교신저자：여승근, 139-231 서울 노원구 하계1동 280-1 을지대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   식이제한은 노화에 따른 내분비계의 변화, 뼈조직의 손실, 생식기능의 퇴화, 골근육의 약화, 중추신경계의 변화와 면역기능의 감소를 지연시킬 뿐 아니라 평균수명을 연장시키는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾³⁾ 중추신경계에 대한 연구로는 절식 후에 전두피질에서 serotonin transporter감소, 시상하부에서 neuropeptide Y receptor감소, 시상하부에서 neuropeptide Y mRNA증가와 proopiomelanocortin mRNA감소, 간뇌에서 산화질소 합성효소의 활성감소 등이 보고되고 있다. 하지만 후구에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 쥐에서 후각전달 과정 중 후각수용체로의 냄새물질의 유입은 먼저 냄새분자가 막수용체(7-transmembrane receptor)단백질과 결합하여야 한다. 막수용체단백질은 cAMP를 생산하기 위해 adenyl cyclase를 활성화 시키거나, phosphitidal inositol을 생산하기 위한 phospholipase C를 활성화하기 위해 G 단백질과 결합하여야 한다. 이런 전달과정으로 칼슘과 나트륨의 유입을 위한 통로가 열려 이온이 막을 탈분극시키고 세포내 칼슘의 농도를 조절함으로써 냄새자극이 중추신경으로 전달되어진다.⁴⁾ 이런 후각신경계로의 전달과정에 필요한 칼슘의 농도를 조절할 뿐만 아니라 신경조절에 관여하는 물질로는 칼슘유착단백질이 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾ 이에 절식이라는 환경에서 후각의 전달과정에 필요한 칼슘이온을 조절하는 칼슘유착단백질에 미치는 영향을 후구에서 보고자 면역염색을 시행하여 그 변화를 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물
   10주된 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 사용하였다. 실험동물에게 정제사료를 급식하였는데, 조성은 casein 20%, corn oil 15%, cellulose 10%, sucrose 5%, starch 45%, DL-methionine 0.3%, choline-Cl₂ 0.2%, AIN-76 mineral mix 3.5%, AIN-76 vitamin mix 1.0%로 구성되었다. 자유급여 때 1마리가 24 g의 정제사료를 섭취하므로 실험군 30마리는 12 g으로 줄여 식이제한을 시킨 후 6마리씩 나누어 식이제한 3일군, 1주군, 2주군, 4주군 및 9주군으로 나누어 배정하였다.

조직처리
   실험동물에게 pentobarbital sodium(60 mg/kg)을 복강주사하여 마취시킨 후 좌심실을 통하여 0.05 M 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 1분간 주입하고, 0.1 M 인산염완충액(phosphate buffer)에 녹인 4% buffered paraformaldehyde용액(4°C)을 10분간 관류시켰다. 이때 관류속도는 50~60 ml/min이 되도록 하였다. 관류고정 후 후구를 적출하여 40 μm로 관상절개하여 동일한 고정액에 담가서 4%에서 16~18시간 고정하였으며 그후 0.1 M PBS에 탄 20% sucrose용액에서 2~5일간 보관하였다. 냉동절편기(Leica, Germany)를 이용하여 40 μm 두께의 연속횡단절편을 제작하여 면역염색을 시행하였다.
   1차 항체로는 parvalbumin, calbindin, calretinin(Transduction Laboratories, Lexington, USA)를 사용하였다. 1차 항체용액에서의 반응이 끝나면 조직을 PBS로 10분씩 3번 세척한 후, Vectastainelite kit의 biotylated horse anti-mouse IgG(Vector, Burlingame, USA)를 1：200으로 희석한 2차 항체용액에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
   2차항체용액과 반응 후에 PBS로 10분씩 3차례 세척한 avidin-biotin-peroxidase complex용액에서 1시간동안 실온에서 반응시켰다.
   발색제로는 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride를 0.05 M Tris완충액에 0.02%, H₂O는 0.003%로 사용하였다. 발색반응은 상온에서 3~5분간 시켰으며, 반응이 끝난 후 조직은 gelatin-coated slide에 얹어서 2시간동안 실온에서 건조시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. 일부는 면역조직화학 염색한 조직과 각 층을 비교관찰할 목적으로 cresyl violet염색을 시행하였다. 면역염색을 시행한 각 절편을 각 부위별로 parvalbumin, calbindin 및 calretinin의 면역염색성을 영상분석기를 이용하여 광학밀도를 측정하였다. 하지만 승모층과 내망상층은 넓이가 작아 측정에서 제외하였다.

