교신저자：이국행, 139-706 서울 노원구 공릉동 215-4 원자력병원 이비인후-두경부외과
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서     론

   후두암은 두경부 영역에서 발생하는 악성종양 중 갑상선 암을 제외하면 가장 흔한 원발성 악성종양으로, 전체 악성종양의 2~5%를 차지하는 것으로 알려져 있으나, 한국인에서는 1.5~1.6%의 발생률을 보인다. 흡연은 공해와 음주 등과 더불어 후두암의 중요한 환경적 위험인자로 알려져 있다.¹⁾ 비흡연자에 비해 흡연자에서의 후두암 발생률은 4~24배 높은 것으로 보고되고 있으며, 위험률은 흡연량에 비례해서 높아진다고 알려져 있으나, 어떤 기전을 통하여 흡연이 후두암 발생에 기여하는지는 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 담배 연기와 공해물질에는 polycyclic aromatic hydrocarbon 등의 발암물질이 포함되어 있으며, 이들의 대사에 cytochrome P450 1A1(CYP1A1) 등의 제 1 상 효소(phase I enzyme)와 glutathione S-transferase(GST) 등의 제 2 상 효소(phase II enzyme)가 작용한다. 이러한 효소의 다형성은 발암물질의 대사에 영향을 미치게 되므로, 후두암 발생에도 영향을 미칠 것으로 추측된다.
   Aryl hydrocarbon hydroxylase(AHH) 유도성이 높으면 AHH를 효과적으로 활성화시켜 각종 발암물질을 활성화한다.²⁾ 폐에서의 CYP1A1 발현정도는 AHH 유도성과 일치하는데, 이 CYP1A1 유전자의 7번 exon의 특정 adenine이 guanine으로 돌연변이가 일어나게 되면 CYP1A1의 heme-binding region 근처에 있는 462번 아미노산이 isoleucine에서 valine으로 바뀌면서 높은 AHH 활성도를 나타내게 된다.²⁾ CYP1A1의 발현이 증가된 사람에서는 PAH 등의 발암물질이 인체 내에서 생활성화(bioactivation)되어 독성이 증가되므로 암 발생 위험도가 높아지는 것으로 보고되었다. 일부 국외 연구는 CYP1A1 다형성과 후두암 발생 사이에 유의한 관련성이 있음을 보고하였다.²⁾
   Glutathione S-transferase phi(GSTP1) 유전자형은 표피세포에 광범위하게 존재하며 이들 조직 내에서 해독작용에 관여함으로써 암 발생에 영향을 미칠 것으로 생각된다. 최근 GSTP1 유전자의 313번 염기가 A에서 G로 치환된 유전자 다형성이 존재함이 밝혀졌는데,³⁾ 흡연과 관련된 암종 중 일부는 이 GSTP1 유전자 다형성과 유의한 관련이 있다고 보고되고 있다.⁴⁾ 그러나 한국인을 대상으로 CYP1A1과 GSTP1 두 가지 유전자 다형성과 그 상호작용이 후두암 발생 위험도에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 이루어진 바 없는 실정이다. 본 연구는 후두암 환자와 대조군을 대상으로 흡연습관과 CYP1A1과 GSTP1 다형성이 한국인의 후두암 발생에 미치는 영향을 규명하기 위하여 시행되었다.

대상 및 방법

대  상
   1999년부터 2000년까지 이비인후-두경부외과를 방문하여 병리조직학적으로 후두암으로 진단받은 환자 84명과 암이 아닌 다른 질환으로 방문한 대조군 168명을 대상으로 하였다. 환자군 1명당 성별이 동일하며, 나이 차이가 세살 이내의 사람을 두 명씩 짝지어 대조군으로 하였다.

설문 조사
   대상자에게 설문 조사를 통해 흡연에 관련된 자료를 수집하였다. 흡연력은 흡연 여부와 누적 흡연량을 조사하였으며, 누적 흡연량은 pack-year로 환산하였다.

유전자형 분석
   혈액에서 DNA를 추출하여 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 방법으로 CYP1A1과 GSTP1의 유전자 다형성을 분석하였다.

