교신저자：이형석, 133-792 서울 성동구 행당동 17번지  한양대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   구강 및 구인두 편평 세포암종에서 종양의 침윤과 전이는 환자의 예후에 중요한 영향을 미치는 인자 중의 하나이다.¹⁾ 세포외 기질의 파괴 및 통과 과정은 종양의 침윤과 전이과정에 중요하다. 이러한 종양세포의 이동은 종양 세포의 기저막 부착과 종양 세포에서 분비하는 효소에 의한 기저막의 파괴를 통해 발생된다.²⁾³⁾ 기저막은 Ⅳ형 교원질, laminin, entactin, fibronectin, heparan sulphate proteoglycan 등으로 구성되어 있다.⁴⁾⁵⁾
   Laminin은 분자량이 큰 기저막 당단백질이다. 최근 적어도 10가지 다른 laminin chain들이 있고 11가지의 아형이 존재한다. 여러 아형 중 Laminin-5는 α3β3γ2의 3개 아미노산 사슬로 구성된 기저막 당단백질이다. 이는 anchoring filament의 주요 구성단백질로서 기저 각질세포(basal keratinocyte)의 hemidesmosome과 기저막을 연결시켜 각질세포(keratinocyte)의 유착에 중요한 역할을 한다.⁴⁾ Laminin-5는 침윤성암의 상피-기질 접면에서 발현되며 종양의 침윤과 조직 재배열시 세포의 이동에서 중요한 역할을 한다.⁵⁾
   이에 저자들은 32명의 구강 및 구인두 편평 세포암종 환자에서 면역 조직화학적 염색방법으로 laminin-5γ2 chain의 발현 정도를 측정하고, 의무기록의 후향적 고찰을 통해 얻어진 조직학적 분화도, 임상병기, 경부 림프절 전이 등의 임상 양상과 비교 분석하여 그 발현도의 예후 인자로서의 유용성을 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 

재료 및 방법

대  상
   한양대학교 병원에서 1991년부터 2000년까지 10년간 구강 및 구인두 편평세포암종으로 수술을 시행 받은 환자중 파라핀 블록의 보존이 양호하였던 32예를 대상으로 하였다. 남녀비는 남자가 20명, 여자가 12명이었으며 연령 분포는 28세에서 81세로 평균 55세였다. 설암이 20예, 설기저암이 4예, 구강저암이 1예, 편도암이 3예, 협부암이 3예, 경구개암이 1예였다. 경부 림프절 전이는 14예에서 있었고 나머지 18예에서는 경부 림프절 전이가 없었다.

방  법 

Laminin-5γ2 chain에 대한 면역조직화학 염색
   구강 및 구인두암 환자의 파라핀 블록에서 4 μm 두께의 절편을 제작하고 면역 반응 염색을 하였다. Xylene과 ethanol로 탈파라핀 및 함수과정을 거친 후 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 세척하고 H₂O₂와 methanol을 1：4로 혼합한 용액에 5분간 반응시킨 다음 PBS 및 protease K(DAKO Co, USA) 용액에 37°C에서 15분간 적용하였다. 일차항체는 rabbit anti-laminin-5γ2 chain(clone GB3, Harlan Sera-Lab Ltd. Sussex, UK)을 1：20으로 희석하여 37°C에서 90분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였고, 이차항체는 biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vectastain Co, USA)를 30분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 이어서 ABC(avidin-biotin complex, Vectast-ain Co, USA)로 30분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 발색은 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 이용하였으며, 1% methylene green으로 대조 염색 후 탈수, 청명 후 봉입하고 광학 현미경으로 관찰하였다. 

면역 조직 화학 염색의 평가
   각 조직에서 laminin염색 발현도는 전체 종양세포중 양성인 종양세포의 백분율을 구하여 측정하였는데 1인의 조직병리 전문의의 판독으로 양성인 종양세포가 전체의 5% 미만인 경우를 음성(-)으로 하고 5~30%가 염색되는 경우는 약양성(+), 31~60%가 염색되는 경우는 중양성(++)으로 61%이상 염색되는 경우를 강양성(+++)으로 구분하였다.

