교신저자:홍성화, 135-230 서울 강남구 일원동 50 성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
전화:(02) 3410-3574 · 전송:(02) 3410-3879 · E-mail:shhong@smc.samsung.co.kr
서
론
청성 말초 신경계는 코르티기관 내에 존재하며 소리를 감지하는 유모세포(hair cell)와 유모세포의 흥분에 의해 발생한 전기 신호를 뇌간에 존재하는 청성핵에 전달해주는 청성 일차 뉴론인 나선신경절 신경세포(spiral ganglion neuron)로 이루어져 있으며 유모세포나 나선신경절 신경세포가 손상되어 퇴행되는 경우에 감각신경성 난청을 야기하게 된다. 따라서 청력 손실을 유발할 수 있는 여건에서 유모세포나 나선신경절세포를 보호하여 청력을 보존할 수 있다면 이는 임상적으로 매우 큰 의미가 있다.
신경세포의 생존은 신경성장인자들(neurotrophic factors)과 탈분극(depolarization) 등의 다양한 자극 환경에 의해 조절된다. 신경성장인자는 발육 기간 중 신경세포로의 분화와 생존을 조절하며 소음과 이독성 약물로부터 신경세포를 방어하므로 나선신경절 신경세포의 손실에 의한 난청을 막기 위한 연구의 중요한 물질로 대두되었다.1)2) 포유류의 neurotrophin family에는 nerver-growth factor(NGF), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), neurotrophin-3(NT-3), neurotrophin-4/5(NT-4/5) 등이 있고 각각은 trk family의 일원인 특이 수용체와 결합하여 세포 속으로 정보를 전달하는 기능을 가지고 있다.3) 와우의 개체발생 동안에 BDNF와 NT-3의 mRNA가 발현되고4) 이들에 특이적으로 결합하는 수용체인 trkB와 trkC를 나선신경절에서 관찰하였으며5) BDNF는 제 2 형 뉴런의 생존에 관여하는 반면, NT-3는 제 1 형 뉴런의 생존에 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다.6) 인공와우 이식술 이후 나선신경절 신경세포의 추가 사멸이 정지된다는 사실에서 전기 자극에 의한 나선신경절 신경세포의 탈분극이 신경세포의 생존에 관여한다고 추측하였으며
in vitro에서 고농도의 K+을 이용할 경우 나선신경절 신경세포가 탈분극화되고 이차적으로 L-형의
Ca2+ 채널을 통하여 들어가는 세포내의 Ca2+ 농도를 증가시켜 사멸을 정지 또는 연기시킬 수가 있음을 증명하였다.7)8)
신경세포를 둘러싸고 있는 슈반세포는 NGF, BDNF 등을 생성하며 탈분극에 의해 BDNF의 생성이 증가되기 때문에 신경절을 이용한 분리 배양의 경우 신경세포 뿐 아니라 슈반세포와 섬유아세포 등의 주변 세포들이 같이 배양되는 경우 신경성장인자 또는 탈분극에 의한 신경세포의 생존이 신경세포 자체의 기전에 의한 것인지 슈반세포와의 상호 작용 기전에 의한 것인지를 분간하기 어렵다. 따라서 신경세포의 수가 많은 조직에서는 신경세포만을 순수 분리 배양하여 연구를 진행하고 있다.9)
이에 저자들은 나선신경절 세포를 분리 배양하여 나선신경절 세포의 분화와 생존에 관여하는 신경성장인자(BDNF, NT-3)와 탈분극을 유도하기 위해 K+를 처리하여 나선신경절 신경세포의 성장과 생존에 미치는 영향에 대해 연구하였으며 나선신경절 세포를 분리 배양하여 나선신경절의 신경세포를 다른 주변세포로부터의 순수 분리를 위해 면역자장분리법(immunomagnetic cell sorting)10)11)을 시도하였기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
나선신경절 채취 및 세포 분리
