교신저자：박성국, 614-735 부산광역시 진구 개금동 633-165번지  인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후과학교실
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서     론

   산화질소(NO)는 혈관의 이완, 신경전달, 혈소판 응집억제, 염증반응 및 종양세포나 기생생물에 대한 숙주면역계의 방어기능 등 여러 생리적 기능을 나타내고 고농도로 존재할 때는 세포독성을 나타내어 숙주에 손상을 줄 수 있으며 산화질소 합성효소(Nitric oxide synthase, NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다.¹⁾ 산화질소는 반감기가 짧아 그 양을 측정하기 위해서는 산화질소 합성효소나 산화효소의 대사산물이 연구대상으로 사용되어 왔다.²⁾
   산화질소합성효소는 크게 이미 세포내에 존재하여 외부로부터의 자극과 Ca^2＋과 calmodulin의 존재하에 활성을 갖는 구성형 NOS(constitutive NOS, cNOS)와 자극에 의하여 세포내에서 새로이 합성되어 발현되고 Ca^2＋과 calmodulin에는 영향을 받지 않는 유도형 NOS(inducible NOS, iNOS)로 구분할 수 있다.³⁾ cNOS는 소량의 산화질소를 생산하며 스테로이드에 의해 발현이 억제되지 않으며 발견되는 세포와 특성에 따라 신경성 NOS(neuronal NOS, nNOS, type I NOS)와 내피세포 NOS(endothelial NOS, eNOS, type III NOS)로 구성된다. iNOS는 면역학적인 자극 즉 리포다당질이나 사이토카인의 자극이 있을 때만 발현되며 스테로이드에 의해 발현이 억제되고 발현이 되면 활성도가 매우 높아 다량의 산화질소를 생산할 수 있으며 mNOS(macrophage NOS, type II NOS)라고도 불리운다.²⁾
   비용의 발생기전으로는 여러 가지 병인론이 있으며 최근에는 비용과 산화질소와의 연관성에 대한 보고가 있다.¹⁾²⁾⁴⁾ 비용의 내과적인 치료인 약물요법은 스테로이드 제제의 약물을 비강내 분무하거나 전신투여의 방법이 이용된다. 국소 및 전신투여한 스테로이드는 비폐색 증상을 감소시키며, 비용의 크기를 감소시킬 뿐 아니라 수술후 재발을 방지하며 손상된 상처의 회복과정에서 혈관재생을 억제하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾
   기존의 연구에서는 iNOS가 알레르기 비염에서 국소 스테로이드에 의해 감소된 다는 사실이 알려져 있다.⁶⁾ 이에 저자들은 비용의 수술전에 사용되는 스테로이드가 비용에서 iNOS, eNOS, 그리고 nNOS 각각의 산화질소 합성 동위효소들에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고 단기간 사용되는 경구 스테로이드와 장기간 사용되는 국소 스테로이드에 차이가 있는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 비알레르기 증상이 없고 multiple allergen stimulation test(MAST Immunosystems Inc., CA, USA) 상 음성, 천식 및 피부알레르기의 과거력이 없는 환자 30명을 대상으로 하였다(남자 14명, 여자 16명, 평균연령 31.7세). 대상환자 30명 모두에게 수술전 7일간 경구 항생제를 투여하여 부비동염의 급성염증반응을 최소화하였고 수술전 스테로이드를 사용하지 않은 10예(남자 4명, 여자 6명)를 제 1 군, 수술전 경구 스테로이드제인 prednisolone을 하루 30 mg씩 1주간 투여한 10예(남자 5명, 여자 5명)를 제 2 군, 수술전 국소 스테로이드인 Fluticasone(Flixonase^®)을 하루 100 μg씩 최소 1달간 사용한 10예(남자 5명, 여자 5명)를 제 3 군으로 나누었다. 내시경하 수술시 한쪽 비용의 앞쪽 중간부분을 채취하였다.