임상적 병기, 조직병리학적 분화도 
   대상 예의 임상적 병기는 1997년 미국 암 협회(AJCC) 기준에 따라 분류하였고, 조직병리학적 분화도는 아주 좋은 경우, 중등도 분화도, 분화도가 나쁜 경우 세 가지로 판정하였다. 

종양 침투 깊이 측정
   병리 기록지를 검토하여 2 mm이하, 2~4 mm 그리고 4 mm이상으로 구분하였다. 침투 깊이가 2 mm 이하는 3예, 2~4 mm인 경우가 7예 그리고 4 mm 이상은 22예였다. 

통계학적 처리
   통계학적 처리는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 Log-likelihood Ratio test, Fisher’s exact test, Kruskal-Wallis test를 시행하고 유의수준은 0.05 미만으로 정하였다.

결     과

   Laminin-5γ2 chain의 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 양성의 경우 주로 세포질에서 갈색으로 강하게 염색되었으며 종양의 중심부보다 변연에서 laminin-5γ2 chain이 강하게 염색되었다(Fig. 1). 구강 및 구인두암 전체 32예중 23예에서 양성을 보였고 양성을 보인 23예중 7예에서 약양성(+), 7예에서 중양성(++), 9예에서 강양성(+++)보였다. 정상 점막의 상피세포에서 laminin-5 γ2 chain 발현은 없었다(Fig. 2).

조직학적 분화도와 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   종양의 조직학적 분화도는 아주 좋은 분화도를 보인 경우가 9예, 중등도 분화를 보인 경우가 11예, 분화도가 나쁜 경우는 12예였다. 분화도가 나쁠수록 laminin-5γ2 chain 발현 빈도가 높은 경향을 보였으나 통계학적 유의성은 없었다(p=0.5135)(Table 1).

종양의 크기(T 병기)와 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   종양의 크기(T 병기)는 1997년 AJCC 기준에 근거하여 T1이 13예, T2가 10예, T3가 4예이고 T4가 5예였다. 종양의 크기와 laminin-5γ2의 발현을 비교해 볼 때 종양의 크기가 클수록 laminin-5γ2 chain의 발현 빈도가 증가하는 양상을 보이나 통계학적 유의성은 없었다(p=0.7553)(Table 2).

림프절 전이와 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   경부 림프절 전이가 있는 경우 93%에서 laminin-5γ2 chain의 발현이 양성이었으며 경부 림프절 전이가 없는 경우는 56%에서 양성으로 경부 림프절 전이가 있는 경우 전이가 없는 경우와 비교하여 laminin-5γ2 chain의 발현이 통계적으로 유의하게 높았다(p=0.0443)(Table 3). 

임상 병기와 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   임상 병기는 1997년 AJCC 기준에 근거하여 제 1 병기가 11예, 제 2 병기가 4예, 제 3 병기가 5예, 제 4 병기가 12예였다. 임상 병기가 높아질수록 laminin-5γ2 chain의 발현 빈도가 높은 경향을 보였으나 통계학적 유의성은 없었다(p=0.1908)(Table 4).

종양 침투 깊이와 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   종양 침투 깊이와 laminin-5γ2 chain의 발현은 침투 깊이가 클수록 발현 빈도가 높은 경향을 보이나 통계학적 유의성은 없었다(p=0.1509)(Table 5). 

생존률과 laminin-5γ2 chain의 발현과의 관계
   Laminin-5γ2 chain의 발현과 환자의 3년 생존률을 비교하였는데 laminin-5γ2 chain이 양성인 군이 음성군에 비하여 생존율이 낮은 경향을 보였으나 통계학적 유의성은 없었다(p=0.0948)(Fig. 3).

