교신저자：우훈영, 139-707 서울 노원구 상계 7동 761-1  인제대학교 의과대학 상계백병원 이비인후과학교실
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서     론

   감각신경성난청은 인구의 노령화, 소음공해 및 이독성물질의 증가로 인하여 그 빈도가 증가하고 있으며, 이러한 감각신경성난청의 기전, 예방 및 치료 연구에 이용되는 동물 model에 많이 쓰이는 약제가 salicylate이다.
   Salicylate는 소염, 해열, 혈전방지 및 진통제로 쓰이는데, 이 약의 부작용으로 소화기 점막출혈, 간 및 신장독성 등이 있으며 이독성(ototoxicity)으로 경도 내지 중등도의 난청과 이명이 나타나나 이는 복용 중단 24~72시간 이후에는 사라지는 일과성으로, 이러한 salicylate의 이독성의 기전에는 많은 논란이 있다.
   알려진 기전으로 Escoubet 등¹⁾은 내이의 prostaglandin 농도측정으로 salicylate가 prostaglandin의 cyclooxygenase 활동을 억제하여 prostaglandin의 생성저하가 원인이라 하였으나 Puel 등²⁾은 역시 prostaglandin 합성을 억제하는 mefenamate나 mecrofenamate에 의한 청력감소는 없는 것으로 보아 salicylate의 이독성이 prostaglandin 억제론에 의한다는데 동의하지 않고 있다.
   그러나 Jung 등³⁾⁴⁾은 이와는 달리 정원창에 salicylate를 유치한 후 20~40 dB의 청력감소와 외림프 내의 6-keto-PGF_1α의 감소를 보고하였고 또한 leukotriene blocker(Sch 37224)의 전처치로 salicylate 이독성이 예방되는 것을 보고하였다.
   Didier 등⁵⁾은 laser doppler를 이용하여 salicylate 투여 후 와우혈류량 감소를 관찰하고 이는 leukotriene의 증가에 의한다는 가설을 발표하였다.
   다른 설명으로, 산소를 사용하는 생물체에서 대사의 부산물로 생성되는 free oxygen radicals(FORs)에 의한 세포의 기능과 구조에 대한 손상을 이독성의 기전으로 생각하는 견해가 있다.
   FORs의 이독성의 간접적인 증거로는 소음,⁶⁾ 와우의 허혈 및 재관류⁷⁾나 이독성 물질인 cisplatin,⁸⁾ gentamicin⁹⁾ 투여시 나타나는 이독성이 FORs제거제(scavenger) 투여시 완화되며, 직접적인 증거로는 aminoglycoside나 cisplatin 투여후에 와우조직에서 FORs의 생성증가에 대한 보고가 있다.¹⁰⁾
   Na-salicylate의 난청 기전이 와우혈류량 감소에 의한 허혈-재관류시 나타나는 FORs에 의한 손상 인지를 알아보기 위하여 FORs 생성 억제제인 allopurinol 혹은 FORs 제거제인 superoxide dismutase 투여군과 투여하지 않은 군에서 Na-salicylate의 이독성을 비교하는 동물 실험을 하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험동물은 이경 검사 상 정상 고막을 가지고 있고 정상 뇌간유발반응을 보인 250~300 gm의 albino guinea pig 25마리를 암수 구별 없이 사용하였다.
   Na-salicylate(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)로 난청 model을 만들었으며 FORs 억제제, allopurinol(Sigma)과 superoxide dismutase-polyethylene glycol(SOD-PEG)(Sigma)을 사용하였다. 전기와우청력검사는 Nicolet사의 Spirit system, 이음향방사검사는 ILO 92(Otodynamics London, U.K.)를 이용하여 두 검사 모두 무음향방음실(IAC, U.S.A. type 5)에서 실시하였다.