방  법
   수술로 얻은 비용 조직은 4% 중성 포르말린에 하루동안 고정하고 일반적인 방법에 따라 파라핀 블록을 제조하였다. 비점막 조직은 파라핀 블록에서 4 μm두께의 절편을 박절하여 silane(Sigma Chemical Co., SL, USA)이 처리된 유리 슬라이드에 부착시켰으며 비점막 조직이 부착된 슬라이드는 60°C에서 1시간, 100% xylene에서 10분간 2회 탈 파라핀 과정을 거친 후 슬라이드는 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 계열 알코올로 함수과정을 거친 후 증류수로 세척하였다. 내인성 peroxidase를 억제하기 위하여 메탄올과 30% 과산화수소수가 9：1의 비율로 섞인 용액에 10분간 처리하여 tris buffered saline(TBS, pH 7.4)로 3회 수세하였다. 슬라이드는 항원성 회복을 위하여 1% zinc sulfate(Sigma Chemical Co., MO, USA)가 포함된 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에 넣고 전자오븐을 이용하여 5분간 3번 가열하였다. 슬라이드는 항체에 대한 비 특이적 반응을 억제하기 위하여 0.5% 염소혈청 혹은 0.5% 토끼혈청(Dako, CA, USA)을 함유한 TBS 용액에 30분간 실온에서 처리하였다. 슬라이드로부터 혈청을 제거한 후 일차항체를 첨가하여 4°C에서 하루동안 반응시켰다. 본 연구에 사용한 일차항체로는 항NOS 단클론항체(Transduction Laboratories, Kenturky, USA)로 iNOS와 nNOS는 1：250, eNOS는 1：100으로 희석하여 사용하였다.
   일차항체의 처리가 끝난 슬라이드는 1% Tween 20(Bio-Rad, CA, USA)이 포함된 TBS로 10분간 3차례 수세하였으며 일차항체로 처리된 슬라이드는 이차항체로 biotinylated goat anti-mouse IgG(Dako, CA, USA)를 이용하여 실온에서 30분간 반응시켰다. TBS로 3차례 수세한 후 슬라이드는 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated streptavidin(Dako)과 실온에서 30분간 결합시킨 후 TBS로 3차례 수세하였다.
   발색은 0.05% 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC, Sigma Chemical Co.)/0.01% H₂O₂가 함유된 TBS로 실온에서 10분간 반응시켰으며 음성대조는 일차항체 대신 TBS를 사용하여 위와 동일한 과정에 의해 염색하였다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin을 이용하였으며 염색결과의 분석은 두 명의 병리의사가 독립적으로 광학 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 비용은 상피세포, 염증세포, 혈관내피세포로 각각 분류하여 판독하였고, 각 세포에서 발현되는 정도는 전혀 발현되지 않는 경우를 0점(group A), 전체세포중 5% 미만으로 발현되는 경우를 1점(group B), 5~30%의 세포에서 발현되는 경우를 2점(group C), 30~50%의 세포에서 발현되는 경우를 3점(group D), 50%이상의 세포에서 발현되는 경우를 4점(group E)으로 표기 분류하였다.
   통계학적 분석은 SAS release 6.12(SAS Institute Inc., NC, USA) 통계 패키지를 이용하여 Kruskal-Wallis test with multiple comparison(Duncan method)을 실시하였으며 통계학적인 유의성은 p값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

결     과

   면역조직화학검사상 비용조직에서 iNOS는 상피세포에서, eNOS는 혈관내피세포에서, nNOS는 상피세포, 혈관내피세포 및 염증세포에서 대부분 발현되었으며, 스테로이드를 사용하지 않은 비용조직이 경구용 및 국소 스테로이드를 사용한 비용조직보다 iNOS, eNOS, nNOS 모두 유의하게 높은 발현을 보였다(Table 1, Figs. 1, 2, and 3)(p<0.05). 경구 스테로이드가 국소용 스테로이드보다 iNOS와 nNOS는 높게, eNOS는 낮게 발현되었으나 통계적 의의는 없었다(p>0.05).