고     찰

   구강 및 구인두 편평세포암종에서 종양의 침윤과 전이는 환자의 예후에 중요한 영향을 미치는 인자 중의 하나이다.¹⁾ 전이는 암세포가 원발병소에서 탈출하여 세포외 기질과 기저막의 장벽을 파괴한 후 새로운 곳에서 집락화를 이루는 과정으로 양성 상피 종양과 악성 상피 세포암의 중요한 차이는 기저막 파괴의 여부에 달려있다. 기저막은 Ⅳ형 교원질, laminin, entactin, fibronectin, heparan sulphate proteoglycan 등으로 구성되어 있고 산재되어 있는 세포외기질로서 간질과 실질세포를 구분한다. 기저막은 상피세포, 내피세포, 그 외에 간엽세포에서 생성되며, 조직의 분화 및 organization에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.^4)5)6)7)8)
   Laminin은 1979년 Timpl 등⁶⁾에 의해서 처음 발견되었으며 collagenase에 저항성이 있는 제 Ⅳ 형 collagen의 3번째 사슬에서 기원하는 것으로 알려져 있는 세포 기저막을 형성하는 당단백질이다.⁹⁾ Laminin은 처음 종양세포에서 분리되었으나 laminin의 항체를 이용한 많은 연구에서 신체 내의 여러 조직에 다양하게 분포하는 것으로 보고되었다. Laminin의 역할은 세포 기저막을 형성하는 제 Ⅳ 형 collagen, perlecan, entactin 등과 서로 결합하여 세포와 기질의 부착 기능을 담당하며, 세포의 성장과 이동, 창상 치유, 종양의 증식 및 전이, 이식 조직의 생존, 신경 축삭의 성장 등에 중요한 역할을 한다.^10)11)12) Laminin은 α,β,γ의 3개 사슬로 구성되어지는 십자형태(cruciform-like structure)를 나타내며, 400 kDa의 α사슬로 3개의 globular domain을 형성하며, 200 kDa의 β,γ사슬로 각각 2개의 globular domain을 형성한다.^9)10)11) 각각의 α,β,γ사슬의 아미노산 배열의 차이에 의하여 여러 가지의 아형(subtype)이 존재하며 각 아형이 분포하는 조직은 조금씩 다른 것으로 알려져 있다. 그 중 Laminin-5는 α₃β₃γ₂ 사슬로 구성되며 완전한 laminin-5는 기저막과 기저 각질세포의 hemidesmosome을 연결하여 각질세포의 접착에 중요한 역할을 하며 laminin-5의 분절은 종양세포의 이동을 촉진시킨다고 하였다.¹³⁾¹⁴⁾
   악성 종양에서 보이는 기저막의 소실이 기저막의 형성 또는 기저막 성분의 조합의 감소에 의한 것인지 종양에서 분비된 단백 분해 효소에 의한 기저막 성분의 파괴가 증가되어 나타나는 현상인지는 아직 논란의 여지가 있다.^15)16)17)18) Liotta 등²⁾³⁾은 기저막의 중요성분인 Ⅳ형 교원질 등이 종양세포에서 분비하는 Ⅳ형 교원질 분해효소에 의하여 분해되어 기저막이 파괴되며 이러한 과정이 종양 침습의 첫 단계라고 하였다. Kusukawa 등¹⁾은 구강 및 구인두 편평세포암종에서 원발 병소의 교원질 분해효소의 발현이 증가함에 따라 종양 침윤 및 전이가 증가함을 면역조직화학적으로 관찰하였고, Hirota 등¹⁹⁾은 구강암에서 기저막 성분의 분포 양상이 원발병소의 병기, 침습 형태, 경부전이 여부와 관계가 있다고 하였다. Laminin은 암세포에서 Ⅳ형 교원질 분해효소의 분비를 촉진하며 악성 종양의 침윤 및 전이에 영향을 미치며 최근의 실험에 의하면 전이성 종양세포의 부착능력도 laminin에 의해 촉진된다고 보고되고 있다.
   Pyke 등²⁰⁾은 대장의 선암(adenocarcinoma)에서 laminin-5γ2 chain 발현 증가가 암종의 침범과 관련된다고 보고하였고, Sordat 등²¹⁾도 대장암과 직장암에서 비슷한 연구 결과를 얻었다. Skyldberg 등²²⁾은 laminin-5가 자궁경부암에서 침투도의 민감한 표지자라고 보고하였고 Sushma 등²³⁾은 후두병변에서 laminin-5γ2 chain 음성인 경우 침투암종으로 진행되지 않아 laminin-5γ2 chain양성도가 암종진행의 유의한 위험인자로 작용함을 증명하였다. Yukiko 등²⁴⁾은 설암에서 조직학적으로 침윤성이 높을수록, 분화도가 낮은 암종일수록 laminin-5γ2 chain 발현이 유의성있게 높았으나 경부 림프절 전이나 임상병기, 종양 침투 깊이와의 연관성의 통계학적 의의는 없는 것으로 보고하였다. 본 연구의 결과에서 laminin-5γ2 chain의 발현은 조직학적 분화도가 높을수록, 종양의 크기(T병기)가 증가할수록, 임상 병기가 높을수록, 종양 침투 깊이가 클수록 증가하는 경향을 보였으나 통계학적 의미는 없었고(p>0.05) 경부 림프절 전이가 있을때 laminin-5γ2 chain의 발현 빈도가 통계학적으로 의미있게 증가하였다(p=0.0443). 임상병기와 경부 림프절 전이는 구강 및 구인두 편평세포암의 중요한 예후인자이며 본 연구에서도 이러한 예후인자와 laminin-5γ2 chain의 발현 빈도가 연관이 있었으며 laminin-5γ2 chain의 발현이 양성인 군에서 음성인 군에 비해 생존율이 감소하는 경향을 보였다. 
   이상의 연구결과로 미루어 laminin-5γ2 chain 발현 증가가 구강 및 구인두 편평세포암에서 암의 증식, 침윤 및 전이에 관여하며 특히 경부 림프절 전이를 예측할 수 있는 중요한 생물학적 인자라 사료된다. 향후 연구대상수를 늘리고 추적 관찰기간을 늘려 추가적인 보강 연구가 필요할 것으로 생각되며 laminin-5γ2 chain이 구강 및 구인두암의 침투 및 전이에 관여하는 기전을 밝히려는 분자생물학적 연구가 필요할 것으로 사료된다. 