임신한 S/D(Sprague Dawley) 흰쥐로부터 얻은 생후 5~6일된 미성숙 흰쥐를 매 실험마다 10마리씩 실험 재료로 사용하였다. 어린 쥐들을 5~10분 동안 얼음 마취하고 두부를 절단하고 두피를 벗겨낸 후 측두골을 채취하였다. 와우 주변의 연조직을 제거하여 와우를 완전히 노출시키고 와우의 외벽을 이루고 있는 연골 조직과 미성숙 골 조직, 와우의 혈관조(stria vascularis) 및 나선인대(spiral ligament)를 제거하였다. 코르티 기관을 제거하고 와우의 내벽을 이루고 있는 연골 조직과 미성숙 골 조직을 조심스럽게 제거하여 나선신경절 조직을 얻었다. 이렇게 얻은 조직을 HBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution)에 담근 후 혼합 효소 용액(0.1% collagenase, 0.01% DNase I, 0.1% trypsin)을 추가하여
37°C에서 30분간 반응시켜 나선신경절 세포를 일차적으로 효소 분리하였다. 효소 활성을 막기 위해 15% FBS(Fetal Bovine Serum)으로 첨가시킨 후 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:GIBCOBRL, USA)/0.05% BSA(Bovine Serum Albumin) 배양액으로 세척하였다. 마지막으로 neurobasal 배양액(GIBCOBRL, USA)과 첨가물(1×Sato, 0.5×B-27, 1×Insulin)에 잘 혼합하여 가늘게 뽑은 유리 pasteur pipette으로 물리적 힘을 가하여 나선신경절 세포를 이차적으로 분리시켰다(3×105 cells/cochlea). 1×Sato(Bottenstein & Sato 용액)12)은 transferrin(100 μg/ml), crystallin BSA(100 μg/ml), progesterone(60 ng/ml), putrescein(16 μg/ml), sodium selenite(40 ng/ml), thyroxine (40 ng/ml), triiodothyrosine(30 ng/ml)을 포함하며, insulin은 항상 신선하게 사용하였다. 나선신경절 세포의 배양을 위해 코팅한 슬라이드(MARIENFELD, Germany)를 준비하였다. 이 슬라이드는 먼저 poly-L-ornithin(0.1 mg/ ml)으로 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 멸균수로 세 번 씻고 UV에서 완전히 건조시킨 후에 laminin(20 μg/ml)으로
4°C에서 밤새 방치해서 실험 당일 laminin을 HBSS로 세척한 후 사용하였다. 균일한 세포 배양을 위하여 배양액 내의 나선신경절 세포를 골고루 잘 부유시켜 코팅된 배양 슬라이드의 well(60×60 mm)당 3×104 cells을 심어서
37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
면역형광 염색
분리된 나선신경절 세포를 배양 슬라이드에 옮긴 후 배양액에 신경성장인자와 탈분극이 나선신경절 신경세포 생존에 미치는 효과를 알아보기 위하여 대조군은 신경성장인자 또는 25 mM K+
등을 첨가하지 않은 배양액만으로 배양하였고 실험군은 배양액에 BDNF(50 ng/ml), NT-3(50 ng/ml)와 탈분극을 유도하는 25 mM K+을 각각 첨가하였다. 배양액은 이틀에 한 번씩 교환하였으며 세포들은 24시간, 48시간, 72시간, 96시간까지 배양한 후 신경세포에만 특이적으로 결합하는 Monoclonal Anti-NF 200(Neurofilament 200, Sigma, USA)를 이용하여 면역형광염색을 통해 살아있는 나선신경절 신경세포를 관찰하였다. 각 실험군은 4% paraformaldehyde로
4°C에서 30분간 고정시킨 후 세포 침투성을 높이기 위해 0.1% Triton X-100을 10분간 처리하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 정상 소혈청으로 30분간 반응시켰다. 일차 항체로 NF-200를 1:800으로 희석하여
37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS 용액으로 세 차례 씻어주고 이차 항체로 Goat anti-Mouse IgG FITC Conjugate (Zymed, USA)를 1:50으로 희석하여
37°C에서 30분간 반응시켰다. 이것을 차가운 PBS 용액으로 3회 씻어주고 Hoechst(1 μg/ml)로 대조 염색을 한 후 형광 봉입 용액으로 봉입하고 형광현미경으로 관찰하였다.