통계분석
   통계처리는 Mann-Whitney’s U-test를 시행하여 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   흰쥐 후구의 조직학적 구조는 광학현미경하에서 후각신경섬유(olfactory nerve fiber)가 들어오는 바깥쪽부터 안쪽으로 후각신경섬유층, 사구체층, 외망상층, 승모세포층, 내망상층, 과립세포층, 상의하세포층으로 구분되었다(Fig. 1).⁶⁾ 후구에서 parvalbumin의 광학밀도는 대조군에 비해 절식 1주째 전층에서, 2주째는 후각신경층을 제외한 층에서 면역염색성이 통계학적으로 의미있게 증가하였고 4주후부터는 대조군과 같은 면역염색성을 나타냈다(Fig. 2, Table 1). Calbindin은 절식 1주째는 전층에서 2주째는 과립세포층을 제외한 층에서 면역염색성이 증가하였다(Fig. 3, Table 2). Calretinin의 경우는 과립세포층과 상의하세포층은 대부분 면역염색성이 낮아 측정이 불가능하였고, 측정이 가능하였던 3층에서만 비교관찰한 결과 절식 1주째 후각신경층과 외망상층에서 의미있게 증가하였고 2주째부터는 대조군과 같은 면역염색성을 나타냈다(Fig. 4, Table 3). 면역염색은 신경원과 신경세포 모두에서 고르게 염색되었다.