결     론

   구강 및 구인두 편평 세포 암종에서 laminin-5γ2 chain에 대한 발현 빈도와 그 정도를 조직학적 분화도, 종양의 크기, 림프절 전이, 임상 병기와 종양 침투 정도의 임상 양상과 비교 분석한 결과 경부 림프절의 전이가 있을 경우 laminin-5γ2 chain의 발현 빈도가 통계학적으로 유의하게 높았다(p=0.0443).
   이상의 결과로 미루어 laminin-5γ2 chain 발현 증가가 구강 및 구인두 편평세포암에서 경부 림프절 전이를 예측할 수 있는 중요한 생물학적 예후인자라 사료된다.

1. Kusukawa J, Sasaguri Y, Shima I, Kameyama T, Morimatsu M. Expression of matrix metalloproteinase-2 related to lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Am J Clin Pathol 1993;99:18-23.

2. Liotta LA, Rao CN, Barsky SH. Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab Invest 1983;49:636-49.

3. Liotta LA. Tumor invasion and metastasis. Role of the extracellular matrix. Cancer Res 1986;46:1-7.

4. Risteli L, Risteli J. Basement membrane reserch. Med Biol 1981; 59(4):185-9.

5. Stanley L, Woodley DT, Katz SI, Martin GR. Structure and function of basement membrane. J Invest Dermatol 1982;79 Suppl 1:69s-72s.

