교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   점액소(mucin)는 대부분이 분비성 상피세포에서 분비되는 고분자의 당단백(glycoprotein)으로 인체의 호흡계, 위장관계 및 생식계의 점막에서 분비되어 윤활작용을 담당하며, 특히 상기도와 하기도에서는 정화작용에 중요한 역할을 한다.¹⁾ 그러나 만성기관지염이나 천식, 낭종성섬유증, 만성부비동염 등과 같은 기도염증 질환에서는 점액이 과다하게 분비되거나 점도가 변하여 여러 가지 문제를 일으킨다. 이와 같은 점액의 과분비성 질환(hypersecretory disease)에서는 점막하 분비선 및 배세포(goblet cell)의 비후 혹은 과증식과 같은 현상을 관찰할 수 있는데, 이것은 점액을 합성하는 세포의 비정상적인 성장 및 분화와 관계가 있다.
   한편 지금까지 알려진 점액유전자 중 호흡기에서는 MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7과 MUC8 등이 중요한 점액유전자이다.²⁾³⁾ 특히 MUC5AC가 가장 중요한 호흡기 유전자이며, 사이토카인이나 염증성 매개물질 등에 의해 MUC5AC 점액유전자가 발현이 된다.⁴⁾⁵⁾
   천식과 같은 염증성 기도질환에서는 Interleukin-1β(IL-1β)의 농도가 상승되어 있으며 상승된 IL-1β의 농도는 증상의 심한 정도와 밀접한 관계가 있다.⁶⁾ 한편 최근 연구에 의하면 IL-1β가 점액생성에 관여한다는 보고가 있고,⁷⁾⁸⁾ 그 외 몇 가지 종류의 사이토카인(cytokine) 등이 점액분비를 유도하는데 그 발현기전은 완전히 밝혀지지 않은 상태이다.⁹⁾¹⁰⁾
   여러 종류의 세포에서 다양한 자극에 의해 점액생성이 촉진되는 과정에 protein kinase C(PKC),¹¹⁾ mitogen-activated protein kinase(MAPK),¹²⁾ epidermal growth factor(EGF)⁴⁾ 등이 관련된다는 보고가 있으나, IL-1β에 의한 점액 생성과정의 신호전달체계는 명확하지 않다.
   Prostaglandin(PG)은 여러 가지 염증반응과 관련이 있으며¹³⁾ cyclooxygenase(COX)에 의해 arachidonic acid가 PGH₂로 전환되고, 다시 이것이 대사되어 다양한 종류의 PG과 thromboxan으로 전환된다. COX는 두 가지 형태가 있는데, COX-1은 정상 세포에서 발현되어 세포의 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며 COX-2는 정상적인 환경에서는 존재하지 않거나 아주 미약한 농도로만 존재하지만, 사이토카인과 성장인자 및 종양 촉진제(tumor promotor) 등에 의해 생성이 빠르게 유도되어 염증이나 발암에 관여하는 PG 합성에 중요한 역할을 한다. 이러한 PG 중 PGE2는 인체의 폐조직에 존재하는 arachidonic acid의 주 대사산물 중 하나로 그 역할은 아직 분명하지 않지만, PGE₂가 대장세포에서 점액 분비를 조절한다는 보고가 있다.¹⁴⁾
   이상의 사실로 미루어 보면 염증반응에 관여하는 COX-2와 그 대사 산물이 호흡기의 점액 분비를 조절하는데 관여할 것으로 생각된다. 지금까지 알려진 연구결과에서 IL-1β는 상피세포에서 점액분비를 유도한다는 것을 알 수 있지만, 여기에 관여하는 특이적인 신호전달경로는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 이에 저자들은 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의해 유도되는 점액유전자의 발현과 점액 생성에 관여하는 신호전달체계를 관찰하고, 특히 COX-2와 PGE₂와의 관계를 밝히고자 하였다. 또한 점액 분비에 있어서 COX-2와 PGE₂가 관여한다면 그 상위에 어떠한 신호전달물질이 관계하는지를 조사하였다.

재료 및 방법

실험재료
   인체 폐점액표피양 암세포주인 NCI-H292 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 사용하였다.
   실험에 사용한 사이토카인은 human recombinant IL-1β(R&D Systems, Minneapolis, MN)이며, 세포배양은 RPMI 1640 배지와 fetal calf serum(FCS, GibcoBRL, Grand Island, NY)을 이용하였다. 신호전달체계를 알아보기 위해 사용된 억제제는 NS398, resveratrol, Ro31-8220, PD98059, SB203580(Biomol Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA)을 사용하였다. 각종 항체, 즉 extracellular-regulated kinase 2(ERK2), anti-mouse IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), rabbit polyclonal COX-2 항체(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugate(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA), phospho-ERK1/2, phospho-p38 항체(New England BioLabs, Beverly, MA), MUC5AC 항체(NeoMarkers Inc., Fremont, CA) 등을 사용하였다.