고     찰

   비 산화질소의 역할은 세균, 진균, 바이러스를 포함한 다양한 병원균의 성장에 영향을 미치며, 백혈구에 의해 생성된 산화질소는 일정한 미생물의 사멸에 중요하고 정상상태에서 부비동의 살균을 유지하는데 도움을 주고 substance P, epinephrine 같은 다양한 섬모 자극물을 생기게 하여 섬모운동을 자극하며 국소적 숙주 방어에 공헌한다.⁷⁾ 비용에서 산화질소합성효소의 활성이 비점막보다 높아 비용의 형성에 산화질소가 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며⁴⁾ 지금까지 밝혀진 비용형성과 산화질소의 잠재적 연관성은 혈관확장을 포함하여, 호산구와 중성구의 기능을 직접 조절하고 히스타민으로 유도된 혈장삼출을 가능하게 하는 것이다.⁴⁾
   nNOS에서 유래된 산화질소는 비아드레날린성과 비콜린성 신경의 접합부에서 중요한 신경전달물질로 알려져 있고⁸⁾ 인간 비점막에서 많은 신경 섬유에 존재하므로 내인성 산화질소의 주원천으로 생각되며, 비점막에서 혈류와 선분비의 중요한 조절매개물로 생각된다.⁹⁾ eNOS에 의해 생성된 산화질소의 양은 상대적으로 적으며, 염증반응에 의해 발현이 증가되지 않아 정상적인 항상성의 조절에 관여한다고 생각되며¹⁰⁾ eNOS의 전사는 긴장, 운동, 저산소증에 의해 증가되기도 한다.¹¹⁾ 본 연구에서는 nNOS와 eNOS가 비용조직에서 국소 및 전신 스테로이드에 의해 억제되어, 스테로이드가 비용에 치료효과를 나타내는 데에 영향을 미칠 것으로 사료된다. iNOS에 의해 생성된 산화질소는 cNOS보다 100~1500배 많은 산화질소를 합성하고 오랜 기간동안 작용하며 염증의 병인론에 관여하며³⁾ 본 연구에서도 기존의 연구¹²⁾ 와 같이 비용조직에서 스테로이드 투여시 발현이 감소함을 확인할 수 있었으며 국소 및 전신스테로이드 간에는 차이가 없었다.
   스테로이드의 국소적 투여는 비염증상의 완화, 비호흡의 개선, 비용의 크기를 감소시키고 재발율을 감소시키나 후각과 부비동의 병변에 대한 효과는 거의 없다. 스테로이드의 전신적 투여에 대한 연구는 적으나 증상과 후각을 포함하는 병변에 효과가 있다고 알려져 있으며 부작용 때문에 단기간 사용해야 된다는 단점이 있다.¹³⁾ 상피세포가 국소 스테로이드의 첫 작용세포이고 상피세포 내에 스테로이드 수용체의 발현이 강하게 나타나며 스테로이드가 상피세포의 염증매개물질 합성을 억제하기 때문에 상피세포가 국소 스테로이드의 중요한 작용부위라고 할 수 있다. 또한 혈관내피세포는 지질매개물을 분비하고 접착분자의 발현을 조절하여 혈장 삼출의 조절에 중요한 기능을 하는데 스테로이드가 이러한 기능을 억제하기 때문에 염증세포와 함께 스테로이드의 중요한 작용세포라 할 수 있다.¹⁴⁾
