교신저자：조진생, 301-070 대전광역시 중구 목동 24번지  을지의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   그 동안 행해졌던 많은 연구에도 불구하고 소음에 의한 와우세포의 손상에 관한 기전은 아직 명확히 알려져 있지 않고 있다. 오래 전부터 소음에 의한 손상 기전을 밝히기 위하여 형태학적 관찰에 의한 연구가 많이 행해졌으며 그것은 주로 전자현미경적 관찰에 의한 연구가 주종을 이루고 있었다. 소음자극 후 형태학적으로 미세 변화가 예상되는 연구에서 간과 해서는 안될 점은 첫째, 와우 세포의 손상이 아주 부분적으로 일어나므로 광학현미경적 관찰 후 광학현미경상 손상이 있는 부위를 절단해야 미세변화를 잘 관찰할 수 있는 경우가 많으며 둘째, 자극을 주지않은 대조군과의 비교에서는 같은 주파수대의 와우세포와 비교 관찰에 주안점을 두어야 하며 셋째, 전자현미경적 관찰에 있어서 조직 처리 중 발생할 수 있는 손상을 최대한 줄임으로써 인공음영(artifact)를 최소화 하여야 한다.
   Spoedlin¹⁾에 의하면 150 dB 단기간 음 자극을 계속하여 1분간 자극시켰을 때 와우에 다양한 양상으로 변화가 나타난다고 하였으며 그 후 많은 연구에 의해 다양한 형태의 음 자극 및 잠복 시간에 대한 형태학적 관찰이 있었지만 150 dB 이상의 단일 폭발음에 의한 와우세포의 변화를 관찰한 연구는 자극음 재생의 한계성으로 인해 거의 없었다.
   저자들은 178 dB의 단일 폭발 음을 기니아 픽에 자극한 다음 조직 처리 중 생길 수 있는 인공음영을 최소화할 수 있고 와우의 전장을 잘 관찰하여 비교적 정확히 대조군과 같은 주파수 부위를 절단하여 관찰할 수 있으며 종래의 표층표본(surface preparation)에 비해 기저부의 와우세포를 잘 보전할 수 있는 resin 포매 와우의 microslicing 기법²⁾을 이용하여 투시전자현미경으로 와우의 형태학적 변화를 관찰하였다.

재료 및 방법

재  료
   Preyer 반응이 정상인 유색 기니아픽(300~400 g) 20마리를 대상으로 하였으며 각각 5마리씩 4군으로 나누어 실험하였다. 1군은 음 자극을 주지 않은 대조군, 2군은 음 자극 후 24시간 후, 3군은 1주일 후, 4군은 2주일 후 각각 관찰하였다.

방  법

폭발음 자극
   실험군 15마리를 깊게 마취시킨 후 단일 폭발 음에 노출시키기 위해 open shock tube에 고정하였다. 마취된 동물은 shock tube안 금속 선반에 두고 정면에서 들어오는 shock에 외이도가 수직이 되도록 하였다. 단일 폭발음은 0.3 g pen-taerythrittetranitrate(PETN) 플라스틱 폭파제가 부착된 전기 폭음덮개로 구성된 전하의 폭발에 의해 생성되었고 개체와 전하 사이의 거리는 1.5 m였다. 충격파의 최고 압력은 178±2 dB(평균표준편차)를 보였다(piezoelectric pressure transducer로 각각 다른 개체의 두부 근처에서 측정하였슴). 상승시간은 대략 5 μs이며 양성기의 기간은 2.5 ms였다. Spectrum 분석에서 최대에너지는 저주파에서 생성되었고 20 kHz까지 octave당 약 4 dB정도씩 감소하였다.

고  정
   유색 기니아 픽에 sodium pentobarbiton 과용량을 주고 단두하여 측두골의 골포를 제거한 뒤 와우를 노출시키고 노출된 와우는 정원창과 첨단(apex)의 구멍을 통해 2 mM CaCl₂가 포함된 2.5% glutaraldehyde로 관류시킨 후 그것이 고정되도록 2시간동안 담가두고 세정한 뒤 1시간동안 tetraoxide로 고정시키고 다시 세정하였다.