고     찰

   현재까지 알려진 주요 3가지 칼슘유착단백질은 parvalbumin, calbindin 그리고 calretinin이 있다. 비록 칼슘유착단백질이 직접적으로 신경전달물질로는 작용하지는 않지만 정상 뇌 기능에 있어 신경세포의 특성을 설명하는데 중요한 물질이고, 신경의 퇴행성 과정에도 관여를 하고 있다.^6)7)8)9) 성인의 신경계에서 칼슘유착단백질은 세포내의 대사에서 칼슘이온의 영향을 매개하거나 조절하여 세포가 흥분하는 동안 칼슘의 지나친 유입을 방지함으로 신경세포를 보호하는 역할을 하게 된다.⁸⁾ 생체외 실험에서 칼슘유착단백질은 세포간 전달자로서 칼슘의 완충 역할을 하며, 칼슘의 과부하로 인한 허혈 상태가 되거나 독성이 자극된 상태로 되는 것을 방지시켜 세포를 방어하게 된다.⁶⁾ 이들은 또한 중추신경계에 균일하지 않게 나타나 신경원 군집을 확인하는 유용한 지표로 이용되고 있는데⁵⁾¹⁰⁾ Munkle의 연구에서 시상부에 3가지 칼슘유착단백질에 대한 면역염색을 시행한 결과 이들이 부위별로 분포가 다르게 나타남을 보고하였다. Parvalbumin은 복측핵군(ventral nuclear group)과 내·외 슬상핵군(medial and lateral geniculate nuclear groups)에는 면역염색이 강하게 내배측핵(mediodorsal nucleus)에는 중등도로 면역염색되었다. 이와는 반대로 calbindin과 calretinin은 문측 수판내핵(rostral intralaminar nuclear group)과 내배측핵에는 강하게 면역 염색되었으나 복측핵군과 내·외 슬상핵군에는 약하게 염색되었다. 이중 calbindin은 calretinin에 비해 기저복내측핵군(basal ventral medial nucleus)에서 calretinin은 caonl：olfactory nerve layer, gl：glomerular layer, opl：outer plexiform layer, gcl：grannule cell layer, sez：subependymal zone onl：olfactory nerve layer, gl：glomerular layer, opl：outer plexiform layer, gcl：grannule cell layer, sez：subependymal zone lbindin에 비해 망상핵(reticular nucleus)에서 염색성이 증가하였다.⁵⁾ 본 연구상에서도 parvalbumin의 면역염색성은 절식 1주째 전층에서, 2주째는 후각신경층을 제외한 층에서 면역염색성이 증가하였고, Calbindin은 절식 1주째는 전층에서 2주째는 과립세포층을 제외한 층에서 면역염색성이 증가하였으며, Calretinin의 경우는 절식 1주째만 후각신경층과 외망상층에서 의미있게 증가하여 칼슘유착단백질이 후구에서 각층마다 다소 불균일한 분포를 보였다. 이런 결과는 또한 절식이라는 외부자극에 후구의 층마다 다소 다른 반응성을 보이고 있음을 시사하였다.
   냄새를 맡는 단계별 과정이 아직 정확히는 밝혀져 있지는 않으나 이론적으로는 여러가지 단계가 필요하다. 후각물질의 후점막상피까지의 도달, 후각 점막 표면의 점액층으로의 흡수, 후각상피섬모에 존재하는 후각수용기와의 결합, 결합에 따른 칼슘채널의 변화, 이에 따른 탈분극, 후구까지의 전달, 중추신경계로의 전달 등의 과정을 거쳐야 한다.¹²⁾ 이중 후구 전까지의 기전에 대해서는 다양한 연구가 되어왔으나 중추신경계에 대한 연구는 국내에서 극히 미비한 상태이며,^12)13)14) 그중 여러 후각말초신경을 모아 하나의 신경을 형성하고 있는 후구의 기능을 활성화시키는 연구는 아직 없는 실정이다. 현재까지 알려진 중추신경계의 노화를 지연시키거나 신경변성을 예방하는 방법으로 식이제한에 대해 관심이 많아지고 있다. 장기적으로 식이량을 요구수준 이하로 감소시키면 최고수명이 연장된다고 알려져 있으며, 또한 식이제한에 따라 노화에 따른 생리기능의 감퇴도 억제되어 칼시토닌, 부갑상선호르몬, 인슐린, 글루카곤, 에피네프린 등 내분비계의 변화, 뼈 조직 손실, 생식기능의 퇴화, 골격근육의 약화, 중추신경계의 변화, 면역기능의 감소 등이 지연이 보고되고 있다.¹⁾²⁾
   본 연구에서 절식을 시행하지 않은 군에 비해 절식을 시행한 군에서 칼슘유착단백질이 1~2주에 많이 증가한 소견을 나타냈다. 이런 현상은 칼슘에 대한 완충역할 증대뿐 아니라 절식이라는 환경에 대한 후구에서 신경세포의 방어기전에 기여하리라 사료되었다.⁶⁾ 2주 이후부터는 대조군과 비슷한 값을 보인 것은 절식 2주 후부터는 절식이라는 환경에 어느 정도 적응이 된 것이 아닌가 생각되었다. 최근 절식이 노인성난청에 미치는 영향에 대한 연구에서 쥐가 사망할 때까지 평균 25개월까지 3개월 간격으로 추적관찰한 결과 대조군에 비해 절식을 시행한 군에서 청각의 민감도가 증가하고 mitochondrial DNA결손이 감소하였으며 외유모세포의 손실도 최소화되었음을 보고하고 있다.¹⁵⁾ 하지만 본 연구의 결과만으로는 후각정보의 분석과 처리과정에 대한 민감도가 증가되는지에 대해서는 알 수 없었다.

결     론

   절식 후 부위별로 칼슘유착단백질의 염색성이 다른 것은 후각구에서 영역별로 칼슘유착단백질에 대한 신경활성이 영향을 받는 정도가 다르다는 것을 알 수 있었으며, 절식 1~2주 후에 염색성이 증가된 것은 칼슘에 대한 완충역할 증대뿐 아니라 절식이라는 환경에 대한 후구에서 신경세포의 방어기전에 기여하리라 사료되었다. 2주 이후부터는 대조군과 비슷한 값을 보인 것은 절식 2주 후부터는 절식이라는 환경에 어느 정도 적응이 된 것이 아닌가 생각되었다. 하지만 본 연구가 단기적인 변화를 본 것인 만큼 절식에 의한 장기적 변화에 대한 관찰이 더 필요하리라 사료되었다.

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