여 세포내 칼슘이온의 농도가 증가되는 세포반응은 산화질소/환식구아노신 모노포스페이트(nitric oxide/cyclic GMP) 경로를 통하여 억제되는 조절기전을 가지고 있다고 알려져 있다.⁶⁾
   신경전달물질에 의한 세포반응의 발생에 있어 가장 중요한 경로는 세포막에 존재하는 이온 통로의 조절이다. Deiters 세포막에 존재하는 이온 전류의 가장 큰 요소는 외향 정류성(outward rectifying) 칼륨이온 전류이다. 이들은 TEA(tetraethyl-ammonium)에 의하여 약 3/4정도 억제되고 나트륨이온(Na⁺)과 쎄슘이온(Cs⁺)을 일부 통과시키는 외향 정류성 이온 통로의 형태를 나타내며, 활성화 곡선의 특성에서 미루어 보아 2개 이상 존재할 가능성이 높은 것으로 알려진 바 있다.¹¹⁾
   이러한 이온 전류에 대한 신경전달물질의 조절기능을 조사함으로써 Deiters 세포에 대한 신경전달 물질의 작용기전을 더 자세히 알 수 있게 되며 나아가 Deiters 세포반응을 통한 청각신호전달체계의 능동적인 조절 과정을 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
   그러므로 본 연구에서는 백색 기니픽의 내이에서 분리한 Deiters 세포를 이용하여 세포의 이온 통로에 대한 신경전달 물질의 조절기전에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

Deiters 세포의 분리
   백색 기니픽(200~250 g)에 ketamin hydrochloride(35 mg/kg)를 복강내 주사하여 마취시키고 양측 측두골을 획득하였다. 1형 collagenase(Sigma, St. Louis, MO, USA) 1 mg을 정상 Tyrode 용액 1 ml에 녹인 후, 최종농도 0.5 mg/ml의 용액으로 와우로부터 분리한 코티기관을 20분간 상온에서 소화시킨 다음 Deiters 세포를 분리하였다. 50 μl의 정상 Tyrode 용액이 포함된 35 mm 크기의 배양용기에 세포를 넣고 세포가 바닥에 붙을 때까지 약 20분간 기다린 후 세포의 모양이 다각형이며 긴 phalangeal process를 가진 특징적인 Deiters 세포의 형태를 확인하였다(Fig. 1).

막전압 고정법(Voltage clamping)
   Deiters 세포를 포함한 현탁액을 도립현미경(Olympus LH50A, Olympus Optical Ins. LTD, Japan) 상부에 위치한 0.2 ml 크기의 용기에 떨어뜨리고 10분간 세포가 용기에 부착하기를 기다렸다. 칼슘이온이 포함된 정상 Tyrode용액을 2 ml/min의 속도로 계속 관류시켰고 용액온도는 37°C로 유지하였다. 단일세포에 대하여 400배 시야에서 미세조작기에 연결된 전극을 접촉시켜 gigaseal 형성 후 음압으로 세포막을 터뜨리는 whole-cell patch clamp를 시행하였다(Fig. 2). 막전압 고정 후 patch clamp 증폭기(EPC-7, Heka, Germany)를 이용하여 막전류를 측정하였다.
   유리전극(borosilicate glass pipette)은 외경 1.5 mm의 유리모세관(Clark, UK)을 전극제조기(Narishige, Japan)를 이용하여 제작하였고, 충전액을 채웠을 때 전극저항이 2~5 MΩ이 되는 유리전극을 선택하여 사용하였다. 자료수집 빈도의 2~4배로 4극 베셀 필터에서 필터된 자료를 A-D 변환기(Digidata 1200, Axon Instrument, USA)로 수량화하였고, pClamp 8.0.2(Axon Instrument, USA) 프로그램을 통해 컴퓨터에 기록 저장하였다. 복수 실험의 결과는 평균±표준오차로 표기하였으며, 전류값은 세포 크기에 따른 conductance의 차이를 보정하여 pA/pF(pico-ampere/pico-farad)의 단위를 사용하였다.

