교신저자：정원호, 135-710 서울 강남구 일원동 50 성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   Gentamicin(GM)에 의한 와우의 이독성 손상은 Wersall 등¹⁾이 처음 소개한 이후에 형태학적인 연구가 많이 되어왔다. 이러한 이독성 손상을 위한 동물 모델로 약물의 다양한 투여방법이 사용되었다. Hawkins 등²⁾과 Ylikoski 등³⁾은 전신적으로 GM을 주사하여 유발되는 이독성 효과를 보고하였다. 전신적인 이독성 약물의 주입은 투여방법은 용이하지만, 약물에 의한 신독성으로 인해 약물의 반감기가 증가하여 개체마다 이독성 효과의 정도가 다를 수 있다는 단점이 있다.³⁾ 또한 실험동물이 신독성으로 인해 사망하는 경우가 있으므로 오랜 시간 동물을 살려두어야 하는 실험에는 부적합한 방법이 될 수 있다.⁴⁾
   따라서 이러한 전신적인 부작용을 줄이기 위해 국소적으로 약물을 주입하는 방법이 사용되었다. 국소적으로 투여하는 방법에는 고실내(intratympanic) 주입법과 내이(intraotic) 주입법이 있다. 이러한 국소투여방법으로 약물을 직접 주입하게 되면, 전신적인 투여의 단점을 줄이고, 약물투여와 반응간의 시간적인 관계를 확인할 수 있다.⁴⁾ 또한 투여된 약물의 용량과 손상의 정도와의 관계를 전신투여 방법보다 정확하게 연관지을 수 있다.⁴⁾ 그러나 고실내 주입법은 이관을 통한 약물의 배출이나 정원창을 통한 침투속도에 따라 와우내 약물 농도가 영향을 받는다는 단점이 있다. 내이 주입법은 Kimura 등⁵⁾과 Carranza 등⁶⁾이 고안한 일정량의 GM을 포함한 gelfoam을 상반규관내의 외림프강내로 넣어 약물이 외림프내에 녹아들도록 하는 방법과 와우의 고실계(scala tympani) 내로 한번에 적정량의 약물을 직접 주사하는 방법이 있다.⁷⁾ 그러나 이러한 방법은 주입부위에 주로 높은 농도의 약물효과를 보이고 와우 전체에 균일한 약물의 효과를 보여주지 못하는 단점을 가지고 있다.⁸⁾⁹⁾
   최근에는 위의 단점들을 보완할 수 있는, 일정 농도의 약물을 일정한 속도로 공급할 수 있는 삼투펌프(Alzet, Alza, Palo Alto, CA)가 개발되어 동물실험에 이용되고 있다. 삼투펌프(osmotic pump)의 본체는 전달할 약물을 넣어두는 저장고와 특정 삼투 물질을 함유하여 삼투압에 따라 주위의 조직액을 흡수하는 공간으로 구성되어 있다. 외벽은 삼투막으로 구성되어 조직액의 흡수가 가능하고, 저장고의 벽은 비삼투막으로 구성되어 있다(Fig. 1B). 삼투펌프는 제작당시 37°C의 체온에서 적절한 삼투압을 유지하도록 하여 외벽을 통해 본체 내로 조직액이 들어오고, 흡입된 조직액의 압력에 의해서 저장고에 들어있는 약물이 일정한 속도로 빠져나가게 된다. 삼투펌프는 저장고의 크기 및 약물 전달 속도의 차이에 따라 여러 모델이 있다.
   본 연구는 친칠라를 실험동물로 이용하여 삼투펌프를 이용한 GM의 내이 주입방법을 개발하고자 하였다. 이를 위해 삼투펌프를 통한 GM 투여 후 경과 기간에 따른 이독성효과의 차이를 반정량적인 방법으로 분석하였다. 이를 통해 자체 고안된 캐뉼라를 통해서 와우내로 약물을 전달할 수 있는 새로운 모델을 제시할 수 있을 것이다.