포매, microslicing 및 전자현미경관찰
   와우를 입체 현미경 하 70% ethanol하에서 해부하였다. 외부골편은 매우 얇게 절단하여 70, 80, 90, 100% ethanol에서(각 농도마다 30분 동안) 탈수시키고 마지막 단계 100% ethanol에서는 30분 동안 분자 체(molecular sieve)위에서 건조하였다. 건조후 resin 침착은 다음과 같이 이루어졌다. 처음 4일간은 1：1 resin/ethanol mix에, 다음 7일간은 3：1 resin/ethanol mix에 마지막으로 9일 동안은 순수 resin에 침착시켰다. 검체는 실온 10^­3 mbar 진공 상태에서 가스가 제거된 순수 resin에 침착시켜 와우를 resin이 침착된 조직학적 틀로 변형시켰다(Agar G3513). 포매된 와우는 대략 125 rpm 회전속도를 가진 Microslice 2(Ma-vern instrument)(Fig. 1) 이용하여 120 m 두께의 원형 다이아몬드 날을 사용하여 modiolus 중간을 세로방향으로 자르고 절반의 와우 coil사이를 직각으로 잘라 hemicoil이 포함된 8~9조각으로 분리하였다. 각각 분리된 조각을 No-marsky DIC 광학현미경으로 관찰하여 손상이 있는 부위와 없는 부위를 구분하여 각각 초박절편 하였다. 각각의 군에서 무작위로 하나의 와우를 선택하여 Cytocochleogram을 작성하였고 대조군 역시 실험 군에서 초박절편한 같은 주파수대의 부위를 초박절편하였다. 투시 전자현미경으로 관찰하기 위하여 2% ethanolic uranyl acetate와 2% lead citrate에 염색하였고 JEOL 100 CX electron microscope(100 kV)으로 관찰하였다. 모든 관찰은 대조군과 같은 주파수대의 부위와 면밀히 형태학적으로 대조하여 관찰하였다.

결     과

광학 현미경상 유모세포의 손상이 없는 부위(Table 1)
   측정한 와우 길이의 평균은 18.24 mm였으며(표준편차：0.68 mm) 모든 실험군의 첨부에서 약 6 mm 부위까지 그리고 12 mm이하 부위에서는 광학 현미경상 유모세포 손상은 거의 존재하지 않았다(Fig. 2). 내유모세포와 외유모세포 모두에서 부동섬모는 정상으로 유지되었고(Fig. 3) 외유모세포에서 1열 2열 3열 모두에서 약간의 기포형성이 발견되었다(Fig. 4). 자극 후 7일부터 약간의 subsurface cistern의 증식이 보였다(Fig. 5).

광학 현미경상 유모세포의 손상이 있는 부위(Table 2)
   실험군의 유모세포의 손상은 주로 첨부로부터 약 6 mm 부위에서 약 12 mm 부위까지 관찰되었다(Fig. 2). 내유모세포의 부동섬모는 정상으로 유지되었으며 외유모세포의 부동섬모는 자극 후 1일군에서 굴절이 관찰되었고(Fig. 6) 그것은 일 주일과 2주일 사이에 더 이상 관찰되지 않았다. 기포화는 내유모세포 외유모세포의 1열 2열 3열 모두에서 나타났으며 특히 자극 후 일주일군에서 가장 많이 나타났다(Fig. 7). 내유모세포의 미토콘드리아는 2주군에서 많은 증식을 보였다(Fig. 8). 외유모세포의 subsurface cistern과 Hensen's body의 증식은 시간에 따라 점점 증식함을 보여 자극 후 2주군에서 가장 많은 증식을 보였다(Fig. 9). 일부자극 후 1일군에서 미토콘드리아의 부종이 외유모세포에서 관찰되기도 하였다(Fig. 10).

