교신저자：김경환, 140-757 서울 용산구 한강로 3가 65-207  중앙대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   후두암은 대부분 편평세포암종으로 진단되며 최근의 방사선 및 항암 요법의 발전에도 불구하고 후두암 환자의 생존율은 뚜렷하게 나아지지 않고 치료된 환자의 4%정도는 다른 부위에서 2차 원발암이 발생하기도 한다.¹⁾ 그러므로 후두암의 예방과 치료에 있어서 보다 새로운 분자생물학적 개념의 대상이 필요한 상태이다.
   두경부암을 포함하는 상피세포 기원의 신생물에서 prostaglandin의 역할은 여러 논문들을 통해 보고되고 있다. Prostaglandin은 cyclooxygenase의 작용에 의해 arachidonic acid로부터 생성되며, prostaglandin E2와 같은 prostaglandin은 세포증식을 촉진시키며, 악성세포에 대한 면역 반응을 억제하고, 세포고사를 억제함으로써 신생물의 성장에 관여한다고 알려져 있다.²⁾ 따라서 prostaglandin의 생성에 관여하는 cyclooxygenase(COX)의 중요성에 대해 많은 연구들이 보고되고 있다. Cylcooxygenase는 arachidonic acid로부터 prostaglandin을 합성하는데 촉매역할을 하며, cyclooxygenase-1(COX-1)과 cyclooxygenase-2(COX-2)의 두 아형이 있다. 이 중 COX-1은 외부 환경의 변화에 관계없이 기본적으로 항시 일정한 수준의 발현을 유지하고 있다.³⁾ 이와는 대조적으로 COX-2는 성장인자, 발암유전자, 발암물질 그리고 tumor-promoting ester 등에 의하여 즉각적이고도 조기에 COX-2 유전자로부터 유도 합성된다.⁴⁾⁵⁾ COX-2가 암의 발생에 있어 중요한 역할을 하는 것에 대한 증거는 주로 대장암에서 연구가 이루어졌고⁶⁾⁷⁾ 최근에는 상부 위장관, 피부, 호흡기, 비뇨기 등의 분야로 확대되어지고 있는 실정이다.
   두경부 영역에서의 COX에 대한 연구는 외국의 문헌에는 1999년부터 보고되기 시작하였지만 국내에서는 아직 보고 된 것이 없는 상황이며 이에 저자들은 이 연구에서 후두 편평세포암종, 암세포 주위의 정상 후두점막 그리고 일반인의 정상 협부 점막에서의 COX-1과 2의 발현양상을 확인하여 후두 편평세포암종 발생과정에 대한 분자생물학적 이해와 함께 COX-2 억제제 투여가 후두 편평세포암종의 예방 및 치료에 있어 유용한지에 대한 그 가능성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험군으로는 1996년 1월부터 2000년 12월까지 5년 동안 중앙대학교 이비인후과학교실에서 후두 편평세포암종으로 진단되어 전후두적출술을 시행한 환자의 조직중에서 보관상태가 양호한 21명(남자 21명. 40~75세, 평균나이 60.8세, 병기 Ⅱ-Ⅳ)의 조직 표본을 대상으로 하였고, 정상 대조군으로는 본원의 전공의 및 학생들 중 흡연력이 없고 구강내 전암성 병변 및 전신 질환이 없는 건강한 지원자 20명(남자 20명, 25~30세, 평균나이 27.8세)에게 충분한 설명을 하고 사전 동의를 구한 후 그들의 협부 점막을 대상으로 하였다.

방  법

조직 채취
   실험군인 후두 편평세포암종과 정상 후두점막의 채취는 보관된 후두의 조직표본 중 보관상태가 양호하고 동일 슬라이드에서 암세포와 암세포 주위에 조직학적으로 정상인 후두 상피를 가지는 조직 표본을 택하였으며, 대조군인 정상 협부 점막의 채취는 외관상 백반증이나 염증 등의 점막 병변이 없는 부위를 찍어냄 생검을 하여 이루어졌다.