재료 및 방법

삼투펌프의 준비
   내이 주입을 위하여 삼투펌프의 본체와 연결되는 캐뉼라는 Kingma의 방법⁹⁾을 이용하여 제작하였다(Fig. 1A). 길이가 1.25 cm 되는 테프론관(0.13 mm ID×0.18 mm OD)을 8 cm 길이의 관(1.10 mm OD×0.64 mm ID)에 실리콘으로 연결시킨다. 와우내로 들어갈 관의 끝은 5~6 mm 정도 나오도록 하고, 실리콘 한방울을 관끝의 0.5 mm되는 곳에 묻혀서, 와우내로 들어가는 캐뉼라의 길이를 지정하고 관이 삽입된 후에 외림프액이 새는 것을 방지하게 한다. 삼투펌프(Alzet 2002, Alza Corp., Palo Alto, CA) 는 시간당 0.5 μl의 속도로 용액을 전달하는 모델을 사용하고, 실험동물에 삽입하기 전에 4시간동안 37°C, 0.9% 생리식염수에 놓아두어 삽입직후 작동이 원활히 시작되도록 한다. 삼투펌프 안에는 1주일 동안 GM의 총량이 0.1 mg 들어가도록 약물의 농도를 1.19 mg/ml로 조절하여 넣어둔다.

삼투펌프의 삽입 및 제거
   본 실험에 사용된 친칠라(Chinchilla laniger, 6~24 months old, 450~550 grams)를 xylazine(3 mg/kg)과 ketamine(20 mg/kg)으로 근육 주사하여 마취시킨 후 heating pad를 이용하여 수술도중 체온이 떨어지지 않도록 유지시킨다. 친칠라의 이개 후부로 접근하여bulla를 열고, 와우의 기저회전부와 정원창을 확인한 후에 정원창 가까이 고실계 부위에 25 gauge의 바늘을 이용하여 작은 구멍을 만든다. 앞서 제작한 삼투펌프의 캐뉼라 끝을 실리콘으로 표시된 부위까지 삽입시킨다. 연조직을 이용하여 삽입부위를 막아 외림프액의 누출을 방지한다(Fig. 1B). Bulla의 외측벽에 캐뉼라가 빠지거나 움직이지 않도록 단단히 고정시키고, 삼투펌프의 본체는 친칠라 등의 피하층에 공간을 확보한 후 넣어둔다. 1주일동안 약물 주입을 마친 후에는 삼투펌프의 본체를 제거하고, 캐뉼라를 결찰하여 더 이상 약물이 공급되지 않도록 한다.

실험동물의 처치
   대조군(n＝4)은 삼투펌프를 이용하여 gentamicin대신 생리식염수를 1주일간 주입한 후 1주일째에 실험동물을 희생시켰다. 실험군으로는 12마리의 친칠라를 이용하였으며, 총 0.1 mg의 gentamicin을 1주일동안 주입시킨 후에 각각 다른 시기에 실험동물을 희생시켰다. 제 1 군은 약물의 주입이 끝난 직후에 즉시 희생시켰고(1 week PT, n＝4), 제 2 군은 약물 주입 시작 후 2주째(2 week PT, n＝4), 제 3 군은 약물 주입 시작 후4주째(4 week PT, n＝4)에 동물을 희생시켰다.