면역자장분리법(Immunomagnetic cell sorting)에 의한 순수 신경세포 분리
분리된 나선신경절 세포로부터 나선신경절 신경세포만을 순수 분리하기 위해서 면역자장분리법을 시행하였다. 이것은 MiniMACS Magnetic Separating System(Miltenyi Biotec, Canada)을 사용하여 신경세포에 특이 표면 항원인 A2B5에 결합할 수 있는 항체와 결합하는 immunoglobulin isotype에 미세비드(microbead)를 붙이는 간접적인 표지방법을 이용하였다. 앞에서 설명한 방법으로 분리된 나선신경절 세포 중 신생흰쥐 8마리에서 얻은 신경절 세포(4.8×106 cells)는 neurobasal 배양액과 신경세포에 특이한 A2B5 항체와 함께 잘 부유시켜
4°C에서 30분간 약하게 흔들어 주면서 반응시켰다. 신경세포의 특이 표면 항원인 A2B5에 결합할 수 있는 항체인 anti-A2B5는 ATCC의 A2B5 clone 105라는 림프잡종세포종(hybridoma cell line)을 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 충분히 배양하여 그 상층액으로부터 얻었다. 반응 후에 세포가 들어 있는 튜브를 1000 rpm에서 5분간 원심분리를 하고 상층액은 버리고 침전된 세포는 PBS용액(0.1% BSA, 0.05%
NaN3)으로 세 번 씻어 준 후 rat-anti-mouse IgM Microbead(1 mL/5×108 cells)와 함께
4°C에서 30분간 흔들어주면서 반응시켰다. 반응 후 결합이 안된 미세비드를 제거하기 위해 PBS용액으로 씻어 준 후 MACS 완충용액(PBS, 0.1% BSA, 0.05%
NaN3, 5 mM EDTA)으로 잘 부유시키고 이 용액을 자기장이 걸려 있는 MACS 분리 컬럼을 통과시킨 다음 자기장을 통과해서 나온 음성부분(슈반세포나 섬유세포등을 포함)은 제거하고 컬럼은 깨끗한 MACS 완충용액으로 3회 이상 씻어 주었다. 이때 자석을 제거하면 미세비드에 붙어 있던 신경세포들은 탈자기화가 되면서 컬럼에서 떨어지므로 양성부분(나선신경세포만 포함;≥2×105 cells)을 얻을 수 있었다. 나선신경절 세포를 효소와 물리적 방법으로 단일세포로 분리한 후 혼합된 여러 세포들 중에 신경세포의 분포와 면역자장분리법 시행 후의 신경세포의 순수도를 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 이용하여 확인하였다. 즉 분리한 혼합된 세포군과 면역자장분리법 시행 후의 세포군(≥2×105 cells)을 담은 두 튜브를 각각 2개씩 준비하고 한 튜브에는 A2B5 항체를 넣고 다른 튜브는 음성 대조군으로 사용하기 위해 항체 대신 FACS 완충용액(0.5% BSA, 0.1%
NaN3, PBS)를 넣고
4°C에서 30분간 반응시키고 FACS 완충용액으로 씻어준 후 2차 항체로 FITC goat-anti-mouse immunoglobulin(Zymed, USA)을 넣고
4°C에서 30분간 반응시켰다. 이것을 FACS 완충용액으로 세척한 후 2% paraformaldehyde를 넣어
4°C에서 세포를 고정시켜 FACS 기계(FACS vantage)를 이용하여 540 nm에서 데이터를 읽은 다음 CELL Quest software를 이용하여 결과를 분석하였다.