면역조직화학적 염색
   조직의 파라핀 블록에서 파라핀을 제거한 뒤 0.05M의 Tris buffer로 각각 2분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고, 3분간 무수메탄올에서 3% 과산화수소를 가지고 조직을 처리하였다. 각각 5분간 3차례씩 0.05M의 Tris buffer로 슬라이드를 세척하고 0.01M의 citrate buffer(pH 5.6)에 담궈 고압 멸균하여 epitope를 상기시킨 뒤 실온에서 천천히 식혀주었다. 0.05M의 Tris buffer로 각각 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 serum blocking 용액으로 배양한 뒤 실온에서 60분간 처리하였다. Serum blocking 용액을 털어 버리고 정제된 양의 COX-1에 대한 COX-1 monoclonal antibody(Catalog No. 161110, Cayman Chemical) 또는 인간의 COX-2로부터 유도 합성된 COX-2 monoclonal antibody(Catalog No. 160112, Cayman Chemical)를 50배 희석하여 하루 밤 동안 각각 다른 조직에 처리하여 주었다. 0.05M의 Tris buffer로 각각 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 biotinylated second antibody로 실온에서 15분간 배양한 뒤, 0.05M의 tris buffer로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 효소 결합체로 실온에서 15분간 배양하였다. 0.05M의 Tris buffer로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 DEC chromogen으로 발색시킨 뒤 D.D.W로 5분간 3차례씩 슬라이드를 세척하고 mayer hematoxyline으로 대조 염색 후 gelatin mountant로 슬라이드를 제작하였다. Kit는 histostain SP kit(Zymed LAB-SA detection system)를 사용하였다.

염색정도의 판정
   정상 협부 점막, 암 조직 그리고 암 조직 주위의 정상 후두점막으로 이루어지는 3그룹의 조직을 100배로 확대된 현미경하 슬라이드 상에서 조직 전체가 염색되지 않았거나 전체의 10%미만으로 염색된 경우를 음성으로 판독하였고, 조직 전체의 10%이상 염색을 보이는 경우를 양성으로 판독하였으며, 판독은 1명의 해부병리학자에 의해 시행되었다. 3그룹간 발현율의 차이에 대한 통계적 유의성에 대해서는 SPSS 10.0 version을 이용하여 Pearson Chi-Square검정을 실시하였고 유의수준은 1%이내로 하였다.

결     과

COX-1의 발현
   COX-1 단백질에 대한 항체의 면역조직화학적 염색은 정상 협부 점막 상피세포(20예), 암세포 주위의 정상 후두점막 상피세포(21예), 후두 편평세포 암종(21예) 모두에서 양성으로 판독되었으며(Table 1) 염색된 정도가 정상 상피세포나 암세포의 세포질 내에서 약하지만 균일하게 나타났다(Figs. 1 and 2).

COX-2의 발현
   COX-2 단백질에 대한 항체의 면역조직화학 염색에서는 3그룹간 통계학적으로 유의한 염색 차이를 보였다(p<0.01)(Table 1). 즉, 정상 협부 점막에서는 20예 모두 염색되지 않아 음성으로 판독되었고 실험군인 후두 편평세포암종에서 암세포가 침범하지 않아 조직학적으로 정상인 후두 상피세포에서는 대부분이 염색되지 않았지만 일부 3예에서는 염색이 약하게 된 것을 관찰할 수 있었다. 이에 비하여 암세포에서의 염색 양상은 전체 21예 중 16예에서 중등도 이상으로 염색되어 양성으로 판독되었고 음성으로 판독된 나머지 5예에서도 약하게라도 염색을 관찰할 수 있어 전혀 염색이 되지 않는 정상 협부 점막과는 분명한 대조를 이루었다(Fig. 3).
   통계처리는 되지 않았지만 암세포의 분화도에 따라 염색된 양상이 달랐는데 중등도로 분화(moderately differanciated)된 7예 중 3예가 양성이었고 각질화가 잘 되어있어 좋은 분화도(well differenciated)를 보이는 14예에서는 12예가 양성으로 나타났으며 그 염색정도도 분화도가 좋을 수록 강하게 나타났다(Fig. 4). 또한 원발병소나 병기에 따른 염색 정도의 양상은 성문암과 조기침습암의 경우 상대적으로 염색이 강하게 나타났다.