조직의 채취
   4% Paraformaldehyde와 2.5% glutaraldehyde의 혼합 고정액을 이용하여 심장 관류를 시킨 후, 와우를 채취하여 같은 고정액속에 4시간 동안 고정시킨다. 고정액을 세척한 후에 0.1% osmium 고정액으로 1시간 동안 추가 고정시킨다. 표면처리방법(surface preparation)을 이용하여 와우의 기저막을 전장에 걸쳐 분리하고, 각 회전별로 위치를 결정한다. 이를 위해 NIH image program을 이용하여 기저막의 총 길이를 측정한 후에 와우의 각 부위별 위치를 기저막 끝에서 % 길이의 형태로 표시한다. 와우의 각 부위를 임계점 탈수시킨 후에 주사전자현미경(scanning electron microscopy, Hitachi, S-2460N)을 이용하여 관찰하였다. 와우 유모세포의 손상의 정도와 형태를 반정량적으로 관찰하였다. 반정량적인 분석을 위해서 각 실험동물당 4개의 대표적인 위치를 결정하였다. 기저막의 가장 끝부위에서 10%, 40%, 70%, 90% 길이가 되는 곳을 각각 구부(hook), 기저부(basal), 중간부(middle), 첨부(apical)라 하고, 이 부위에서 100 μm 길이의 구역 내에 포함된 유모세포의 수를 비교하였다. 입체섬모의 손상 정도에 따른 특별한 분류는 시행하지 않았고, 단지 소피판(utricular plate)의 존재 유무에 따라 유모 세포의 수를 정하였다. 남아있는 각각의 유모세포의 수를 각 위치별로 비교하였다.

통계분석
   와우의 구부, 기저부, 중간부, 첨부 구역에서 각 시간에 따라 손실된 유모세포의 차이의 유의성을 검증하기 위하여 Jonckheere 법을 이용하여 통계분석하였다.

결     과

   정상 친칠라에서 주사전자현미경을 통한 와우의 소견을 보여주고 있다(Fig. 2). 정상 와우에서는 내유모세포와 3열의 외유모세포의 입체섬모가 정연히 배열되어 있었고, 특히, 와우를 각 구역별로 나누어보면 첨부에서의 외유모세포의 배열이 다른 구역에 비해 불규칙적이었다. 생리식염수를 주입한 대조군(n＝4)에서는 정상 와우와 같은 주사전자현미경의 소견을 보였고, 유모세포의 소실을 발견할 수 없었다. 따라서 삼투펌프의 삽입 시술에 따른 유모세포의 소실은 일어나지 않음을 알 수 있다.
   실험군에서의 주사전자현미경 사진은 각 군에서 한 마리를 선택하여 구역별 사진을 보여주고 있다.