CYP1A1
   CYP1A1 유전자형은 HincII restriction fragment length polymorphism(RFLP)으로 확인하였다. PCR primer는 HincII 제한 부위를 생성하는 두 가지 primer, 즉 5'-GAA CTG CCA CTT CAG CTG TC-3'와 5'-GAA AGA CCT CCC AGC GGT CA-3'를 사용하였다. PCR은 genomic DNA 100 ng, dNTP 혼합체 800 μM, MgCl 2 1.5 mM, KCl 40 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, Taq polymerase 2.0 unit를 섞어 총 용량이 25 μl로 하였다. 온도 조건은 denaturation 94°C 1분 30초, annealing 53°C 1분 30초, extension 74°C 30초로 Thermocycler(Perkin Elmer Cetus, UK)에서 35회 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색 후 187 bp의 band를 확인하였다. 이렇게 나온 PCR 산물 10 μl에 HincII 10 unit를 섞어 총 용량이 20 μl가 되게 하여 37°C에서 6시간 이상 반응시켰다. 다음날 반응산물 15 μl를 12% PAGE gel서 전기 영동시켜 ethidium bromide로 염색 후 최종 유전자형을 확인하였다. 제한 부위가 없는 139 bp의 band만을 보이는 것을 Ile/Ile 유전자형, 120 bp가 보이는 것은 Val/Val 유전자형, 그리고 139 bp와 120 bp의 band가 함께 보이는 것을 Ile/Val 유전자형으로 하였다(Fig. 1).

GSTP1
   PCR과 Alw26I 제한 효소를 이용한 RFLP법을 사용하여 GSTP1 유전자형을 판정하였다. PCR용 primer는 GSTP1을 위한 5'-GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG-3'과 5'-AGC CAC CTG AGG GGT AAG-3'를 이용하였다.⁴⁾ PCR은 genomic DNA 100 ng, dNTP 혼합체 800 μM, MgCl2 1.5 mM, Taq polymerase 2.0 unit를 섞어 총 용량이 25 μl로 하였다. 온도 조건은 denaturation 95°C 15초, anealing 57°C 30초, extension 74°C 1분으로 Thermocycler(Perkin Elmer Cetus, UK)에서 35주기 동안 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 Alw26I 제한효소로 37°C에서 6시간 이상 반응시킨 후 2% agarose gel에서 전기 영동시켜 431 bp band만 보이는 경우를 A/A type, 431, 313 bp band가 보이는 경우를 A/G type, 313 bp band가 보이는 경우를 G/G type으로 판정하였다(Fig. 2).

통계 분석
   전제 환자군과 대조군에 대하여 흡연력과 두 가지 유전자형의 분포가 환자군과 대조군 사이에 유의한 차이가 있는지를 단변수 분석으로 검정하였고, 흡연자만을 대상으로 CYP1A1과 GSTP1 유전자 다형성의 후두암에 대한 영향을 검정하였다. 또 PC-SAS for the Windows의 ‘ROC PHREG’를 이용하여 누적 흡연량과 두 가지 유전자 다형성을 포함하는 다변량 분석을 전체 대상자와 흡연자에 대하여 따로따로 시행하였다.

결     과

전체 대상자에 대한 분석
   환자군과 대조군의 평균 연령은 각각 61.7세와 61.8세로 유의한 차이가 없었다. 환자군이 대조군에 비해 유의하게 흡연을 많이 한 것으로 나타났다. 흡연량을 pack-year로 환산하였을 때, 환자군의 누적 흡연량이 대조군에 비하여 유의하게 많았다(Table 1).
   환자군에서 CYP1A1 유전자형은 Ile/Ile형이 69.2%, Ile/Val형이 25.6%, Val/Val형이 5.1%였고, 대조군에서는 Ile/Ile형이 38.2%, Ile/Val형이 46.1%, Val/Val형이 15.8%로 환자군에서 Ile/Ile 유전자형이 유의하게 많은 양상을 보였다(Table 2).
   환자군에서 GSTP1 유전자형은 A/A형이 64.6%, A/G형이 34.2%, G/G형이 1.3%였고, 대조군에서 GSTP1 유전자형은 A/A형이 70.4%, A/G형이 28.3%, G/G형이 1.3%로 두 군간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Table 3, p>0.05).
   누적 흡연량과 CYP1A1과 GSTP1의 유전자 다형성의 세 가지 변수를 독립 변수로 하는 conditional logistic analysis에서 누적 흡연량은 통계적으로 유의한 변수인 반면에 CYP1A1과 GSTP1 유전자 다형성은 어느 것도 유의하지 않은 것으로 나타났다(Table 4).