결 과
나선신경절 세포의 생존에 대한 신경성장인자와 탈분극의 효과
나선신경절 세포를 분리 배양하여 신경성장인자와 탈분극이 나선신경절 세포의 생존에 미치는 상대적인 효과를 관찰하였다. 대조군은 neurobasal 배양 용액만으로 배양하였고 실험군은 배양액에 신경성장인자인 BDNF(50 ng/ml), NT-3(50 ng/ml)를 첨가하였고 탈분극화을 유발하기 위해 배양액에 25 mM K+를 첨가하여 배양하였다. 이때 처리한 각각의 농도는 가장 생존 효과가 크다고 알려져 있는 보고들로부터13)14) 결정하여 나선신경절 신경세포의 생존에 미치는 영향을 관찰하기 위해 사용하였다. 이 세포들은 배양을 시작하고 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 후에 각각 고정하고 염색하여 관찰하였다. 배양한 시간에 따라 생존하는 나선신경절 신경세포의 수는 NF-200에 염색되는 세포를 세어서 결정하였으며 대조군과 실험군에서 24시간 배양 후 살아있는 신경세포 수(100±3.1%, N=3)에 있어 거의 차이가 없었으므로 이를 100%로 기준으로 잡아 배양시간별로 퍼센트로 나타내었다(Fig. 1). 배양한 후 72시간이 지나면서 대조군에서는 90% 이상 현저한 신경세포 수의 감소로 생존하는 신경세포는 10±5.1% 밖에 존재하지 않았다. 배양한지 96시간 후에는 BDNF를 처리한 세포군에서는 34±6.1%, NT-3를 처리한 군에서는 30±5.6%, 25 mM K+를 처리한 군에서는 43±9.0%로 30~50% 이상의 여전히 건강한 뉴론들을 관찰할 수 있었다. 즉 신경성장인자와 탈분극화에 의해 분리 배양 후의 생존 연장을 확인하였다(N=3, p<0.05). 배양 후 24시간까지는 신경성장인자와 탈분극화의 유무에 따른 신경세포 수의 변화는 없었지만 신경초(neurite) 길이는 이때부터 조금씩 차이가 나기 시작했다. 즉, 신경초 길이 재생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 BDNF를 처리한 실험군에서는 신경초가 가장 길게 자라고 있었다(신경세포체 직경의 20~30배). NT-3를 처리한 실험군은 대조군보다는 신경초가 2~3배정도 더 길게 자라 있었지만 BDNF에서보다는 길이가 현저히 짧았으며 25 mM K+에서는 대조군과 비교하여 신경초가 거의 자라지 않았거나 비슷한 수준의 신경초 길이를 관찰할 수 있었다. 이 결과로 NT-3와 25 mM K+는 신경세포 생존에는 관여하지만 신경초 길이 성장에는 무관하거나 혹은 신경초 길이의 성장을 억제함을 볼 수 있었다(Fig. 2).
면역자장분리법을 이용한 나선신경절 신경세포 순수 분리
와우로부터 분리된 여러 종류의 나선신경절 세포로부터 나선신경절 신경세포를 순수 분리하기 위해서 면역자장분리법을 시행하였다. 이것은 신경 세포의 특이한 항원-항체 반응을 이용하여 항체에 면역자장 비드를 붙여 항원-항체반응을 더 강하게 하는 방법으로 기존에 시도하였던 immunopanning 방법보다 실험하기가 용이하였으며 분리 시간이 단축되었고 회수율도 상당히 증가하였다. Fig. 3은 면역자장분리법 시행 후에 분리된 세포의 분포를 FACS 실험한 것으로 나선신경절 세포의 순수도에 대한 결과를 보여준다. 즉 면역자장분리를 시행한 후 신경세포의 특이항체인 A2B5와 반응하지 않아 미세비드에 결합되지 않아 컬럼으로부터 처음부터 통과된 나선신경절 세포의 음성부분과 A2B5와 반응하고 미세비드에 결합하여 컬럼에 붙잡혀 있어 나중에 세척에 의해 분리된 나선신경절 세포의 양성부분을 비교해본 결과 이론적인 100%의 순수도에는 못 미치지만 음성부분에서 형광염색된 나선신경절 신경세포가 1.3%이었음에 비해 양성부분에서는 나선신경절 신경세포의 순수도가 50% 증가함을 볼 수 있었다.