사용된 시약
   세포 외 용액은 정상 Tyrode 용액을 기본 용액으로 사용하였다. 정상 Tyrode 용액의 조성은 mM 단위로 NaCl 143.5, KCl 5.4, CaCl₂ 2.0, MgCl₂ 1.0, HEPES 10, Glucose 11이었고 pH는 NaOH로 적정하여 7.4로 맞추었다. 유리 전극의 내부를 채우는 용액(pipette solution)의 조성은 mM 단위로 KCl 140, HEPES(4-(2-Hydroxy-ethyl)-piperazine-1-ethane-sulfonic acid) 10, Mg-ATP 2.0, MgCl2 1.0, EGTA(Ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N,N′-tetraacetic acid) 0.1이며 pH는 KOH로 적정하여 7.4로 유지시킨 용액을 사용하였다.
   실험에 사용된 약물들은 ATP, Ach, 그리고 Ach의 유도체인 carbachol, 퓨린 수용체 촉진제인 α,β-methylene ATP(α,β-meATP), 퓨린 수용체 억제제인 suramin과 PPADS였다(Sigma, St. Louis, MO, USA).

결     과

ATP 투여에 의한 세포막전압의 변화
   정상 Tyrode 용액하에서 분리된 단일 Deiters 세포에 대해 current clamp를 시행하여 나타난 세포의 안정막전압은 -21.1±3.5 mV였고, 100 μM의 ATP를 약 30초간 투여하였을 때 -3.1±1.1 mV로 탈분극 되었다(n=4). 막전압은 ATP 투여가 끝나고 정상 Tyrode 용액으로 세척한지 약 30~60초 후에 원래의 안정막전압의 수준으로 회복되었다(Fig. 3).

Ach 투여에 의한 세포막전압의 변화
   같은 조건하에서 Ach 100 μM을 약 120초간 투여하였으나 세포막전압의 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 4).

ATP 투여에 의한 전류 반응
   정상 Tyrode 용액 관류상태에서 유지전압을 0 mV로 고정하고 -80 mV의 전자극을 500 msec 동안 준 다음 -140 mV부터 +10 mV까지 10 mV 간격으로 계단자극을 주어 나타나는 활성화된 전류의 항정상태의 전류값을 측정하였다. ATP 10 μM 투여 후 내향성 전류의 크기가 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 최대자극인 -140 mV에서 대조군의 -14.9±1.9 pA/pF에 비해 ATP 투여 후 -163.5±14.9 pA/pF으로 내향성 전류가 증가하였다(n=4). 이 내향성 전류의 전류-전압 관계곡선에서 역전전압(reversal potential)은 -20 mV에서 형성되었다(Fig. 5). 이에 비하여 외향성 전류는 역전전압인 -20 mV부터 +10 mV까지 자극하였을 때 ATP의 투여에 별다른 변화를 보이지 않았다.

Ach과 carbachol 투여에 의한 전류 반응
   같은 조건으로 Ach을 10 μM부터 100 μM까지 투여한 실험과 그 유도체인 carbachol 100 μM을 투여하였을 때 모두 전류의 변화는 관찰되지 않았다(n=3)(Fig. 6).

퓨린 수용체 억제제의 투여효과
   동일한 방법의 전압자극에 대해 ATP 10 μM과 suramin 30 μM을 함께 투여하였을 때, 동일한 세포에 대하여 ATP 단독 투여에서 관찰되던 내향성 전류의 크기가 suramin과 함께 투여함으로써 평균 50.5±12.7% 감소되는 것이 관찰되었다(n=3)(Fig. 7). 가장 강력한 억제제로 알려진 PPADS 30 μM을 ATP 10 μM과 함께 투여한 결과 ATP에 의한 전류 반응이 거의 대조군 수준으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 8).