흡연자에 대한 분석
   환자군은 모두 흡연자였으며, 대조군에서는 119명(70.8%)이 흡연자였다. 흡연자의 성별 분포는 Table 5와 같다.
   흡연자의 CYP1A1 유전자형 분포는 환자군과 대조군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 대조군 중 흡연자의 성별-연령별 분포가 전체 대조군과 달리 환자군과 차이가 있으므로, 성과 연령을 보정한 CYP1A1 유전자의 Ile/Ile 유전자형의 대응비(odds ratio；OR)를 구하였는데, 그 값은 2.01이었고, 95% 신뢰구간은(1.03, 3.90)로서 통계적으로 유의하였다.
   담배를 피우는 환자군과 대조군의 GSTP1 유전자형 분포에서 A/A형이 환자군에서 적은 듯하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며, 성과 연령을 보정한 대응비와 그 95% 신뢰구간은 0.61(0.27, 1.37)로서 역시 유의하지 않았다(Table 5).
   연령과 성, 그리고 두 가지 다형성을 동시에 포함시킨 conditional logistic model에서 CYP1A1과 GSTP1 유전자 다형성은 어느 것도 통계적 유의성을 나타내지 않았다(Table 3).

고     찰

   한국인의 후두암 발생률은 연간 250~400명 정도로 인구 100,000명당 1.2명 정도에 해당하며, 남녀비는 약 10：1, 호발 연령은 60대로 알려져 있다. 후두암 환자의 90% 이상이 흡연력을 갖고 있으며, 흡연은 여러 역학적 연구를 통하여 후두암의 위험요인으로 확인되었으나, 어떤 기전을 통하여 후두암을 유발하는지에 대해서는 아직까지 구체적으로 알려져 있지 않다. 본 연구에서도 흡연은 강력한 후두암 유발인자로 나타났다. 후두암 환자군의 100%가 흡연을 한 것으로 확인되었기 때문에 대응비를 산출할 수 없었으나, chi-square 값이 26.4로 p-value는 0.001에도 미치지 못하였다. 누적 흡연량도 환자군과 대조군 사이에 뚜렷한 차이를 보였을 뿐 아니라, 다변량 분석에서도 CYP1A1과 GSTP1 유전자 다형성은 유의하지 않았으나 누적 흡연량만 유의하였으며, 1 pack-year 증가함에 따라 후두암 위험도가 1.04배 증가하는 것으로 나타났다.
   인체에 발생하는 대부분의 암은 흡연과 같이 외부로부터 폭로되는 환경적 인자와 다양한 개개인의 유전적 인자 사이의 상호 작용에 의해 발생한다. 이론적으로는 외부의 발암 물질에 노출되었을 때, 개개인의 감수성의 차이에 따라 암 발생이 결정되는 것으로 생각되며, 개인의 감수성의 차이는 발암 물질의 활성화와 관련된 대사에서 유전적으로 결정되어지는 효소 기능의 차이에 기인하는 것으로 알려져 왔다. CYP1A1 유전자 산물은 aryl hydrocarbon hydroxylase(AHH)로서 담배 연기에 함유된 PAH를 활성화하여 전자 친화성 물질을 만들며, 그 결과 후두암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 전체 환자군과 대조군을 대상으로 한 경우에 CYP1A1의 Ile/Ile 유전자형을 가진 사람이 Ile/Val이나 Val/Val 유전자형을 가진 사람에 비하여 2.34배 후두암에 더 잘 걸리는 것으로 나타났으며, 이는 통계적으로 유의한 것이다. 그러나 전체 대상자와 흡연자를 대상으로 다변량 분석을 시행한 결과는 그 대응비가 각각 1.79와 1.73으로 추정되었으며, 통계적 유의성을 상실하였다. 최근의 역학적 연구들 중 대부분이 CYP1A1 유전자 다형성의 통계적 유의성을 확인하지 못하였다. 