고     찰

   여러 역학적 통계나 인간의 암 조직, 동물 모델, 그리고 배양된 종양세포를 대상으로 한 연구에서 COX-2는 인간의 여러 종류의 암조직, 특히 대장암, 피부암, 간암, 유방암 그리고 방광암에서 증가되어있다.²⁾ COX-2는 ras와 scr 같은 oncogene, interleukin-1, hypoxia, benzo〔a〕pyrene, ultraviolet light, epidermal growth factor, transforming growth factor beta, 그리고 tumor necrosis factor 등에 의해 유도될 수 있고 dexamethasone, antioxidant 그리고 p53 등에 의해 억제된다.²⁾ 가장 먼저 연구가 이루어지고 활발하게 진행된 분야는 인간 대장암 발생에서의 COX-2 역할이다. 쥐를 대상으로 한 실험에서 COX-2 유전자를 제거하면 가족성 선종성 용종증의 용종 크기 및 수가 많이 감소하였고,⁶⁾ 비선택적 COX 억제제인 aspirin, indomethacin을 장기 복용한 사람이 그렇지 못한 사람보다 대장암 유병율이 낮게 나타났으며⁸⁾ 쥐를 대상으로 발암물질을 투여하여 인위적으로 유도된 대장암의 경우도 COX 억제제의 투여가 대장암의 발생을 저하시켰다고 보고되었다.⁷⁾ 또한 비 선택적 COX-2 억제제의 장기 복용으로 인한 위출혈, 위천공 등의 위장관 부작용으로 인해 부작용이 적은 선택적 COX-2 억제제가 1990년도 후반기에서 실험에 주로 이용되기 시작하여 대장암의 화학적 예방의 대상으로 적용되어 그 효과가 증명되었지만 위암과 전립선암에서는 그 효능이 밝혀지지 않았다.^9)10)11)
   두경부영역의 편평세포암종에 대한 분자생물학적 연구의 일환으로 COX의 적용은 Frank 등¹²⁾의 연구에 기인한다. 이 연구에 의하면 인간 설 편평세포 암종의 세포가 leukotriene 억제제에 의해 현저하게 그 증식이 감소되는 것을 밝혀내고 임상에서 arachidonic산 억제제를 설암의 예방적 화학요법의 목표로 제시하였고, 이후 다른 연구에서 인간의 구강 편평세포암종에서 retinoid를 이용하여 epidermal growth factor 매개 COX의 발현이 감소되고 이에 따른 prostaglandin E2의 합성이 저하되어 각종 상피세포의 암 발생을 억제한다고 하였다.¹³⁾
   두경부암에서의 COX-2의 발현에 대한 연구는 1999년도부터 발표되었다. 식도 편평세포암종에서 COX-1은 정상 구강상피세포와 암세포 모두 면역 조직화학염색에서 비 특이적으로 나타난 것에 반해 COX-2는 정상 구강 상피세포에 비해 암세포에서 COX-2의 발현이 증가되었고 미분화 암세포보다는 분화도가 좋은 세포에서 발현의 정도가 증가되어 나타났다.¹⁴⁾ 후두의 양성질환에 대한 연구에서는 인간 후두 유두종 5예에서 COX-2가 정량적, 정성적 방법 모두에서 정상 구강 상피세포보다 뚜렷한 발현의 증가가 나타났다.¹⁵⁾ 저자들은 본 연구를 통해 후두의 편평세포암종에서 COX-1은 정상 구강 상피세포, 암세포 주위 정상상피세포 그리고 암세포 구분 없이 일정하게 염색되어, COX를 이루는 두 가지 아형 중 세포의 염증이나 이형성 정도에 관계없이 일정하게 발현되는 아형이라는 기존의 보고를 확인 할 수 있었다.¹⁶⁾ 이와는 반대로 정상 협부 점막과 후두 점막에 비해 후두 편평세포암종에서는 COX-2의 명백한 과발현이 관찰되었다. COX-2의 발현 양상은 정상 협부 점막에서는 전혀 그 발현을 관찰할 수 없었고 암세포 주위의 정상 후두 상피세포에서는 3예에서 양성으로 판독되었지만 전반적으로 약하게 발현되어 COX-2가 염증성 변화나 세포의 이형성증에 의해 일부 발현될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.