6. Timpl R, Wiedemann H, van Delden V, Furrthmayr H, Kuehn K. A network model for the organization of type IV collagen molecules in basement membranes. Eur J Biochem 1981;120(2):203-11.

7. Vrako R. Basal lamina scaffold-anatomy and significance for maintenance of orderly tissue structure. Am J Pathol 1974;77(2):314-46.

8. Cho JS, Kim JS, Shim WJ, Kim SH, LIm SC, Lee CW, et al. A study on the Type IV Collagen Expression in the Basement Membrane surrounding the Cancer Nest and Cervical Lymph Node Metastasis of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:1554-62.

9. Monique A, Neil S. The role of laminins in basement membrane function. J Anat 1998;193:1-21.

10. Katherine MM, Hynda KK. The laminins. Int J Biochem Cell Biol 1996;28:957-9.

11. Campell JH, Terranova VP. Laminin: molecular organization and biological function. J Oral Pathol 1998;17:309-23.

12. Terranova VP, Lyall RM. Chemotaxis of human gingival epithelial cells to laminin: A mechanism for epithelial cell apical migration. J Periodontol 1986;57:311.

13. Koshikawa N, Gianellin G, Cirukku V, Miyazki K, Qaranta V. Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration over liminin-5. J Cell Biol 2000;143:615-24.

14. Haas KM, Berndt A, Stller KJ. Hyckel P, Kosmhl H. A comparative quantitative analysis of laminin-5 in the basement membrane of normal, hyperplastic and malignant oral mucosa by confocal immunofluorescence imaging. J Histochem Cytochem 2001;49:1261-8.

15. Albrechtseb R, Nielsen M, Wewer U, Engvall E, Ruoslahtj E. Basement membrane changes in breast cancer detected by immunohistochemical staining for laminin. Cancer Res 1981;41:5076-81.

16. Barsky SH, Siegal GP, Jannotta F, Liotta LA. Loss of basement membrane components by invasive tumors but not by their benign counterarts. Lab Invest 1983;49:140-7.

17. Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S, Hart I, Foltz CM, Shafie S. Metastatic potential correlations with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature 1980;284:67-8.

18. Salo T, Liotta LA, Keski-Oja K, Turpeenniemi-Hujanen T, Tryggvason K. Secretion of basement membrane collagen degrading enzyme and plasminogen activator by transformed cells-role in metastasis. Int J Cancer 1982;30(5):669-73.

19. Hirota J, Yoneda K, Osaki T. Basement membrane type IV collagen in oral squamous cell carcinoma. Head Neck 1990;12:400-5.

20. Pyke C, Roemer J, Kallunki P, Lund LR, Ralfkiaer E, Danoe K, et al. The γ2 chain of Kalinin/Laminin-5 is preferentially expressed in invading malignant cells in human cancers. Am J Pathol 1997;145: 782-91.

21. Sordat I, Boman FT, Dorta G, Rouselle P, Aberdam D, Blum AL. Differential expression of laminin-5 subunits and interferin receptors in human colorectal neoplasia. Pathol 1998;185:44-52.

22. Skylderberg B, et al. Laminin-5 as a marker of invasiveness in cancer in situ cervical lesions. J Cancer Inst 1999;91:1881-7.

23. Sushma N, Ulrike K, Gert A, Anders H, Johan L, Staffan E, et al. Laminin-5 as a predictor of invasiveness in cancer insitu lesions of the larynx. Anticancer research 2001;21:509-512.

24. Yukiko O, Yukihiro N, Yoshinori I, Toshiro N, Tesshi Y, Kimio Y, et al. Set Clinicopathologic significance of laminin-5 γ2 chain expression in squamous cell carcinoma of the tongue. Cancer 1999;85: 2315-21.