   제 1 주 실험군(1 week PT)에서는 내유모세포가 모든 구역에서 존재하고 있는 반면, 외유모세포는 구부에서는 완전히 소실되었고, 기저부에는 제 3 열의 외유모세포만 일부 남아있었고, 중간부에서는 일부의 제 1 열 외유모세포의 소실을 보여주고 있다. 외유모세포가 소실된 부위는 주변의 지지세포에 의해서 phalangeal scar를 형성하고 있음을 볼 수 있다(Fig. 3). 제 2 주 군(2 week PT)에서는 구부에서는 모든 내, 외유모세포가 소실되었고, 기저부에서는 외유모세포의 완전소실, 내유모세포는 퇴화하고 있음을 보여주고 있다. 중간부에서는 제 1 열과 제 2 열의 외유모세포가 대부분 소실되었고, 내유모세포는 입체섬모의 배열은 손상을 받았지만 내유모세포의 소실은 보이지 않았다. 첨부에서는 모든 유모세포가 존재하였다(Fig. 4). 제 4 주 군(4 week PT)에서는 첨부의 일부만을 제외하고는 모든 부위에서 내 외유모세포의 소실을 보여주고 있다. 첨부에서도 입체섬모의 배열은 변형되어 있음을 보여주고 있다(Fig. 5).
   정상 대조군 및 각 실험군에서 100 μm 길이의 와우 구역 내에 존재하는 유모세포의 수는 Table 1과 같다. 정상 대조군에서의 내유모세포의 수는 각 열의 외유모세포보다 적었고, 외유모세포의 열간의 차이는 없었다. 실험군에서의 유모세포의 수는 일부에서는 큰 변이를 보여주고 있지만, 평균값을 도식화하였을 때는 일정한 손상 형태를 보여주고 있다. Fig. 6은 실험동물에서 와우의 각 구역에 따라 시술 후의 생존기간에 따른 유모세포의 손상의 정도를 백분율화 하여 표시한 그래프이다. 유모세포는 첨부보다 구부로 갈수록 GM에 의해서 손상되는 정도가 심함을 알 수 있었다. 내유모세포는 모든 구역에서 시간에 따른 유모세포의 손실이 통계적으로 유의하게 나타났다(p<0.05). 외유모세포는 내유모세포에 비해서 쉽게 손상을 받는 것을 알 수 있고, 중간부와 첨부에서는 통계적으로 유의하게 시간에 따른 손상의 차이를 확인할 수 있었다(p<0.05).
   각 실험동물의 생존기간에 따라 주당 손상 받는 유모세포의 수를 백분율화 하였다(Fig. 7). GM에 의한 유모세포의 손상은 4주에 걸쳐 계속 일어나고 있고, 첫 1주 동안에는 구부, 기저부, 중간부의 외유모세포와 구부, 기저부의 내유모세포의 손상이 가장 크게 일어났고, 1주와 2주 사이에는 중간부와 첨부의 내유모세포와 첨부의 외유모세포의 손상이 첫 주에 비해서 심하게 일어났다.
   따라서 삼투펌프를 통해 1주간 약물을 주입하였을 때 와우내로 정확히 주입되었음을 알 수 있었다. GM에 의한 유모세포의 손상은 외유모세포에서 더욱 많이 일어났고, 구역에 따라서는 기저부 방향으로 손상의 정도가 증가하였다. 또한 이독성 약물의 투여가 끝난 이후에도 생존기간에 따라 이독성 반응이 지속되어 유모세포의 소실로 이어지는 것을 알 수 있었다.