방  법
   동물수술은 atropine sulfate(Atropine^®)을 0.67ml/kg 근육주사 후 30분에 ketamine hydrochloride(50 mg/ml)와 xylazine hydrochloride(Rumpun^®)(23.32 mg/ml)를 각각 30 mg/kg로 근육주사하여 마취를 시작하였으며 필요한 경우 ketamine hydrochloride를 추가 주입하여 마취상태를 유지하였다.
   실험은 3군으로 나누어 각 군의 양측 정원창와를 노출시킨 후 전기와우청력검사와 이음향방사검사(TEOAE, DPOAE)를 실시한 다음 5 μl 부피의 약물로 적신 gelfoam(Upjohn, Kalamazoo, MI, U.S.A.)을 정원창와에 위치시켰다.
   2시간 후 gelfoam을 제거한 다음 제거 직 후, 제거 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 마다 한번씩 총 6회에 걸쳐 상기 청각 검사를 방음실에서 반복하였다.
   전기와우청력검사의 자극음은 filtered click음을 insert phone을 이용하여 70, 50, 30, 20, 10, 5, 0 dBnHL의 강도로 준 후 복합활동전위(compound active potential, CAP)로 역치를 측정하였다.
   유발이음향방사(TEOAE)는 0~6 kHz의 음역을 가진 click음으로 지속시간 80 μsec으로 잠복기 20 msec이었고 0 dB test gain, 선형 mode로 검사하였다.
   변조이음향검사(DPOAE) 측정은 input-output(I/O) function을 측정하였으며 f2/f1＝1.221, f2＝6 kHz로 하여 35 dB부터 5 dB씩 자극 강도를 높여, 80 dB까지 10개의 primary zone level에 대한 반응을 얻었다.
   약물투여는 3개군으로 각군마다 5마리씩 실험을 실시하였다.
   1군은 Na-salicylate 40 mg/ml이 되도록 생리식염수용액으로 농도를 맞춘 후 5 μl를 gelfoam에 적셔 정원창와에 놓았다(200 ng/5 μl).
   2, 3군은 FORs 억제제 전처치 군으로 2군은 allopurinol 46 mg을 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma) 10 ml에 녹인 후 10 mg/kg로 주기 위해 300 g의 guinea pig에게 3 mg(0.65 ml)을 생리식염수로 1：2 희석하여 3 mg/1.95 ml의 농도로 만들어 Na-salicylate gelfoam soaking 24시간 전, 12시간전, 바로 직전의 3회에 나누어 복강에 각각 0.65 ml씩 주사 하였다. 3군은 SOD-PEG 2000 U/kg를 생리식염수 0.6 cc에 섞어 soaking 24시간전, 바로 직전의 2회에 나누어 근육주사 후 Na-salicylate soaking을 실시 하였다.
   대조군 실험으로 Na-salicylate 녹이는데 이용한 생리식염수로 gelfoam soaking을 한 경우와 allopurinol의 vehicle로 이용된 DMSO만 복강 투여한 경우를 각각 5마리에서 상기 검사를 실시하였다.
   통계분석은 CAP 결과는 repeated measure ANOVA로, 변조이음향방사 결과는 one way ANOVA로 처리하였으며 DPOAE의 발생기전이 자극음 강도에 따라 다르다는 것에 근거하여 60 dB이하 군과 60 dB이상 자극군으로 나누어 비교하였다.

연구결과

전기와우청력검사 소견
   전형적인 2시간, 6시간 때의 CAP 반응으로 Na-salicylate 단독 투여군은 2시간에 20 dB 역치상승 후 6시간에 정상으로 돌아왔고 두 전처치군에서는 역치상승은 없었다(Fig. 1).
   Na-salicylate 투여군의 청각역치상승은 gelfoam 제거 직후부터 나타났으며 2시간에 정점에 도달한 후 6시간이후부터 회복되고 있으며 FORs 억제제인 allopurinol과 SOD-PEG 전처치 군에서는 변화가 없었다(p<0.001)(Fig. 2).

유발이음향방사(TEOAE) 검사 소견
   유발이음향방사의 발현율(Cumulative positive response rate)을 비교하여보면 Na-salicylate 투여군에서는 gelfoam 제거 1시간 후에 50%로 발현율이 저하되었으나 allopurinol 전처치군은 60%, SOD-PEG 전처치군은 75%로 발현율이 높았다. 2시간 후에는 allopurinol 전처치군에서만 발현율이 낮았으나 4시간 이후에는 전처치군에서 Na-salicylate 군보다 발현율이 높았다(Fig. 3).