고 찰
신경세포의 분화와 성장 등에 관여하고 있는 신경성장인자와 탈분극을 유도하는
K+은 신경세포가 손상을 받았을 때 재생 등에 관여하며 신경독성의 여건에서 신경세포의 생존을 연장시켜주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
앞서 보고된 바에 의하면 나선신경절 신경세포는 특이한 trk 유전자와 단백질을 발현하는 반면 유모세포는 신경성장인자 유전자들을 발현한다고 한다.4)14) 이와 같은 보고들로부터 신경성장인자는 청각 시스템의 발육과 유지에 중요한 역할을 하고 이독성 물질에 의한 신경세포의 손상을 방어할 것이라고 제안되어 왔으며 다수의 연구를 통해 이 제안이 입증되었다.15)16) 이들 신경성장인자의 내이에서의 기능은 다양한 방법으로 연구되고 있다. 가장 최근에는 BDNF나 NT-3를 돌연변이 시키거나 이들 신경성장인자의 수용체를 돌연변이 시킨 마우스를 만들어 분석해 본 결과 NT-3는 제 1 형 청신경세포의 생존에 관여하고 BDNF는 제 2 형 청신경세포의 생존에 관여함을 알 수 있었다.6) 본 연구자들은 기존의 연구를 바탕으로 나선신경절 세포의 생존에 관여하는 요인에 대한 연구를 신생 흰쥐의 와우로부터 나선신경절 세포를 효소적 방법과 물리적 방법으로 분리하여
in vitro에서 신경성장인자와 탈분극에 의한 나선신경절 세포의 성장과 생존에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 나선신경절 세포의 생존 연장에 중요한 역할을 하는 신경성장인자(BDNF, NT-3)와 25 mM
K+를 각각 처리한 후의 나선신경절 신경세포는 아무 것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 퇴행이 억제되어 생존이 연장됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과로는 탈분극에 의한 나선신경절 신경세포의 생존이 BDNF와 NT-3를 단일 처리한 것에 비해 효과가 다소 크게 나타났다. 그리고 BDNF를 처리한 나선신경절 신경세포는 시간이 지날수록 신경초가 길게 뻗어져 잘 자라고 있었다. 즉 BDNF는 나선신경절 신경세포의 생존 뿐 아니라 신경초의 생장에도 영양을 주는 물질임을 알 수 있었다. 이것은 시개(tectum)에 존재하는 시신경세포에서 BDNF의 효과와 일치한 결과이다.17) 그리고 대조군과 비교했을 때 신경초의 생장에 대한 NT-3의 효과는 거의 관찰하지 못하였다. 이 결과는 신생 발육단계에서 BDNF와 NT-3가 와우각의 신경분포의 성장에 관여한다는 보고와도 일치된 결과이다.18) 또한 청신경 제 1 형의 생존과 관련 있는 NT-3와 청신경 제 2 형의 생존과 관련 있는 BDNF를 각각 처리했을 때, 청신경 세포의 90% 이상을 차지하는 제 1 형의 생존과 관련 있는 NT-3를 처리했을 때가 BDNF를 처리했을 때보다 나선신경절 신경세포의 생존에 대한 효과가 더 클 것이라 예상했었는데 실험결과에 있어서는 크게 차이가 없었다. 이것은 각 신경성장인자가 발육 동안에 작용하는 단계가 상이하고 또한 그 수용체들의 발현양상도 각 단계마다 달라지기 때문이다.4)14) 즉 동일한 발육단계에서 발현하는 BDNF와 결합하는 trkB 수용체가 NT-3와 결합하는 trkC 수용체의 발현보다 상대적으로 우세하여 나선신경절 신경세포의 생존을 보다 향상시킨다고 볼 수 있겠다. 그리고 본 연구결과에서 신경영양인자나 탈분극에 의한 효과가 나선신경절 신경세포의 생존을 100% 유지할 수 없는 것으로 미루어 보아 신경세포의 생존에는 한 요소에 의한 단독효과가 아닌 여러 인자들의 상호작용에 의한 복잡하게 이루어진 신경세포의 생존연장 기전이 있을 것이며 이 부분에 대해서는 아직 상당한 연구의 진행을 필요성을 느낀다. 이미 보고된 연구결과로는 신생