퓨린 수용체 촉진제의 투여효과
   퓨린 수용체 촉진제인 α,β-meATP 30 μM을 투여하였다. 같은 조건의 자극, 즉, 유지전압을 0 mV로 고정하고 -80 mV의 전자극을 500 msec간 준 다음 -140 mV부터 +10 mV까지 10 mV 간격으로 계단자극을 주었을 때 ATP 투여에 비해 현저하게 작긴 하나 내향성 전류가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다. 최대자극인 -140 mV에서 전류의 크기는 대조군의 -16.2±2.9 pA/pF에 비해 -27.7±3.8 pA/pF로 증가하였다(n=5)(Fig. 9).

고     찰

   와우 내에 존재하는 외유모 세포와 지지세포들에 ATP가 ligand로 작용하는 퓨린 수용체들이 존재하여 코티기관 내부의 퓨린 수용체의 활성화가 와우역학의 조절에 있어 강력한 역할을 하고 있다는 증거를 보여주는 연구결과가 늘어나고 있다.¹²⁾¹³⁾
   본 연구에서 Deiters 세포에 대해 whole-cell patch clamp 방법으로 측정한 세포막 전류는 ATP를 투여한 후 내향전류를 나타내었으며 Chen 등¹⁴⁾에 의하면 이러한 전류반응은 세포 외 용액에서 칼슘이온을 제거함으로써 감소되므로 ATP를 이용하는 수용체가 P2x형의 퓨린형 수용체임을 시사한다고 하였다. 또한 ATP 투여로 인한 DPOAE (distortion product otoacoustic emissions)의 발생억제효과가 퓨린 수용체의 길항제인 suramin에 의해 감쇄된다는 보고가 있어 퓨린 수용체가 와우의 청각신호전달 체계를 조절하는 기전이 될 수 있다는 전기생리학적 연구 결과가 제시된 바 있다.⁹⁾¹²⁾
   본 연구에서 평균 -21 mV 내외의 안정막전압이 ATP 투여 후 평균 -3 mV에 이르는 탈분극을 보인 점, ATP 투여로 유발된 내향성 전류의 전류-전압 관계 곡선의 형태, 그리고 곡선상의 역전전압이 -20 mV 내외였던 점으로 보아 Deiters 세포의 ATP-gated 이온 통로는 비선택적 양이온 통로(non-selective cation channel)일 가능성이 많다. Chen 등¹⁵⁾은 기니픽의 외유모세포에 Ach과 ATP를 각각 100 μM 투여하여 이와 같은 내향성 전류의 존재를 확인하였고, 이 전류의 내향성이 0 mV이하의 음전압 부과시에 주로 관찰된다고 하여 본 연구와 유사한 결과를 외유모세포를 이용한 실험을 통해 보고하였다. 이 내향성 전류는 나트륨 이온과 칼슘이온에 의해 발생될 것으로 추측되나¹³⁾ 전류를 구성하는 이온성분에 대해서는 향후 구체적인 연구가 더 진행되어야 할 것으로 생각된다.
   Chen 등¹⁵⁾은 기니픽의 외유모세포에 대한 ATP과 Ach 투여실험 모두에서 내향성 전류가 관찰된 것과 달리, 백서에서는 Ach에만 전류반응이 일어나고 ATP 투여 후에는 내향성 전류가 관찰되지 않은 이유로서 세포의 분리과정중 수용체 손상의 가능성을 제시하고 물리적으로 세포를 분리하는 과정의 문제를 지적하였다. 본 연구에서 Ach의 투여 후에 전류의 변화가 관찰되지 않은 점에 대해서는, Deiters 세포의 Ach에 대한 반응성이 외유모세포와는 다를 가능성이 크며, 수용체의 손상 가능성 또한 원인의 하나로 생각된다. 이에 대해서는 더 많은 숫자의 세포를 대상으로 한 연구가 필요하다고 생각된다.