Input/output DPOAE 검사소견
   높은 자극 강도군(65 dB, 70 dB, 75 dB)과 낮은 자극 강도군(50 dB, 55 dB, 60 dB)군으로 나누어 DP amplitude를 비교하여 보면 Na-salicylate투여군의 경우 gelfoam 제거 직후 두 전처치군에서 DP amplitude는 높았으나 통계상 의미 없었다. 1시간 후에는 Na-salicylate 투여군과 allopurinol 전처치군의 높은 강도군(p<0.04)과, 낮은 강도군(p<0.001) 모두에서 DP amplitude의 감소가 보였으나 SOD-PEG 전처치군에서는 DP amplitude의 감소가 없었다(p<0.01)(Fig. 4).
   대조군으로 생리식염수 soaking한 군과, allopurinol의 용매인 DMSO 복막 투여군 모두에서는 난청이 나타나지 않았으며 OAE 반응도 정상이었다.

고     찰

   Salicylate 이독성 연구에는 이온화에 의한 막투과성이 좋은 Na-salicylate(molecular weight：160.11)가 많이 쓰인다.²⁾
   Salicylate 이독성은 prostaglandin의 cyclooxygenase 작용을 억제하여 lipoxygenase 생성물인 leukotriene의 증가로 기전을 설명하는데 그 이유로 혈관조와 나선인대(spiral ligament)의 혈관들은 확실한 신경지배가 없으므로 hormone에 의해 영향받는다 하였고,¹⁾ 정원창에 salicylate 유치 후 난청과 외림프내의 6-keto-PGF₁α의 감소를 보고하여 cyclooxygenase가 억제됨을 증명하였다.³⁾ 그러나 Puel 등²⁾은 다른 nonsteroidal antiinflammatory drug에서 난청이 없는 것으로 미루어 prostaglandin 이외의 기전이 있다 하였으나 Jung 등¹¹⁾은 salicylate투여 후 와우혈류량의 감소를 보고하였고 leukotriene억제제(Sch 37244) 투여로 난청과 혈류량감소가 나타나지 않는 것으로 보아 leukotriene으로 인한 혈관축소가 난청의 원인이라 하였다.
   Cazals 등¹²⁾도 와우의 혈류장애가 원인이라 보고 혈관조절제(vasoactive compound)를 이용한 실험을 시행하였다. 즉 혈관조절제 단독투여로는 난청이 없으며 salicylate와 noradrenalin antagonist인 raubasine이나 dihydroer-gocristine 투여시에는 난청이 감소하였으나 noradrenalin agonist인 metaraminol, 다른 혈관 이완제인 naftidrofuryl(serotonin antagonist)과 pribedil(dopamine agonist)은 난청을 완화시키지 못하는 것으로 보아 salicylate는 나선판(spiral lamina)의 noradrenergic 교감신경계의 지배에 변화를 주어 와우의 혈행장애를 일으켜 이독성을 나타낸다고 하였다.
   그 외 외유모세포 자체에 대한 독성으로 세포막 투과성의 변화에 의한 외유모세포의 current flow의 변화¹³⁾로 salicylate 이독성 기전을 설명하기도 한다.
   Salicylate와 leukotriene이 와우 혈류량을 감소시켜 일시적인 저산소상태를 형성하면 다른 조직에서와 같이 FORs이 발생하여 조직손상을 나타내며 와우혈관의 압박에 의한 저산소증,⁷⁾ 소음성 난청⁶⁾에서 FORs와 이독성의 관계는 이미 밝혀져 있다.
   FORs의 와우독성에 대하여는 많은 연구가 진행중이나 FORs 투여 후 난청이 오며¹⁴⁾ 분리된 외유모세포를 FORs에 노출시키면 인산지질이 FORs에 의해 과산화(peroxidation)되어 세포막 손상으로 인해 세포크기가 변하고 표면에 수포(bleb)가 생기며¹⁵⁾ 세포내 Ca^＋＋의 증가로 세포손상이 온다.¹⁶⁾
   Yamane 등¹⁷⁾은 guinea pig에 소음을 준 후 strial blood flow가 줄어들고 2시간 후에 정상으로 돌아오며 O₂^-은 처음 출현 후 30분 지나 사라졌다 2시간 후에 다시 나타나는 것을 와우 재관류에 의한다고 하였다.
