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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 45(5); 2002 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2002;45(5): 462-466.
Inhibition of Allergic Response by CpG Motif Immunostimulatory Oligodeoxynucleotide in a Murine Model of Allergic Rhinitis.
Ja Bock Yun, Jeong Whun Kim
1Department of Otorhinolaryngology, Inje University, Sanggye Paik Hospital, Seoul, Korea.
2Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea.
알레르기 비염 마우스 모델에서 CpG Motif Oligodeoxynucleotide 투여를 통한 알레르기 반응의 억제
윤자복1 · 김정훈2 · 이철희2
인제대학교 의과대학 상계백병원 이비인후과학교실1;서울대학교 의과대학 이비인후과학교실2;
주제어: <i>Dermatophagoides farinae</i>알레르기 비염동물모델CpG motif면역강화 sequence.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The classic immunotherapy has the inconvenience and the risk of anaphylaxis. Recent reports revealed that immunostimulatory DNA sequences (CpG motif, ISS-ODN) have been shown to act as strong Th1 response-inducing adjuvants and DNA based vaccination might be an effective therapeutic option for the treatment of allergic disease. In our study, we investigated whether ISS-ODN have anti-allergic effect in the mouse rhinitis model of Dermatophagoides farinae (Der f), the most common allergen in Korea.
MATERIALS AND METHOD:
C57BL/6 mice were sensitized with crude extract of Der f extract. After injection of ISS-ODN, several parameters of allergic response were evaluated.
RESULTS:
Injection with ISS-ODN suppressed itching symptom, eosinophilic infiltration into nasal mucosa and the splenic T cell proliferation after Der f allergen challenge in the murine model of allergic rhinitis. However, injection with ISS-ODN did not show a detectable Der f-specific IgE suppression.
CONCLUSION:
Our findings suggested ISS-ODN have an anti-allergic effect in the allergic rhinitis model of Der f allergen. House dust mite allergy can be reduced by the injection with ISS-ODN.
Keywords: Dermatophagoides farinaeAllergic rhinitisMurine modelCpG motifImmunostimulatory sequence

교신저자:이철희, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화:(02) 760-3646 · 전송:(02) 745-2387 · E-mail:chulhee@snu.ac.kr

서     론


   현대사회에서 문명의 발달과 더불어 알레르기 질환이 날로 증가하고 있는 반면에 치료법의 개발은 별 진전을 보지 못하고 있다. 약물요법은 알레르기 비염의 기본적인 치료이지만 약제 중단 시에는 증상이 재발하는 경우가 흔하고 때에 따라 심각한 부작용을 초래할 수도 있다. 그러므로 안전하고 효과적인 근본 치료 방법이 필요하다. 금세기부터 알레르기 질환 치료의 한 형태로서 면역 주사 치료가 도입되었는데, 최근에는 과민 반응과 비용문제로 면역 주사의 사용이 점점 줄어들고 있다.
   알레르기성 질환에 대해 좀 더 효과적이고 안전한 형태의 면역치료 방법을 연구하는 과정에서 알레르기 항원을 plasmid DNA(pDNA)에 결합시켜서 세포에 uptake시키면, 이들 세포들이 항원을 생산하고 이렇게 생긴 pDNA 결합 항원은 T helper cell type I(Th1) 반응을 강화한다는 사실이 발견되었다. 그런데 알레르기성 질환은 주로 알레르기 항원에 의해 유발되는 T helper cell type 2(Th2) 반응의 강화로 생기는 것이므로, Th1 반응을 강화하여 Th2 반응을 억제하는 이러한 방법은 새로운 형태의 알레르기 질환의 치료방법으로서 각광받게 되었다. 최근에는 Th2 반응을 억제하는 면역 강화 DNA sequence인 CpG motifs가 포함된 oligodeoxynucleotide(ISS-ODN)를 항원과 함께 주입하는 방법이 새로운 형태의 면역 치료로서 각광을 받고 있다.
   기존 알레르기 질환의 동물 모델은 대부분 천식 모델이므로 ISS-ODN 투여를 통한 알레르기 반응 억제 효과가 알레르기 비염 모델에서도 효과가 있는지는 아직 검증되지 않았다. 그리고 기존 연구에서는 항원으로 난알부민을 사용하였는데 이는 실제 환자에게서 볼 수 있는 항원이 아니다. 실제 환자에서 비염을 일으키며 우리나라에서 제일 흔한 항원인 집먼지진드기 항원을 이용한 연구는 아직 없다. 이와 같은 이유로 본 연구에서는 실제 환자에서 비염을 일으키는 우리나라에서 흔한 항원인 집먼지진드기 항원을 마우스에 감작시켜 제작한 알레르기 비염 모델을 대상으로, ISS-ODN 주사에 의한 알레르기 반응의 변화를 관찰함으로써 보다 효과적인 알레르기 반응 억제 방법을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