고     찰

   음 자극의 강도 및 시간에 따라 소음자극에 대한 와우세포의 변화는 다양하지만 현재까지 temporary threshold shift(TTS)와 permanent threshold shift(PTS)을 발생시킬 수 있는 역치에 대해서는 아직 정확히 알려져 있지 않으며 와우의 형태학적 변화와 기능적 변화를 일으키는 소음자극 역치 또한 서로 다른 동물간의 민감도(susceptibility)의 차이로 인해 그 결과가 상이하게 나타날 수 있고 그 한계를 최소화하기 위해 Nordmann 등³⁾은 생체고정(survival fixation) 방법으로 문제를 최소화할 수 있었다고 하였다. 그리고 지금까지의 연구는 소음 자극에 있어서는 소음 재생의 한계로 인해 주로 100~130 dB 정도의 음 자극을 30분 이상 자극하여 PTS 혹은 TTS의 결과를 얻었으며 150 dB 이상 단일자극에 의한 형태학적 변화를 증명한 연구는 그리 많지 않았다. 지금까지 알려진 TTS와 관련된 형태학적 변화는 주로 부동섬모의 변화와 내유모세포 신경말단의 부종 등이 발견되었으나 부동섬모는 조직 획득 및 처리과정에서 매우 손상에 약한 부위이므로 그 결과의 신뢰성에 대해 현재까지도 많은 논란이 되고 있다. 와우에 손상을 입힐 수 있는 소음 자극은 고 음압의 순간적 자극과 저음압의 만성적 자극으로 구분할 수 있으며 음의 강도, 노출시간, 음 자극의 형태 등에 의해 와우 손상의 정도와 양상이 다양하게 나타날 수 있으며,⁴⁾⁵⁾ 일반적으로 순간적 형태의 음 자극은 자극시간이 1.5 ms 이하인 crack과 1.5 ms 이상인 폭발로 나누어진다. Theopold 등⁶⁾은 158 dB의 총소리 자극으로 유모세포 구조의 변화를 보고하였으며 저음역에서는 180 dB에서도 어떤 변화가 관찰되지는 않았다고 하였다. 저자들의 연구에 사용된 178 dB의 단일 폭발음은 분석 결과 대부분 저 음역에서 최대 에너지를 보였으며 1000 Hz 이상에서는 고 음역으로 갈수록 에너지가 감소하였다.
   여러 연구를 종합하여 볼 때 저자들의 연구는 기니아 픽에서 형태학적으로 최소 변화(minimal change)가 예상되었으며 이런 경우 인공음영을 어떻게 하면 최소화하느냐 라는 문제가 오래 전부터 연구되어 왔고 그것은 최근까지 투시전자현미경기법의 기초적이고 근본적인 기술적 연구방법의 문제로 제기되고 있다. 와우 연구에서 인공음영을 초래할 수 있는 요소는 조직을 실험대상으로 분리하는 과정과 그 분리된 조직을 투시전자현미경 관찰을 위해 조직 처리하는 과정, 그 후 포매하여 절단하는 과정에서 생길 수 있다. 기니아 픽으로 실험을 할 때 골포 속에 있는 막성 미로를 골성 미로로부터 분리하는 과정에서 주로 기저부 회전부의 막성 미로에 손상이 많이 가해질 수 있으며 이것을 방지하기 위해 골성 미로를 분리하지 않은 채로 조직 처리를 하였으나, 남아있는 골 절편으로 초래될 수 있는 초박절편 과정의 기술적 어려움이 있어 이를 극복하기 위해 그 동안 많은 노력과 연구가 진행되어 왔다.
   1966년 Spoedlin과 Brun 등⁷⁾은 절단하지 않은 와우를 수지(resin)에 포매하여 치과용 천공기(drill)에 원형의 톱을 부착하여 와우를 분리하고 각 절편으로 분리시켰으며 Michael 등⁸⁾은 측두골을 환상의(annular) 형태를 가진 칼로 포매하지 않은 상태에서 절단하였으나 역학적 안정성이 떨어져 조직 손상이 많은 단점이 있었다. Jiang 등²⁾은 처음으로 위의 두 방법을 결합하여 수지에 포매된 와우를 환상의 날이 달린 그리고 정밀하게 현미경 하에 절단할 수 있는 microslicing 기계를 이용하여 Corti기관을 관찰하였으며 종래의 표층표본과 microslicing 기법을 비교하였는데 microslicing은 120 mm의 간격으로 체계적인 유모세포의 소실을 관찰할 수 있지만 표층표본 기법은 유모세포의 소실이 예상이 어렵고 불규칙하게 나타나며 소음성 난청의 주 병변부로 생각되는 기저부의 회전은 항상 손상이 심하게 나타나므로 소음노출에 의한 모델로서의 연구방법에는 적합치 않다고 하였다. 본 연구에서 기술적으로 가장 문제가 되었던 것은 포매 과정에서 수지의 침투현상과 조직절편의 까다로운 절단 과정이었다. 저자들은 이런 문제들을 해결하기 위해 진공실(vacuumed chamber)내에서 포매 과정을 시행하였고 그리고 관찰을 위한 조직절단은 다른 투시전자현미경적기법에서 보다 조직절편에서 골 절편을 분리하는 과정 중에 절편의 파손을 막기 위해 세심한 주의를 기울였다.