   Corticosteroid는 염증세포 또는 내피세포 벽으로부터 매개체에 저해요소로 작용하여 모세혈관후 단계에서 미세혈관 누출을 방해하여 다양한 전구염증 염색체의 전사를 방해하여 상피세포에 영향을 미친다. 또한 스테로이드는 비용에서 상피세포증식과 분화를 방해함으로써 결체조직 재건에 영향을 주어 비용에서 특징적인 부종과 지나친 상피성장을 방해한다.¹⁵⁾ Shin 등¹⁶⁾은 수술전 프레드니솔론을 사용한 비용에서 CD4＋ 세포가 감소하여 비용의 치료에 사용되는 경구용 스테로이드는 CD4＋ 세포를 감소시킴으로써 치료효과를 보인다고 하였으며 Park 등⁵⁾은 토끼의 상악동 점막에 기계적 손상만으로 비용의 발생을 유도한 후 스테로이드를 국소 투여한 결과 시간이 경과할수록 비용의 크기가 감소하여 비용 변연부에서 신생혈관의 발달을 억제한다고 하였다. 또한 변연부의 신생혈관의 억제가 미세강 형성과 융합을 억제하고 비용의 변연부에서의 분리를 방해하여 완전한 비용형성을 억제하는 것으로 생각된다고 하였다. 스테로이드는 세포막을 통과해 세포질 내에 있는 수용체와 결합함으로써 활성화되고 이러한 결합체가 핵 내로 들어가 염증과 관계된 유전자와 결합하여 유전자의 발현을 조절하고 염증과 관계된 유전자 발현을 유도하는 activator protein-1(AP-1)전사인자나 nuclear factor-kappa B(NF-κB)전사인자와 결합하여 AP-1과 NF-κB의 작용을 억제한다.¹²⁾ NF-κB는 iNOS유전자 발현의 가장 중요한 전사인자이며¹⁷⁾ 스테로이드는 이러한 NF-κB의 작용을 억제함으로써 iNOS 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ Lee 등¹⁸⁾은 알레르기 기니픽의 비점막에서 증가된 iNOS의 발현은 스테로이드의 비강내 투여가 iNOS의 발현을 억제한다고 하였으며 Kharitonov 등⁶⁾은 국소 스테로이드로 치료한 알레르기 비염환자가 치료받지 않은 알레르기 환자, 심지어는 정상인보다 낮은 비 산화질소양을 보여 국소 스테로이드가 비점막의 상피에서 iNOS의 발현을 억제하여 비 산화질소 양을 감소시킨다고 하였다. Baraldi 등¹⁹⁾은 알레르기성 비염환자의 산화질소가 스테로이드에 의해 억제되는 반면 정상인의 산화질소는 억제되지 않는 점을 들어 산화질소가 알레르기 비염환자에서는 iNOS에서, 정상인에서는 cNOS에서 기원한다고 하였다. Watkins 등⁴⁾은 스테로이드의 비강내 분무 또는 전신투여를 한 환자의 비용상피세포에서 iNOS mRNA의 단백질발현이 발견되어, corticosteroid의 사용에도 불구하고 비용에서는 iNOS 활성이 있어 iNOS 발현을 조정하는 조절경로가 다른 세포 체계와 다른 것이라 제안하였다.
   본 연구에서는 스테로이드를 사용하지 않은 환자의 비용조직과 경구 또는 국소 스테로이드를 사용한 환자의 비용조직 모두 산화질소합성효소들이 발현되었으나 스테로이드를 사용하지 않은 환자의 비용조직이 국소 및 경구용 스테로이드를 사용한 비용조직보다 iNOS, eNOS, 그리고 nNOS 모두 유의하게 높은 발현을 보였다. 또한 경구 스테로이드가 국소 스테로이드보다 iNOS와 nNOS는 높게, eNOS는 낮게 발현되었으나 통계적 의의는 없었다.

결     론

   스테로이드는 비용에서 세가지 산화질소 합성 동위효소 모두를 억제시켜, 비용에 대한 스테로이드의 치료효과중 하나로 고려될 수 있을 것으로 생각된다. 비용에서 발현된 산화질소합성효소의 억제효과에는 단기간 사용한 경구 스테로이드와 장기간 사용한 국소 스테로이드간의 차이가 없었다.

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