¹⁷⁾ COX-2의 암 세포에서의 발현은 전체 21예 중에서 16예 대부분이 강하게 염색되어 COX-2 유전자로부터 많은 양의 단백질이 만들어졌다는 것을 유추할 수 있고 음성으로 판독된 나머지 5예에서도 일부분의 발현을 보인 것은 정상 협부 점막과는 대비되는 사실이다. 또한 식도 편평세포암종에서 보고된 것과 같은 양상으로 암세포의 분화정도에 따른 발현양상은 각질화가 잘되어 분화도가 좋은 암세포의 세포질에서 미분화되었거나 중등도의 분화도를 보이는 세포보다 강하게 발현되었다. 현재까지 후두암에서 분화도에 따른 COX-2의 발현양상의 차이에 대한 보고가 없기 때문에 암세포의 분화도나 병기와 관련된 COX-2의 발현양상에 관한 연구는 추가로 이루어져야 하겠다.
   두경부암 발생에서 COX-2은 여러 가지 방식으로 암 발생에 관여를 한다. COX-2의 과발현으로 인한 prostaglandin의 과생성은 세포증식과 혈관생성을 촉진하며 면역감시 시스템을 억제하는데 이러한 효과는 암세포의 성장에 긍정적 영향을 미친다. 또한 COX-2의 과발현은 세포고사를 억제하고 침습성을 강화시키는데 특히 세포고사를 억제하는 것은 종양세포에서 COX-2가 미치는 요인 중 가장 중요한 역할을 한다. 선택적 또는 비 선택적 COX-2 억제제를 투여하면 이러한 세포고사 억제현상이 해소되어 정상적인 세포 주기에 따라 세포고사가 진행된다.²⁾ 또한 두경부영역과 같은 간외(extrahepatic) 세포조직에서는 산화제의 활동이 낮아져 있기 때문에 발암 전구 물질을 발암물질로 활성화시키는데 상대적으로 COX-2의 역할이 명백해진다. 예를 들면 COX-2는 담배의 발암 전구물질인 B〔a〕P-7,8-dihydrodiol을 아주 강력한 발암물질인 B〔a〕P-diolepoxide로 산화되는데 강한 촉매 역할을 한다.¹⁸⁾
   현재 후두암을 예방하기 위한 가장 좋은 방법은 역학적인 측면에서 볼 때 금연, 금주 그리고 방사선 피폭의 제한이 중요시되고 있으나 이미 고위험군에 속해있는 사람에 대해서는 특이할 만한 예방방법이 없고 조기 진단에 매달리는 실정이다. 또한 후두암의 치료이후에 나타나는 많은 수의 재발에 대한 예방방법에도 특별한 것이 없다. 현재 외국에서는 두경부 편평세포암종에서 COX-2 발현에 대한 연구에서 정량적 방법을 통하여 어느 정도 COX-2의 과발현여부가 증명되고 있으며¹⁹⁾ 일부에서는 누드마우스에 암세포를 이종 이식하여 선택적 COX-2 억제제의 항암 효과를 증명)하는 단계에 있는 실정이다.²⁰⁾ 이후 실험 동물을 통한 후두암 발생과 그에 따른 COX-2의 과발현 여부, 그리고 선택적 COX-2 억제제에 의한 후두암의 발생 및 진행 억제에 대한 연구가 진행되어 COX-2가 후두암 발생에서 차지하는 역할이 명확해지면 선택적 COX-2 억제제가 후두암의 예방 및 치료에 이용 될 가능성이 있어 두경부암 분야의 새로운 분자생물학적 전기가 마련될 것이다.
   이 연구에서는 표본의 수적 한계와 더불어 반 정량적 방법인 면역조직 화학적 방법을 사용하였고 해부 병리학자의 주관적 판단이 작용했을 가능성 이 있으므로 향후 이를 보완한 연구를 시행하여야 할 것이다.

결     론

   정상인의 협부 상피, 후두 편평세포암종 그리고 암세포 주위의 정상 후두 상피에서 COX-1과 COX-2의 발현 양상에 대한 실험을 한 결과, COX-1은 면역조직화학염색에서 각 대조군간 차이 없이 일정하게 발현되는 양상이 관찰되었으며 이와는 대조적으로 COX-2는 후두 편평세포암종의 세포에서 정상 상피세포에 비해 그 발현이 유의하게 증가되었다. 이러한 결과를 통하여 본 저자들은 후두 편평세포암종의 발병기전에서 COX-2가 중요한 역할을 한다는 것과 선택적 COX-2 억제제가 후두 편평세포암종의 예방 및 재발방지 목적으로 사용될 수 있는 가능성을 제시한다.

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