세포배양 및 처리
   NCI-H292 세포를 6-well plate에 1×10⁶/ml의 세포 수로 RPMI 1640 배양액(10% FCS, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml, 2 mM L-glutamate를 추가)에 37°C, 5% CO₂에서 배양하였다. 80% 융합단계(confluent stage)가 되면 세포를 24시간 동안 0.5% FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 각 억제제 또는 IL-1β를 처리하였다. IL-1β의 처리 농도 변화에 따른 MUC5AC, COX-2, PGE₂의 생성을 보기 위한 실험에서는 IL-1β를 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml의 농도로 투여한 후 RPMI 1640 배양액(0.5% FCS, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml, 2 mM L-glutamate를 추가)에서 37°C, 8시간 동안 배양하여 IL-1β에 의한 PGE₂, COX-2, MUC5AC 등의 발현 양상을 관찰하였고, 억제제의 작용을 보기 위한 실험의 경우 80% 융합단계에서 24시간 동안 0.5% FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하고 PBS로 세척한 후 각 억제제를 먼저 투여하고, 1시간 뒤에 IL-1β 20 ng/ml로 처리한 후 37°C에서 8시간 동안 배양하였다.

PGE₂ assay
   PGE₂의 측정은 EIA(enzyme immunoassay) 키트(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하였다.‘세포배양 및 처리’에서 설명한대로 세포배양과 IL-1β 및 각 억제제 처치를 하고 반응시킨 후 냉각한 PBS로 세척하였다. Trypsin 처리 후 4°C에서 700×g로 침전시켜 침전된 세포를 lysis buffer(50 mM Tris·Cl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 다시 부유시켰다. 이것을 다시 원심분리를 하여 세척한 다음 상청액을 whole-cell lysate로 보관하였다. 여기서 얻어낸 whole-cell lysate 100 μl를 피펫을 사용하여 96-well plate에 담은 후 마우스 다클론 PGE₂ 항체와 PGE₂를 각 well에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 well을 PBS로 6회 세척한 뒤 tetramethylbenzidine 기질을 첨가하였다. 30분 후 각 well을 ELISA 판독기로 670 nm에서 측정하였다.

Western blot에 의한 단백 측정
‘세포배양 및 처리’에서 설명한대로 세포배양과 처리를 하고 냉각한 PBS로 세척하였다. Trypsin 처리 후 4°C에서 700×g로 침전시켜 침전된 세포를 lysis buffer(50 mM Tris·Cl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 다시 부유시켰다. 이것을 다시 원심분리를 하여 세척한 다음 상청액을 whole-cell lysate로 보관하였다. 여기서 얻어낸 정량된 단백(50 μg)을 10% SDS-polyacrylamide gel에 주입하여 2시간 동안 20 mA에서 전기영동을 하였다. 분리된 단백은 300 mA로 3시간 동안 나이트로셀룰로오즈막에 이동시킨 후, 5% non-fat milk로 비특이적 단백 결합을 방지하였다. 각 항체를 1：2,000으로 희석하여 4시간 동안 반응시킨 후, 다시 세척하고 horseradish peroxidase에 결합된 이차항체를 1：5,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 세 번 세척 후 enhanced chemiluminescence(ECL, Amersham Pharmacia Biotech. Inc., Buckingham Shire, England) 시약으로 X-선 필름으로 감광하여 각각의 단백을 확인하였다.

면역분석법(Immunoassay)을 이용한 MUC5AC 점액의 분석
   MUC5AC 점액은 ELISA를 이용하여 측정하였다. 시료를 처리한 NCI-H292 세포에서 점액의 분비양상을 분석하기 위해 lysis buffer로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well에 첨가하여 40°C에서 4시간 이상 방치하여 젤판에 단백을 부착하였다. 2% bovine serum albumin으로 1시간 동안 실온에서 차단한 후, PBS용액으로 세 번 씻어내었다. MUC5AC 일차항체(1：100)를 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후, 이차항체인 horseradish peroxidase-goat anti-mouse IgG conjugate(1：10,000)를 첨가시켜 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세 번 씻은 후 3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색반응을 시켜서 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다. 실험세포군에서 측정된 MUC5AC 점액의 양은 IL-1β를 처리하지 않은 대조세포군에서 검출된 양을 초과하는 만큼의 양을 백분율로 나타내었다.