   음 자극 후 생길 수 있는 와우의 손상기전은 여러 가지를 생각할 수 있으며 물리적 손상과 음 자극 후 초래되는 보상성 대사로 인해 생기는 손상을 생각할 수 있겠다.⁹⁾ 물리적 손상은 고 음압 단시간의 음 자극으로 자극 후 빠른 시간 내에 변화를 초래하게 되며 그 후 기계적인 변화의 정도에 따라 이차적으로 변화를 초래하는데 이것은 Reissner's membrane과 기저막의 천공을 야기하고 와우 내 액체가 혼합되며 혈관계의 변화로 인한 허혈성 손상,¹⁰⁾ 지지세포의 변화,¹¹⁾ 대사성 변화 등이 생길 수 있다. 음 자극 후 즉시 나타날 수 있는 부동섬모의 변화는 거의 음 자극의 물리학적 힘이 내이에서 전달되는 과정에서 손상을 주기 때문에 나타나는 것으로서 그것은 구조적으로 길고 얇으며, 경직되어 있는 특징을 갖고 있으므로 어떤 물리학적 힘에서도 쉽게 손상받을 수 있게 되어 있는 것이다. 부동섬모의 손상의 형태는 몇 가지가 보고되어 있으며 부동섬모의 융합,¹²⁾ disarray,¹³⁾ 장력감소, 굴절 등이 있다.
   저 음압의 연속적인 음으로 자극한 경우는 대사에 의한 보상현상이 뚜렷하게 나타날 수 있으며 세포내의 핵의 부종, 세포막의 변화, 미토콘드리아의 부종 혹은 증식, 리소솜의 증식 등의 소견이 나타날 수 있고 감각세포가 퇴화하여 지지세포로 변하는 경우도 있는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ Spoedlin¹⁾은 90 dB 이하에서는 일반적으로 와우의 변화가 나타나지 않으며 90 dB에서 130 dB 사이에서는 와우의 손상기전이 대사성 보상에 의한 손상이 주로 작용하고 130 dB 이상에서는 주로 물리적 힘에 의한 손상기전이 작용한다고 하였다. 그리고 소음 손상 후 대부분 수일 내에 유모세포의 부종 lysozyme의 증식, 내형질세망(endoplasmic reticulum)의 기포화, Hensen's body의 증가되는 것으로 알려져 있다.^15)16)17)18) 
   본 연구에서 주로 Hensen's body, subsurface cistern 등 세망내피계(RES) 증식이 주된 소견들로 나타났고 이런 현상은 세포의 손상 후에 일어날 수 있는 보상작용으로 사료되며 저자들이 사용한 음 자극은 다른 연구들과 달리 상대적으로 고 음압이었지만 단일 자극이었으므로 세포손상이 미세하게 나타난 것으로 생각된다.

결     론

   저자들은 178 dB단일 폭발음으로 자극한 기니아 픽에서 조직의 손상을 최소화하여 투시전자현미경 관찰 시 인공음영을 줄일 수 있고 성공적으로 광학현미경으로 기저부부터 첨부까지 순차적으로 유모세포를 관찰할 수 있는 microsli-cing resin 기법을 이용하여 투시전자현미경적 관찰을 시행하였다. 그 결과 광학현미경상 유모세포 손상이 발견된 부위에서는 외유모세포 부동섬모의 굴절, subsurface cistern 및 Hensen's body의 증식 등이 관찰되었으며 내유모세포의 미토콘드리아가 증식된 것을 관찰할 수 있었다. 광학현미경상 유모세포의 손상이 없는 부위에서도 유모세포의 미세한 변화를 관찰할 수 있었다. 이런 결과들로 보아 저자들이 사용한 음 자극은 유모세포에서 미세한 세포손상과 그 후에 일어날 수 있는 보상현상을 초래한 것으로 생각된다.

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