Oligonucleotide의 제작

  
CpG DNA motif가 포함된 ISS-ODN(immunostimu-latory sequences of unmethylated CpG-containing oligodeoxynucleotide)을 제조하였다(5'-GCTAGACGTTAGCGT-3').1)2) 대조 ODN(M-ODN)은 C와 G의 순서를 바꾸는 방법으로 CpG motif를 제거하여 만들었다(5'-GCTAGAGCTTAGGCT-3'). 이들 ODN은 내독소가 거의 없고(<1 ng/mg DNA), 한번 투여시에 50 μg/100 μl씩 동물에 투여하였다.

실험동물과 항원
  
실험동물로는 체중 20~30 g의 특이 질병이 없는 C57BL/6 수컷 마우스를 사용했다. 항원으로는 집먼지 진드기인 Dermatophagoides farinae(Der f)의 lyophilized crude body extract를 이용하였으며, 항원은 4°C에서 냉장 보관하고 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹여 사용했다.

알레르기 비염 모델의 제작
   C57BL/6 마우스를 다음과 같이 대조군과 실험군으로 나누어 이전에 본 연구자가 발표한 방법에 따라 알레르기 항원을 투여하여 감작시켰다.3) 대조군으로는 Der f 항원에 감작을 시키지 않은 음성대조군, 감작을 시킨 양성대조군으로 나누었고, Der f 항원으로 전신 감작을 시킨 후에 ISS-ODN을 투여한 실험군은 wild형의 CpG가 포함된 ODN을 준 군(wild군)과 mutant형의 ODN을 투여한 군(mutant군)으로 각각 나누었다.
   실험군과 양성대조군의 마우스에는 Der f 100 μl(1 μg/μl)와 Complete Freunds Adjuvant(CFA, PIERCE Chemical Co., Rockford, IL) 100 μl를 섞은 혼합액 200 μl를 마우스 꼬리 부근에 피하주사하여 항원에 전신감작 시켰다. 또한 실험시작 24시간 후와 72시간 후에 pertussis toxin 300 ng을 복강내 주사했다. 실험시작 7일 후에 동량의 Der f 항원과 Incomplete Freunds Adjuvant(IFA, PIERCE Chemical Co., Rockford, IL) 혼합액 200 μl을 피하주사하였다.
   위와 같이 전신감작을 시킨 후 6주일간 1주일마다 한번씩 micropipette을 이용하여 20 μg의 Der f를 20 μl의 PBS에 녹인 용액을 마우스의 양측비강에 10 μl씩 비내 점적하여 비내 국소감작을 유도했다. 음성 대조군의 마우스에게는 항원이 섞이지 않은 CFA를 주사하고 이후 1주일마다 6주간 동량의 PBS 만을 비내 점적했다.
   실험군에서는 Der f를 비내 점적하기 24시간전에 ISS-ODN 혹은 M-ODN을 50 μg/100 μl씩 피하주사했다(Fig. 1).

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
  
마지막 비강내 점적 1주일 후 모든 실험동물에 20 μg의 Der f 용액 20 μl를 micropipette을 이용하여 비내 점적하여 15분간 나타나는 코비빔 동작과 재채기 증상의 숫자를 기록하여 각 실험그룹의 결과를 서로 비교했다.

비점막 조직 소견의 비교
  
항원 주입 후 24시간 후에 마우스를 희생시켜 비중격 점막을 채취하고 Hematoxyline-Eosin 염색을 시행하여 200배 광학 현미경(Laborlux K, Leica, Wetzlar, Germany) 하에서 관찰하여 조직내 호산구 침윤정도를 측정하였다(단위;개/200배 시야).

Der f-특이 IgE 항체 농도 측정
  
각 실험군의 마우스에서 비중격 점막 채취 시에 심장천자를 통하여 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청을 얻어서, Der f-특이 IgE 항체 농도를 ELISA 방법을 사용하여 측정했다.

T 림프구 증식 검사
  
실험동물에서 비장을 채취하여 여과지를 이용하여 single cell suspension으로 만들었다. 피콜을 넣고 원심분리하여 주사기로 림프구층만 분리하였다. Serum free media에 담긴 1×10 5개의 비장세포가 들어있는 96-well plate에서 Der f-특이 T 림프구를 배양했다. 한 샘플당 Der f 항원을 첨가한 well과 항원이 없는 well을 각각 3개씩 만들었다. 60시간 동안 배양한 뒤에 1 μCi tritiated methyl thymine를 넣고 12시간 동안 배양했다. Methyl thymine incorperation을 liquid scintillation counting으로 측정하였는데, thymidine uptake 양을 항원이 있을 때와 없을 때로 나눠 측정하여 stimulation index를 구하였다.