RT-PCR에 의한 MUC5AC 점액유전자의 분석
   총 mRNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 추출하였다. MUC5AC mRNA의 측정은 변형된 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다.⁸⁾ 총 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase (Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 인체 MUC5AC 점액유전자의 sense와 antisense를 사용하였다. 인체 MUC5AC 점액유전자의 primer 염기서열(Genbank acession no. U0671)은 sense는 5’-ATC ACC GAA GGC TGC TTC TGT C이며, antisense는 3’- GTT GAT GCT GCA CAC TGT CCA G이다. PCR 과정은 초기 가열을 95°C에서 3분간 실시한 후 변성은 95°C/1분, 60°C/1분, 72°C/1분간을 34 cycles을 실시하고 신전(extension)은 72°C에서 20분간 실시하였다. PCR의 산물은 50 ng/ml의 ethidium bromide가 들어있는 1% Tris-boric acid-EDTA 완충용매에서 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하였다. 띠(band)의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다.

결     과

IL-1β에 의한 MUC5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비
   호흡기 상피 암세포에서 IL-1β에 의해 MUC5AC 점액유전자와 점액이 생성되는지를 알아보기 위해 NCI-H292 세포에서 MUC5AC의 mRNA가 발현되는 정도를 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. NCI-H292 세포에 IL-1β을 처리하였을 때 MUC5AC mRNA가 IL-1β의 농도에 비례하여 증가하였다(Fig. 1A). MUC5AC 점액의 생성정도는 특이 항체를 사용한 면역분석법을 이용하여 분석하였는데, 유전자 발현에서와 마찬가지로 IL-1β 처리농도에 비례하여 점액의 생성량이 증가하였다(Fig. 1B). IL-1β 투여 시간에 따른 점액유전자의 발현과 점액의 분비 양상은 MUC5AC 유전자의 경우 IL-1β(20 ng/ml) 처리 후 8시간째에, 점액의 경우 12시간째에 최대치를 나타내었다(Fig. 2A and B).

IL-1β에 의해 유도된 COX-2와 PGE2의 발현
   COX-2가 점액을 생성하는 신호전달경로에 관여하고 있는지를 알아보기 위해 먼저 IL-1β가 COX-2 단백과 PGE₂의 합성을 유도하는지를 조사하였다. 배양된 세포에 IL-1β를 다양한 농도(0.02~20 ng/ml)로 처리하고 8시간 동안 반응시킨 후 COX-2 항체를 이용하여 Western blot으로 분석하였다. IL-1β의 농도가 20 ng/ml일 때 COX-2의 발현이 최대로 나타났으며, PGE2의 경우 IL-1β의 처리농도에 비례하여 생성량이 증가하였다(Fig. 3A). IL-1β처리 후 시간경과에 따른 COX-2의 발현 양상은 IL-1β(20 ng/ml) 처리 후 2시간째부터 COX-2의 합성이 신속하게 이루어졌다. COX-2 발현양은 IL-1β 처리 후 8시간째에 최대치에 도달하였고 12시간까지 유지되었다(Fig. 3B). 

COX-2 및 PGE2에 의한 MUC5AC 점액의 조절
   IL-1β의 자극에 의해 MUC5AC 생성이 촉진되는 과정에서 COX-2가 중요한 역할을 하는지를 확인하기 위해, COX-2가 활성화되었을 때의 생성물인 PGE₂의 효과에 대해 알아보았다. 세포에 다양한 농도의 PGE₂를 처리한 후 8시간 동안 반응시켰다. PGE₂의 처리농도가 높을수록 그에 비례하여 MUC5AC 유전자도 높게 발현되었으며(Fig. 4A), MUC5AC 점액도 PGE₂에 의해 생성이 촉진되었다(Fig. 4B).
   COX-2가 활성화되어 MUC5AC의 발현을 유도할 것이라는 가정을 증명하기 위해 COX-2 억제제를 이용하여 MUC5AC와 PGE₂의 변화를 관찰하였다. COX-2에 대한 특이적 억제제인 NS398(5 μg)을 NCI-H292세포에 전처치했을 때, IL-1β에 의한 MUC5AC와 PGE₂의 생성이 억제되었다(Fig. 5A and B). 또 다른 COX-2 억제제로 알려진 resveratrol(100 mM)을 전처리 하였을 때도 IL-1β에 의한 MUC5AC 생성이 부분적으로 억제되었고(Fig. 6A), COX-2의 발현도 감소하였다(Fig. 6B).