   조직화학 염색을 통한 P2x 수용체의 분포에 대한 연구에서 Lagostena 등¹⁶⁾은 Deiters 세포에 대한 ATP의 작용 부위를 두 개의 경로로 설명하였다. 즉, 음 자극이 증가하면서 와우관(scala media)내에 분비된 ATP가 내림프액에 phalangeal process가 면한 부위로 작용하는 경로가 그 하나이며, 다음으로는 코티기관 내의 신경전달이 일어나면서 다른 신경전달 물질들과 co-package되어 있던 ATP가 함께 분비되어 Deiters 세포가 외림프액에 접한 부위에 작용하는 경로이다. 따라서, 조직 손상 후 세포주위 ATP 농도의 증가는 칼슘이온에 고투과성인 P2x 수용체의 활성화를 초래하고, Deiters 세포는 이를 통해 외유모세포에 인접한 Nuel 협강(narrow space of Nuel) 내부의 칼슘이온의 농도 또한 조절할 수 있다고 생각된다. 또한 칼슘이온에 대한 영상 실험을 통해 세포 내에 저장되어 있던 칼슘이온이 ATP에 반응하여 분비됨이 관찰되었고, 따라서 세포 내 저장된 칼슘이온의 분비를 유발시켜 세포 내 이차 신호 전달계를 활성화시키는 P2y 수용체도 작용할 것으로 생각할 수 있다.¹⁶⁾
   코티기관 내에 존재하는 거의 모든 지지세포들은 gap junction을 갖고 있으며 이러한“상피세포 gap junction 체계(epithelial gap junction system)”의 기능은 유모세포에서 수용체전압(receptor potential)을 발생시킨 후 다시 유모세포 밖으로 나온 칼륨이온(K⁺)을 내림프액 내로 돌려보내 재순환시키는 통로의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾ 그러므로 Deiters 세포는 평상시에 칼륨이온의 재순환 과정에 기여하고 있다가, 과다한 소음노출과 같은 자극에 노출될 때 ATP 농도의 증가로 인한 세포막 탈분극이 일어나고 동시에 내향성 전류에 의한 세포 내 반응과 이에 따른 세포의 수축이 발생한다. 그리고 이러한 스트레스반응은 곧바로 외향성 칼륨전류에 의한 재분극으로 안정화된다고 해석할 수 있다. 즉, 외유모 세포를 과도한 자극으로부터 보호하는 역할이 일시적으로 수행되나, Deiters 세포의 흥분이 짧은 시간 내에 해소됨으로써 외유모 세포의 청각신호전달 기능이 다시 회복될 것으로 추측된다. Deiters 세포의 재분극 과정에 관여하는 칼륨이온 전류가 세포 내 칼슘이온 농도의 증가로써 활성화되는 칼슘이온-의존성의 외향성 칼륨이온 전류인지, 아니면 칼슘이온-비의존성의 정류성 외향전류인지, 혹은 두 가지 모두가 작용하는 지에 대해서는 향후 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.
   퓨린 수용체 중 P2x 수용체는 그 아형(subtypes)이 7개 이상으로 알려져 있고,¹³⁾¹⁸⁾ 퓨린 수용체의 억제제나 촉진제에 대한 감수성은 P2x 수용체의 아형을 구별하는 유용한 기준들 중 하나로 이용되기도 한다.¹⁹⁾ 그러나 본 연구에서 관찰된 suramin이나 PPADS에 의한 억제효과의 정도나, 촉진제인 α,β-meATP에 대해 나타난 전류 반응의 크기로써 Deiters 세포에서 발현되는 주된 수용체 아형의 종류를 추측하는 것은 어려울 것으로 생각된다. 밝혀진 아형들 외에도 수용체 아형에 대한 접합 변형(splice variants)들이 존재하고,²⁰⁾ 또 P2y 수용체를 통한 전류 반응도 참여하고 있다는 주장¹⁶⁾이 있기 때문이다.

결     론

   기니픽 코티기관에서 분리한 Deiters 세포는 신경전달물질인 ATP의 투여에 의해 내향성 전류를 발생시키는 퓨린 수용체를 갖고 있으며 수용체 억제제인 suramin이나 PPADS에 의해 전류의 발생이 억제된다. 퓨린 수용체를 통한 이온 통로의 조절은 지지세포가 청각신호전달과정을 조절하는 기전의 하나로 생각된다.

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