통계분석
  
통계분석은 ANOVA로 시행하고 p값이 0.05이하인 경우를 통계적으로 의의 있게 보았다.

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
  
알레르기 양성 대조군에서는 알레르겐 투여 후 15분간 측정한 코를 비비는 횟수와 재채기 횟수의 합인 증상점수가 평균 35.2±15.3회이었고, 실험군에서는 wild형의 ISS-ODN을 투여한 마우스는 평균 10.0±4.1회로 통계적으로 유의하게 억제되었다(p<0.05, Fig. 2).

비점막내 호산구의 침윤 정도의 비교
  
항원 투여후 24시간 후에 채취한 마우스의 비점막내에서 200배 광학현미경으로 관찰되는 호산구의 수는 양성대조군의 경우 한시야당 평균 32.5±2.1개가 관찰되었고, 실험군의 wild 군은 17.5±6.4개가 관찰되어 양성대조군 보다 유의하게 감소되었다(p<0.05, Fig. 3).

혈청 Der f-특이 IgE 항체 농도 비교
  
양성대조군에서는 641±525 EU의 Der f-특이 IgE가 검출되었고 실험군에서는 wild군에서 960±603 EU으로서 양성대조군과 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p>0.05, Fig. 4).

T 림프구 증식검사
  
Stimulation index를 비교해보면 양성대조군에서는 6.22±5.05이었고, 실험군의 wild 군에서 0.11±0.47로 양성대조군에 비해 통계적으로 유의하게 T 림프구의 증식이 억제되었다(p<0.05, Fig. 5).

고     찰

   현재 알레르기 비염 치료에서 새롭게 연구되고 있는 분야가 DNA 유전자 백신요법이다. 최근 유전자 백신을 통하여 Th2 면역반응이 억제되고, Th1 면역반응이 증가한다는 보고가 나왔다.4) 즉 유전자가 결합된 plasmid를 쥐에 근육주사하면 Th1 면역반응에서 나타나는 IFN-gamma가 증가하고, Th2 면역반응에서 나타나는 IL-4 등의 물질이 감소한다. 알레르기 질환은 강화된 Th2 반응의 결과이므로5) Th1 반응을 강화시키고 Th2 반응을 억제하는 이런 물질은 알레르기 비염 치료에 응용할 수 있다.
   이런 유전자 백신에 의한 면역반응의 억제의 상당부분이 vector로 사용되는 plasmid DNA(pDNA)에 포함되어 있는 면역증강 DNA 서열(immunostimulatory DNA sequence, ISS-ODN)에 의한다는 것이 최근 밝혀졌다. ISS-ODN은 mycobacterial DNA에 포함된 DNA 서열로서 NK 세포와 인터페론 생산을 촉진시켜 항암효과를 나타냄이 알려져 항암치료의 한 방법으로 연구되어 왔다.6) ISS-ODN에는 unmethylated CpG dinucleotide(CpG motifs)가 포함되어 있는데, 미생물에서는 흔히 발견되는 이 DNA서열은 사람 같은 고등생물체의 DNA에서는 매우 드물게 존재하며, 사람에선 대부분 메칠화(methylation)가 되어있다.
   Plasmid DNA 내에 있는 ISS가 Th1 반응을 강화시켜 알레르기 반응인 Th2 반응을 억제하는 기전은 다음과 같이 추정되고 있다. DNA인 ISS가 항원표시세포(antigen presenting cell, APC) 내로 transfection되면 APC가 Th1 유발 cytokine인 IFN-gamma 등을 분비하여 Th0 세포가 Th1 세포로 변환되게 한다.7) 그리고 동시에 ISS가 MHC와 costimulatory ligand를 up-regulation시켜 T세포 활성화를 유발시킨다.
   이와 같이 Th2 반응의 억제가 주로 plasmid DNA(pDNA)에 포함되어 있는 ISS-ODN에 의해 발생하므로 ISS-ODN을 이용한 DNA 면역치료가 임상에 이용될 잠재력이 크고 실제로 세계적으로 ISS-ODN를 이용한 DNA 면역치료법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
  