Mitogen-Activated Protein Kinases(MAPKs)에 의한 MUC5AC의 생성조절
   인산에 대한 특이적 항체(phospho-specific anibody)를 이용한 Western immunoblotting으로 MAPKs의 인산화를 측정하여, IL-1β에 의해 NCI-H292 세포에서 MAPKs가 활성화되는지 알아보기로 하였다. IL-1β에 의해 ERK1/ 2와 p38의 인산화가 증가하였다(Fig. 7). 인산화는 ERK1/ 2와 p38 모두에서 IL-1β처리 후 20분 경에 최대치를 나타내었다. IL-1β의 자극에 의한 COX-2와 MUC5AC의 발현에 ERK1/2와 p38이 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해서, MEK/ERK 경로를 선택적으로 억제하는 PD98059 (50 μM)와 p38에 특이적인 억제제인 SB203580(5 μM)을 각각 1시간 동안 세포에 전처리하고 IL-1β(20 ng/ml)를 첨가한 후 8시간 뒤에 COX-2 및 MUC5AC의 발현을 측정하였다. 두 억제제는 IL-1β에 의한 MUC5AC의 생성을 강하게 억제하였고(Fig. 8A), 동시에 COX-2의 발현도 감소시켰다(Fig. 8B).

PKC에 의한 MUC5AC 생성 조절
   IL-1β에 의한 MUC5AC의 생성에 관여하는 신호전달경로에 PKC의 활성화가 관련되어 있는지, 그리고 관계 있다면 어느 단계에서 관여하는지 알아보기 위해 PKC 억제제인 Ro31-8220을 이용하여 실험하였다. NCI-H292세포를 Ro31-8220(2 μM)으로 1시간 동안 전처치하고 IL-1β(20 ng/ml)를 8시간동안 처리하였을 때, IL-1β에 의한 MUC5AC 유전자와 점액 생성이 억제되었다(Fig. 9A). 동시에 IL-1β에 의한 COX-2의 발현정도가 감소하였으며(Fig. 9B), ERK1/2와 p38의 인산화도 억제되었다(Fig. 9C).