한편 몇몇 두경부 암에 대한 분자역학적 연구에서 CYP1A1 유전자형과 후두암 위험도 사이의 관련성을 보고한 바 있는데, 후두암의 위험도가 높은 유전자형은 본 연구와 마찬가지로 Ile/Ile 유전자형이었다. CYP1A1 유전자의 7번 exon의 특정 adenine이 guanine으로 돌연변이가 일어나게 되면 CYP1A1의 heme-binding region근처에 있는 462번 아미노산이 isoleucine에서 valine으로 바뀌면서 높은 AHH 활성도와 변이원성을 나타내게 된다. 따라서 Ile/Ile 유전자형의 AHH 활성도는 Ile/Val이나 Val/Val에 비하여 낮으며, PAH 등의 발암 물질을 활성화시키는 정도도 약한 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 본 연구와 몇몇 다른 연구에서 Ile/Ile 유전자형이 환자군에서 높게 나타난 것은 이러한 대사 기전으로는 설명될 수 없는 것이다. 더구나 누적 흡연량을 포함하는 다변량 분석에서 그 유의성이 상실된 것은 CYP1A1에 의하여 활성화된 담배 연기 중 발암 물질의 대사 산물이 후두암을 유발한다는 가설과 대립되는 결과이다. 그러므로 본 연구결과 유의한 위험 인자로 나타난 CYP1A1 Ile/Ile 유전자형이 독립적인 위험 인자라기 보다는 흡연 습관과 통계적인 관련성이 있기 때문에 유의하게 나타난 것으로 판단된다.
   GSTP1은 두경부 암을 포함한 여러 종류의 암 조직에서 그 발현이 증가되는 것으로 보고되었으며, 각종 암의 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.⁵⁾ GSTM1이나 GSTT1 등 GSTP1 동종 효소의 다형성이 후두암을 포함한 두경부 암의 위험 요소로 알려지면서,⁶⁾⁷⁾⁸⁾ GSTP1의 유전자 다형성도 후두암의 위험요소 여부인지를 검정하기 위한 연구가 이루어지게 되었다.
   Finland 연구의 대조군들의 GSTP1 유전자형의 분포가 A/A, A/G, G/G형이 각각 50.0%, 37.2%, 12.8%인데 비하여,⁹⁾¹⁰⁾ 본 연구의 대조군에서의 분포는 A/A, A/G, G/G형이 각각 70.4%, 28.3%, 1.3%로서 A 대립유전자는 한국인에게 흔하지만, G 대립유전자는 서구인에 비하여 드문 것을 확인할 수 있었다. Matthias 등¹¹⁾¹²⁾의 독일인에 대한 연구에서 구강 및 인두암과 후두암 환자군에서 대조군에 비하여 A/A 유전자형이 유의하게 적었으며, 그 대응비를 0.47로 보고하였다. 그러나 Finland의 연구에서는 GSTP1 유전자 다형성이 후두암 위험도에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며,⁹⁾¹⁰⁾ 본 연구에서도 GSTP1 유전자 다형성은 통계적으로 유의하지 않았다. 또한 본 연구에서 흡연자만을 대상으로 한 통계 분석이나 다변량 분석에서도 GSTP1은 유의하지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합해 보면, 후두암 발생에 대하여 GSTP1의 유전자 다형성과 흡연의 상호작용 정도는 크지 않은 것으로 판단되며, GSTP1의 유전자 다형성이 후두암 발생에는 중요한 역할을 하지 않는 것으로 보이지만, 이에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   흡연과 GSTP1과 CYP1A1의 유전자 다형성 가운데 흡연은 가장 강력한 후두암 유발 요인이라고 할 수 있으나, GSTP1 유전자형은 후두암 발생에 중요한 위험 요인은 아닌 것으로 판단된다. CYP1A1은 독립적인 후두암의 위험 요인이라기 보다는 흡연 습관과 관련되어 있어서 단변수 분석에서 유의하였던 것으로 보인다.

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