고     찰

   약물에 의한 이독성 효과는 1940년대 aminoglycoside 계열의 항생제가 출현되면서 부각되기 시작되었다. 1960년대 초기부터 널리 사용되기 시작한 GM은 전정기능 뿐 아니라 와우에도 독성을 가지는 약제로 알려져 있다. GM 투여군의 10%에서 와우에 이독성 효과를 보였다는 보고도 있다.¹⁰⁾ 최근에는 GM의 이독성 효과를 이용하여 메니에르 질환의 치료에도 이용되고 있는 실정이다.
   이독성 약물에 대한 연구를 위해서는 연구 목적에 부합되는 동물 모델이 확립되어야 한다. 특히 약물의 투여방식의 차이에 따른 실험동물 모델은 각각의 장 단점을 가지고 있다. 이독성 약물의 투여 방식에는 전신적인 주입법과 국소적인 주입법으로 크게 나눌 수 있다. 국소적인 주입법은 중이강내로 주입하는 고실내(intratympanic) 주입법과 otic capsule내로 주입하는 내이(intraotic) 주입법으로 다시 세분할 수 있다.
   Ylikoski,³⁾ Wersall¹⁾과 Wright¹¹⁾ 등은 전신적인 주입방법을 이용하여 와우 유모세포의 손상을 확인하였다. 기니픽을 실험동물로 하여 80~100 mg/kg/day의 GM을 전신적으로 투여한 결과 와우의 기저부에서 8~10 mm 되는 지점의 외유모세포가 가장 초기에 손상을 받고, 시간이 지남에 따라 기저부와 첨부로 진행되어 나간다는 것을 확인하였다. 외유모세포 중에서도 우선 제 1 열의 외유모세포가 손상을 받고 제 3 열의 외유모세포가 가장 늦게 손상을 받았고, 손상의 정도는 투여 된 약제의 용량과 투여기간과 밀접한 관계를 보였다.³⁾ 또한 내유모세포는 외유모세포에 비해서 비교적 민감성이 약하여 손상의 정도가 가장 경하였다.
   그러나 전신적인 주입방법에는 몇 가지 문제점이 동반될 수 있다. 우선, 동반되는 부작용인 신장기능의 이상이 나타나면 약물의 혈중 농도가 높아지게 되어 이독성 효과가 일정하게 나오지 않을 수 있다. 또한 신장 기능의 이상이 발생하게 되면 장시간 실험동물을 살려두기 어렵게 되어, 오랜 시간에 걸친 실험에 적합한 모델이 되기 어렵다. 둘째는 약물의 주입시간과 실제 약물의 작용시간과의 시간 관계를 정확히 규명하기 어렵다. 셋째는 약물의 농도와 병변의 정도와의 관계를 정확히 입증하기가 어렵다.⁴⁾
   이러한 단점을 보완하기 위하여 약물의 국소투여 방법이 개발되어 직접 고실이나 와우내로 투여하는 법이 이용되고 있다.^4)5)7)12)13) 따라서 본 연구는 최근 개발된 삼투펌프를 이용하여 와우내로 약물을 전달하는 방법을 개발하고자 하였다.
   삼투펌프는 일정한 속도로 약물을 전달하는 기구로서 실험동물에서 널리 이용되어 왔다.⁸⁾¹³⁾ 삼투펌프는 본체 안에 전달하기 원하는 약제를 넣고, 본체의 온도가 체온과 비슷한 온도에 이르면 삼투압이 작용하면서 일정한 압력으로 약제가 들어있는 본체를 누르게 되어 일정한 속도의 용액이 흘러나오도록 고안된 장치이다. 약물이 전달되는 속도와 약물의 총량에 따라 다양한 모델의 삼투펌프가 이용될 수 있다.
   본 실험에서 사용한 삼투펌프(Alzet 2002)는 시간당 0.5 μl의 속도로 2주간 주입이 가능한 모델이다. 삼투펌프를 삽입한 직후부터 펌프가 정상적으로 작용하기 위해서는 시술 전에 4시간정도 37°C의 생리식염수에 담가두어야 한다. 친칠라의 내이의 외림프강의 총 용적이 보고된 바에 따라 27 μl⁴⁾라고 한다면 48시간이면 약물이 외림프강을 모두 치환할 수 있게 된다. 따라서 1주일간 삼투펌프를 유지하게 되면, 적어도 5일 동안은 비슷한 농도의 GM이 외림프강 내에 존재할 것이다. 따라서 GM의 농도와 이독성 효과의 비교가 가능하고, 시간에 따른 이독성 효과의 변화를 확인할 수 있다. 예비 실험을 통하여 총 0.05 mg의 GM을 투여하였을 때는 0.1 mg의 본 실험결과보다 유모세포의 손상이 적었다(date not shown).