Raz 등4)은 ISS-ODN을 동물모델에 투여하여 쇼크반응과 천식 그리고 결막염 등의 각종 알레르기 질환을 나타내는 각종 지표가 효과적으로 억제된다고 보고하였다. 집먼지 진드기 항원의 하나인 D. farinae(Der f)를 사용한 본 실험에서도 알레르기 증상 억제와 비강 점막의 호산구 침윤이 억제됨을 관찰할 수 있었다. 본 실험에서 이용한 동물모델은 이미 알레르기 항원에 전신 감작이 된 상태에서 ISS-ODN을 투여함으로써 알레르기 반응이 억제될 수 있음을 나타낸 것이므로, 알레르기 질병 치료제로써의 가능성을 보여준 것에 그 의의가 있다. 이런 실험 결과는 난알부민을 항원으로 사용한 마우스 천식 모델 실험에서 ISS-ODN이 IL-5, 호산구의 기도침윤과 기도 과민성을 효과적으로 억제했다는 연구와 유사한 결과이다.8) 그러나 이런 종류의 연구는 우리나라에서는 상대적으로 드문 항원에 대한 것이다. 우리나라 알레르기 비염환자의 대부분에서는 집먼지 진드기 항원이 원인항원으로 밝혀져 있다.
   최근 연구에서보면 ISS-ODN만을 투여한 실험군에서보다 항원을 같이 섞어서 투여한 실험군에서 항원 특이 IgE 항체를 억제하는 것으로 나타났다는 보고가 있다. 예를 들면 ISS-ODN와 ragweed의 주항원인 Amb a 1의 공유결합물(conjugate)은 ISS-ODN을 투여하는 방법보다 효과적으로 Th2 반응을 억제하였다.9) ISS-ODN과 난알부민에서도 유사한 결과를 나타냈다. 이는 ISS-ODN과 항원이 같은 항원표시세포에 도달하는 확률이 보다 높기 때문인 것으로 추정된다. 즉, ISS-ODN은 항원표시세포의 기능을 강화시키는 강력한 자극을 주기 때문에 항원과 ISS-ODN이 같은 세포에 도달하는 것이 면역반응을 유발하는데 효과적이기 때문으로 추정된다. 그러므로 집먼지 진드기에 의해 유발된 알레르기 비염 환자에서 ISS-ODN을 이용한 DNA 면역치료가 보다 효과적으로 알레르기 반응을 억제하려면 집먼지 진드기 항원과 ISS-ODN을 동시에 투여하거나 항원과 ISS-ODN의 공유결합물을 투여하여 그 효과를 평가해보는 연구가 필요할 것이라고 사료된다.
   본 연구는 흔한 알레르기 원인 항원인 집먼지진드기에 감작된 알레르기 동물모델에서 ISS-ODN을 이용한 알레르기 반응 억제를 유발함으로써 알레르기 DNA 백신 개발의 기초 자료를 얻고자 시행하였다. 결과적으로 ISS-ODN은 효과적으로 Th2반응을 억제함으로써 알레르기 질환의 치료제로써 면역주사요법을 대체할 가능성을 보인 것으로 사료되었다. 그러나 ISS-ODN을 면역치료제로써 사용하려면 Th2 반응을 억제하는 효과가 비교적 단기간 억제를 나타낸다는 점8)과 더불어 투여 후에 나타날 수도 있는 독성에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

결     론

   본 연구를 통해 Der f 항원으로 감작시킨 마우스에 Der f를 비내 투여 전에 ISS-ODN을 피하주사함으로써 집먼지 진드기 알레르기 비염 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 알게 되었다.


REFERENCES

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  2. Klinman DM, Yi AK, Beaucage SL, Conover J, Krieg AM. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:2879-83.

  3. Yun JB, Lee CH, Kwon TY, Park SW. House dust mite allergic rhinitis model in C57BL/6 mice. Korean J Otolaryngol 2000;43:276-81.

  4. Raz E, Tighe H, Sato Y, Corr M, Dudler JA, Roman M, et al. Preferential induction of a Th1 immune response and inhibition of specific IgE antibody formation by plasmid DNA immunization. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:5141-5.

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  6. Tokunaga T, Yamamoto H, Shimada S, Abe H, Fukuda T, Fujisawa Y, et al. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity. J Natl Cancer Inst 1984;72:955-62.

  7. Casares S, Inaba K, Brumeanu TD, Steinman RM, Bona CA. Antigen presentation by dendritic cells after immunization with DNA encoding a major histocompatibility complex class II-restricted viral epitope. J Exp Med 1997;186:1481-6.

  8. Broide DH, Stachnick G, Castaneda D, Nayar J, Miller M, Cho JY, et al. Systemic administration of immunostimulatory DNA sequences mediates reversible inhibition of Th2 responses in a mouse model of asthma. J Clin Immunol 2001;21:175-82.

  9. Tighe H, Takabayashi K, Schwartz D, Van Nest G, Tuck S, Eiden JJ, et al. Conjugation of immunostimulatory DNA to the short ragweed allergen amb a 1 enhances its immunogenicity and reduces its allergenicity. J Allergy Clin Immunol 2000;106:124-34.

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