Mongolian gerbils의 나선신경절 조직배양에서 BDNF와 NT-3의 복합 처리에 의한 나선신경절 신경세포 생존에서 단독처리 했을 때보다 생존의 상승효과를 보여주었으며 발육의 마지막 단계에서 매우 중요한 역할을 한다고 하였다.19)
나선신경절 세포의 분리 배양하는 경우에는 신경세포 뿐 아니라 주위의 슈반세포도 같이 배양되므로 신경과 슈반세포 간의 상호작용에 의하여 신경세포 자체만의 퇴행 특성을 파악하기 어렵다. 현재까지 국내외적으로 와우내의 나선신경절 신경세포를 순수 분리 배양하여 그 특성과 기능을 연구한 보고는 없다. 본 연구자들은 신생 흰쥐로부터 와우 내의 나선신경절을 채취하여 효소 방법과 물리적 방법을 이용하여 나선신경절 세포를 분리하고 이 세포 중에 순수한 신경세포만을 분리하기 위해 면역자장분리법을 시도하였다. 즉, 신경세포의 특이 표면 항원인 A2B5에 선택적으로 결합하는 면역자장 미세비드를 이용하여 자기장을 통과시킨 후 신경세포만을 순수 분리해서 배양하고자 하였다. 면역자장분리법을 이용하여 신경세포를 분리한 결과 기대했던 것보다 나선신경절 신경세포의 회수율과 순수도가 낮았다. 하지만 예비 실험에서 신경세포의 다른 표면 항원인 Thy1.120)을 이용한 immunopanning 법이나 면역자장법을 이용했을 때의 결과인 10% 미만의 회수율과 순수도와 비교할 때 훨씬 높은 회수율과 순수도를 얻을 수 있었다. 이 결과로 신경세포의 표면 항원으로 A2B5의 항원성이 Thy1.1보다 좋다는 것을 알 수 있었으나 여전히 신경세포의 순수 분리에는 그다지 유효하지 않음을 확인하였다. 그래서 면역자장분리법을 이용해 얻은 신경세포를 사용하여 신경성장인자와 탈분극에 의한 생존실험에는 사용하기에 충분하지 않았다. 이와 같이 순수한 나선신경절 신경세포의 순수분리가 힘든 것은 근본적으로 신생 흰쥐의 한쪽 와우 내에 나선신경절 신경세포가 약 30,000개 밖에 존재하지 않기 때문에 절대적으로 신경세포의 수가 부족한 것도 한 이유로 들 수 있겠다. 보다 좋은 항원성을 가진 표면 항원을 찾아보거나 항원성을 증진시킬 수 있는 방법에 대한 추가적인 연구가 지속되어야 할 것으로 보인다. 그러나, 본 연구를 통해 혼합된 여러 종류의 세포 속에서 특이한 표면항원을 가진 순수한 단일 세포를 분리할 수 있는 면역자장분리법에 대한 실험 기법을 확립할 수 있었다.
본 연구자들은 이 보고를 통해 신생 흰쥐의 와우로부터 채취한 나선신경절 세포로부터
in vitro 상에서 신경성장인자와 탈분극에 의한 효과로 신경세포의 생존이 연장됨을 확인할 수 있었으며 이러한 연구는 와우 내의 유모세포의 손실 후에 나타날 수 있는 나선신경절 신경세포의 퇴행을 억제하여 생명 연장의 기전을 연구하는데 기초가 될 것이라 사료된다. 그리고 면역자장분리법을 이용하여 혼합된 이종의 세포들 속에서 특이 표면항원을 가진 순수한 단일세포를 분리할 수 있는 방법을 시도해 본 것에 의의를 둘 수 있겠다.
결 론
본 연구를 통해 신경세포의 분화와 성장 등에 관여하고 있는 신경성장인자로서 BDNF와 NT-3 그리고 탈분극을 유도하는 25 mM
K+은 나선신경절 신경세포의 생존을 연장시켜주는 역할을 한다는 것을 in vitro에서 확인할 수 있었다. 이와 같은 연구를 바탕으로 나선신경절 신경세포의 생존에 관여하는 요인에 대한 연구를 더 심도 있게 진행할 수 있으리라 사료된다. 그리고 면역자장분리법을 이용하여 나선신경절 세포에서 순수한 나선신경절 신경세포의 순수 분리는 적합하지 않았다.
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