   실험 대조군에서 확인한 바와 같이 삼투펌프를 삽입시 시행한 cochleostomy는 전혀 와우내 유모세포의 손상을 일으키지 않았다. 따라서 삼투펌프의 삽입은 안전한 시술임을 알 수 있었다. 실험군에서 보이는 유모세포은 외유모세포가 내유모세포보다 손상을 많이 받았고, 특히 외유모세포중 제 1 열이 손상을 가장 먼저 받았다. 구역별로도 첨부에 비해서 구부에서 손상을 먼저 받았다. 이는 이독성 약물을 전신투여 했을 때 나타나는 손상의 순서의 유사하였다.^1)3)11) 그러나 전신투여 시에 나타나는 신독성과 같은 부작용을 보이는 경우는 보이지 않았다.
   본 실험에서는 각 군 당 4마리의 실험동물을 사용하였고, 구역별로 100 μm의 길이내의 유모세포만을 확인하였으므로 완전한 정량적인 분석은 아니었다. 그러나 결과에서 볼 수 있듯이 내유모세포에서는 모든 구역에서 시간에 따른 유모세포의 소실의 정도가 유의하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 외유모세포에서는 중간부와 첨부에서 유모세포의 소실의 정도가 시간에 따라 유의하게 증가하였다. 그러나 구부와 기저부에서는 통계적 유의성을 보이지 않았는데, 이는 1주 군부터 이미 손상이 심하게 나타났기 때문이라고 생각한다. 따라서 삼투펌프에 의해서 일정량의 이독성 약물이 비교적 정확하게 들어가서 유모세포의 손상을 시간이 경과함에 따라 일으키는 것임을 알 수 있다.
   본 실험에서는 이독성 약물의 효과를 단순히 주사전자현미경상 소피판(cuticular plate)의 존재 유무만으로 판정하였다. 이는 본 실험의 결과에서 소실된 섬모세포의 수가 구역에 따라서는 표준편차가 크게 나타나는 원인이 될 수 있다. 주사전자현미경으로는 단순히 표면만을 확인하므로, 실제로 세포체의 손상을 반영하지 못하는 경우도 많다. Forge 등¹⁵⁾에 의하면 GM에 의한 이독성 손상의 경우 외유모세포의 소피판의 손상이 오기 전에 세포체 외벽의 손상이 오고, 주변 지지세포가 팽창하면서 소피판을 치환하게 된다고 하였다. 따라서 세포체의 손상이 이미 왔으나 소피판이 존재하는 세포들을 본 실험에서는 소실이 되지 않은 세포로 간주되었으나, 실제로는 완전히 손상받은 세포이므로 주사전자현미경 만을 이용한 실험에서는 이러한 오차를 감수해야 할 것이다. Fernandez-Cervilla 등¹⁶⁾과 Laurell과 Bagger-Sjoback¹⁷⁾ 등은 입체섬모의 이상에 따라 유모세포의 손상의 정도를 확인하고 분류하는 방법을 제시하였으나 본 실험에서는 이용하지 않았다. 따라서 본 연구는 일련의 이독성 과정이 끝난 후 phalangeal scar만이 존재하는 세포를 소실된 세포로 간주하여, 실제 손상 받은 세포와는 다소 차이가 있으나 이러한 방법은 각 군간에 소실된 유모세포의 수를 비교하기데 용이하였다.
   일주일간의 약물 주입 후에 유모세포의 소실이 계속적으로 나타나는 것은 두 가지로 설명될 수 있다. 첫째, 앞서 설명한 듯이 주사전자현미경 검사에 의한 오류이다. 입체섬모 및 소피판의 변화는 세포내의 퇴행이 상당히 진행된 후에야 나타나게 되므로, 각 군에서 세포가 실제로 퇴행이 많이 진행되었으나 소피판은 아직 유지되었을 세포가 많이 포함되었을 것이다.¹⁵⁾ 둘째, GM에 의하여 유모세포의 형태학적 이상이나 청력소실과 같은 기능적인 이상이 나타나기 전에 약물이 세포체내에 상당기간 존재하고 있다고 한다.¹⁴⁾ 약물이 세포내로 주입되는 시간, 세포내 반응 시간, 형태학적인 변화를 일으키는 시간이 각 구역별로 세포의 종류에 따라 차이를 보이므로 세포가 소실되는 시간의 차이를 나타날 것이다.
   본 연구를 통해서 삼투펌프가 와우내로 약물을 지속적으로 전달하는 적절한 기능을 할 수 있었고, GM의 국소투여를 통해서 이독성 약물모델을 만들 수 있었다. 이러한 모델을 통하여 이독성약물에 의한 유모세포 손상의 기전 및 예방조치, 손상 후 치료 및 재생기전에 대한 연구가 진행될 수 있을 것이다.

결     론

   삼투펌프를 이용한 이독성 약물의 전달방법을 통하여 와우 전장에 걸쳐서 전신 투여 시와 유사한 와우 유모세포의 일련의 손상형태를 유발할 수 있었다. 내이에서의 약물전달을 위한 삼투펌프의 이용은 시술에 의한 부작용 및 약물에 의한 합병증 없이 약물을 일정한 농도와 전달 속도로 특정기간 동안 전달할 수 있는 방법이다.

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