고     찰

   이 연구에서는 기도상피세포에서 IL-1β가 PGE2를 통해 MUC5AC의 합성을 자극하는지, 또한 PKC와 MAPKs가 IL-1β에 의한 MUC5AC 점액생성의 신호전달경로에 관여하는지에 대해 알아보았다. 결과에서 보았듯이 IL-1β는 COX-2의 발현과 PGE₂의 합성을 증가시켰을 뿐 아니라 MUC5AC의 발현도 촉진시켰다. 또 이러한 반응들은 COX-2에 특이적인 억제제인 NS398와 resveratrol에 의해 모두 억제되었다. PGE₂를 처리하였을 때 MUC5AC의 발현이 촉진되었는데, 이는 MUC5AC 점액과 COX-2 신호전달경로가 연관되어 있음을 시사한다. 더욱이 MEK/ERK 억제제인 PD98059와 p38 억제제인 SB203580, 그리고 PKC 억제제를 전처치한 경우 MUC5AC의 생성과 COX-2 발현이 억제되었다. 이러한 결과로 보아 IL-1β가 PKC와 MAPK 및 COX-2에 의한 신호전달경로를 통해 MUC5AC를 생성을 유도해 낸다고 할 수 있다.
   IL-1β가 MUC2 유전자와 그 단백의 합성을 상향조절한다는 사실⁸⁾이 밝혀지긴 하였으나, 점액유전자의 발현에 관여하는 신호전달경로와 그 조절기전에 대해서는 아직 정확히 알려진 바가 없다. 또 그 이전의 많은 연구자들도 점액에 관한 많은 연구를 하였지만 점액 생성을 활성화시키는 신호전달경로에 대해서는 아직 그 연구결과가 부족한 실정이다. MAPK는 점액 생성과 상피세포의 분화에 관여하는 신호전달경로에서 중요한 물질이다.¹²⁾¹⁶⁾ Li 등¹⁷⁾은 상피세포에서 세균 생성물에 의해 점액이 생성되는 과정에 Ras/MEK/ERK가 신호전달에 관련된다고 하였다. Takeyama 등⁴⁾은 상피세포에서 산화적 스트레스가 점액의 생성을 유도하는 것은 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)에 의해 ERK 경로가 활성화되어 나타난다고 하였다. 그러나 이러한 연구들도 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의한 점액생성이 ERK나 p38과 직접적인 관련이 있는지는 언급한 바가 없었다.
   이 연구에서는 두 MAPK, 즉 ERK와 p38이 IL-1β의 자극에 반응하여 활성화되었으며 시간에 따른 변화 양상도 유사하여 IL-1β의 자극 후 20분에 최대의 활성도를 나타내었다. 또 ERK의 활성을 억제하는 약제인 PD98059와 p38억제제인 SB203580에 의해 IL-1β에 의한 MUC5AC의 생성이 강하게 억제되었고, 이러한 결과는 NCI-H292세포에서 ERK와 p38이 MUC5AC 점액생성의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 그리고 또 한가지 유의해야 할 사실은 PD98059와 SB203580이 IL-1β에 의한 MUC5AC의 생성을 억제하는 정도가 COX-2 발현을 억제하는 정도와 비례하였다는 점이다. 따라서 이들은 ERK와 p38 신호전달경로에 의해 COX-2의 발현이 증가하고 다시 COX-2에 의해 MUC5AC의 합성이 촉진된다는 것을 시사한다.
   다음 단계로 IL-1β가 어떤 경로를 통해 MAPK를 활성화시키는가 하는 것이다. PKC는 IL-1β의 자극에 의해 유전자 발현이 일어나는 과정에 관여하는 중요한 매개물질이다. PKC를 활성화시키는 염증성 매개물질에는 여러 가지가 알려져 있는데 전구염증성 사이토카인인 IL-1β와 TNF-α가 상피세포에서 PKC의 활성화를 자극한다.¹⁸⁾¹⁹⁾ 또 여러 연구자들이 다양한 세포에서 PKC가 점액생성에 관여한다고 하였다.¹¹⁾ 본 연구에서는 IL-1β에 의한 점액생성이 PKC 억제제인 Ro31-8220에 의해 억제됨을 알 수 있었는데, 이것은 IL-1β에 의해 유도되는 MUC5AC 점액의 생성에 관련된 신호전달경로에 PKC의 활성이 필요하다는 것을 의미한다. 그리고 Ro31-8220은 IL-1β의 자극에 의한 ERK와 p38의 인산화와 COX-2의 발현을 억제하였다. 이런 결과를 본다면 IL-1β에 의해 유도되는 점액의 생성에는 PKC의 활성이 필수적이고 PKC는 ERK와 p38보다 상위단계에 위치한다고 할 수 있다. 한편 Ro31-8220은 PKC를 억제하는 효과 이외에도 mitogen- and stress -activated protein kinase-1(MSK1)를 비롯한 다양한 protein kinase를 억제한다고 알려져 있으므로,²⁰⁾ Ro31-8220에 의한 COX-2 억제작용이 반드시 PKC를 억제하는 것에만 의하지 않고 다른 protein kinase를 억제함으로써 나타날 가능성도 배제 할 수 없을 것이다.
   IL-1β를 처리하지 않고 resveratrol이나 Ro31-8220만을 처리한 경우 MUC5AC 점액의 생성이 증가되는 것을 관찰할 수 있었는데, 이 억제제들이 IL-1β에 의한 MUC 5AC의 합성경로에는 억제작용을 하나 그 물질 단독으로는 MUC5AC의 합성을 증가시키는 작용이 있지 않을까 하는 유추를 해 볼 수 있다. 또 억제제를 이용한 실험의 결과만으로 억제목표물질, 즉 PKC, MAPKs, COX-2 등이 신호전달 경로에 반드시 관여한다는 절대적인 단정은 할 수 없으며, 이의 뒷받침을 위해서는 더 다양한 억제제를 이용한 실험으로 증명해보는 것도 필요할 것이다. 그리고 PKC-MAPK-COX-2-PGE2경로내에 존재할 수 있는 세부적인 경로와, 이 경로 이외의 다른 경로에 의한 MUC5AC 발현의 가능성에도 관심을 갖고 확대된 연구를 시행해야 할 것으로 생각된다.
   결론적으로 IL-1β는 MUC5AC 점액의 생성을 상향조절하는 역할을 한다고 생각되며, 여기에는 PKC와 MAPK가 차례로 활성화되고 이에 의해 COX-2가 발현되어 PGE2의 생성이 증가되는 과정이 필요하다. 이러한 사실은 기도염증질환이 있을 때 PGE2의 생성을 저해하거나 PKC, 또는 ERK와 p38 신호전달경로를 차단하는 방법으로 점액과다분비를 조절할 수 있는 이론적 바탕이 될 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   인간의 호흡기 상피 암세포를 IL-1β로 자극했을 때 PKC의 활성화를 거쳐 ERK나 p38이 COX-2의 생성을 유도하여 PGE2를 거쳐 MUC5AC 점액의 생성이 증가하는 것으로 생각된다.

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