   FORs이 난청을 유발한다고 알려져 있는 경우는 organometal,¹⁴⁾ cisplatin,⁸⁾ aminoglycoside항생제⁹⁾가 있으나 이러한 물질에 의한 이독성에는 FORs이외의 다른 원인도 관여한다. 그러므로 항산화효소제나 FORs억제제가 이독성의 완전예방보다는 일부 예방효과를 나타낸다.³⁾ 본 실험에서 약물 투여 후 TEOAE의 echo response가 사라지는 경우를 시간대로 분류하면 Na-salicylate의 경우 gelfoam제거 2시간까지 negative response가 많으나 그후 회복되며 allopurinol 전처치군보다도 SOD-PEG 전처치군에서 난청 예방 효과가 컸다(Fig. 3).
   본 실험에 쓰인 allopurinol은 4-hydroxy pyrazolo(3, 4-d)pyrimidine으로 허혈조직에서 FORs의 주 공급원인 xanthine oxidase를 억제하여 purine과 FORs의 생성을 억제한다.
   Superoxide dismutase(SOD)는 Zinc dependant metallo enzyme complex로 O₂·-＋O₂·-＋2H^＋→H₂O₂＋O₂ 반응후, H₂O₂를 항산화제인 catalase나 glutathione peroxidase의 도움으로 O₂와 H₂O로 만든다. SOD의 반감기가 1~4분으로 짧으므로 이 실험에는 반감기가 15~24시간인 SOD-polyethylene glycol(PEG)을 사용하였다.
   허혈 재관류 동물 model에서 CAP의 감소에 대한 allopurinol과 SOD-PEG 사이에 차이는 없었다.⁹⁾
   CAP의 감소가 내유모세포와 Type 1 나선 신경절세포(spiral ganglion cell, SGC 1)에 대한 FORs의 효과인지 혹은 외유모세포의 손상에 의한 것인지는 모르며 내유모세포와 SGC 1에 대한 FORs의 연구는 없으나 내유모세포막과 SGC 1의 수초(myelin)에 불포화지방산이 많으므로 과산화에 의한 손상의 가능성은 있다. 그러나 본 결과에서 70 dB, 50 dB의 큰 자극음에 대한 CAP는 변화없고 낮은 음 자극강도에서 변화를 보이는 것으로 보아 외유모세포의 병변이 추정된다(Fig. 1). Na-salicylate 투여군에 비해 두 전처치군은 모두 의미있게 청각역치 상승이 억제되었다(Fig. 2). TEOAE 발현율은 SOD-PEG 전처치군에서 allopurinol 군보다 효과적으로 이독성이 예방되었다(Fig. 3).
   낮은 자극에 예민하게 이음향방사가 변하는 소음, 이독성약물, 허혈 등에 의한 이독성은 모두 외유모세포의 병변을 의미하며¹⁸⁾ 특히 DPOAE는 예민하며 정상청력이나 초고주파 청각손실이 있는 경우 순음청력검사로 찾지못한는 미미한 외유모세포의 병변을 찾을 수 있으며 와우혈류량을 DP-OAE검사로 추정할 수 있다고 하였다.¹⁹⁾
   DPOAE의 경우 예비실험결과 6 kHz의 I/O DPOAE가 가장 예민한 반응을 보여 지표로 선택했으며 일반적으로 알려진 것과는 달리 Na-salicylate군은 낮은 강도와 높은 강도의 자극에 모두 감소하였으며 그 이유가 국소주입에 따른 결과인지 혹은 검사 주파수에 의한 것인지 좀더 연구가 필요하다. FORs억제제에 의한 예방은 역시 SOD-PEG에서만 의미있게 예방되었다(Fig. 4). 이는 allopurinol이 FORs의 생성 억제만이 아니라 제거제로도 작용하여 FORs에 대한 억제제 역할이 더 크다는 Betz²⁰⁾의 결과와 다르며 이에 대한 더 많은 실험이 요구된다.

결     론

   Na-Salicylate의 정원창막을 통한 와우국소 투여후 CAP측정결과 일시적 난청이 나타났으며 OAE 검사상에서도 TEOAE와 DPOAE가 억제 되었다. FORs 억제제 전 처치시 효과적으로 난청이 예방되었다. 이음향방사검사에서는 FORs 억제제 전 처치로 TEOAE, DPOAE 모두 SOD-PEG가 allopurinol보다 예방효과가 좋았다.

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