교신저자：나한조, 501-140 광주광역시 동구 서석동 588  조선대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   미국 내에서 천식환자는 대략 천만명 이상으로 추정되며 이중 약 5%에서 기관지 천식뿐 아니라 비용과 아스피린 및 이부프로펜(Ibuprofen)등과 같은 비스테로이드 항염증제에 과민성을 갖게 되는데,¹⁾ 이러한 삼징을 Samter씨 삼징이라고 부르며, 시간이 지나면서 점차 악화되어 치명적인 천식 발작을 초래할 수 있다.²⁾ 아직까지 발병기전이 명확하게 밝혀지지는 않았으나 leukotriene(이하 LT)같은 염증물질이 아스피린 과민성과 기관지 천식에 관여하여 이차적으로 증상발현에 기여하는 것으로 알려져 있다. 이 중 LTC4와 LTD4는 천식과 과민반응의 강력한 매개물질로 기관지 수축, 미세혈관 투과성 항진 그리고 관상동맥 수축 등을 일으키며,³⁾ LTC4의 분비 증가는 아스피린 감수성의 천식 환자에서 아스피린 유발검사 후 채취한 비세척액에서 볼 수 있다.⁴⁾ 아스피린은 아라키돈산 대사과정 중 cycloxygenase 경로를 차단해서 아라키돈산 대사를 lipoxygenase 경로로 우회시켜 LT생산의 증가를 초래한다.⁵⁾⁶⁾ 한편 Samter씨 삼징에서 호산구 증가증(eosinophilia)이 흔히 관찰되는데 이는 LT과 관련한 아스피린 감수성 기전에 관여할 것으로 추측되고 있다. 따라서 어떤 기전으로 호산구 증가증이 초래되느냐가 중요한데 최근 문헌에 의하면 호산구의 세포고사(apoptosis)가 천식환자의 호산구 증가증을 일으키는 중요한 기전으로 제시되고 있다.⁷⁾⁸⁾ Fas receptor(APO-1 or CD9⁵⁾는 tumor necrosis factor(TNF)/nerve growth factor(NGF) receptor superfamily에 속하는 경막성 당단백(transmembrane glycoprotein)으로, Fas와 Fas ligand(리간드) 결합이 세포고사에 관여하여 호산구를 포함한 다양한 세포의 세포고사를 일으킨다.⁸⁾ 따라서 호산구에서 Fas와 Fas 리간드 발현의 감소는 Samter씨 삼징의 호산구 증가증을 설명할 수 있을 것으로 제시되고 있으나, 이들 환자들에서 Fas와 Fas 리간드 발현의 감소에 대해서는 아직까지 확실히 알려진 바가 없다. 따라서 저자들은 비용형성과 아스피린 과민성에 관여하는 LT과 Fas/Fas-L의 역할을 규명하고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

실험재료
   아스피린과민성 비용(ASP)환자 16명(평균나이 32±14세, 남자 6명, 여자 10명), 비아스피린과민성 비용(NASP)환자 20명(평균나이 37±15세, 남자 11명, 여자 9명)을 대상으로 하였으며, 환자의 동의하에 부비동 내시경수술시 비용과 말초혈액을 동시에 채취하였다. 모든 ASP환자는 아스피린복용 후 심한 천식발작을 경험한 Samter씨 삼징환자였다. 비용은 술전 비내시경과 부비동 단층촬영으로 확진하였으며, 모든 환자는 적어도 3주 이상 전신적 스테로이드 투여를 중지하였다. 그러나 대부분의 ASP환자 경우는 국소적으로 비강 및 구강 흡입 스테로이드 투여경력이 있었다. Fas/Fas-L의 분석을 위한 정상 대조군으로 코 증상 및 기관지 천식병력이 없는 9명의 건강한 지원자(평균 나이 35±17세, 남자 6명, 여자 3명)의 말초혈액을 사용하였다.

비용조직
   채취된 비용을 페트리 접시(petri dish)에 놓고 비용조직을 멸균된 가위로 약 3×3 mm 정도 크기로 가늘게 자른 후 이를 동질화기(homogenizer)에 넣고 HBSS(Hank's balanced salt solution, Sigma, St. Louis, Mo.) 15 ml를 첨가하고 잘게 갈아 부수어 단일세포 부유액(single cell suspension)으로 만들었다. 이를 원심분리시켜 상층액은 버리고 비용세포들을 다시 phosphate buffered solution(PBS) 1 ml를 첨가한 후 재부유시켜 Neubauer improved bright-line hemocytometer(Superior Co., Germany) 아래서 세포수를 기록하였다. 비용세포가 포함된 이 1 ml 용액을 4등분한 후(각각 225μ씩) 4개의 6 ml 폴리스티렌 관에 나누어 담았다. 각각의 시험관에 4가지 농도의(0, 1, 5, 10 mg/ml) 아스피린(Bayer Co. Morristown, NJ)과 PBS를 동량이 되도록 넣은 후, 뚜껑을 약간 느슨하게 닫고 30분 동안 37°C의 배양기에 넣어 배양시켰다. 이후 이를 다시 원심분리하여 상층액을 표식된 cryovial에 담아 추후 LT측정을 위해 -70°C 냉동고에 저장하였다.

혈  액
   환자로부터 채취한 말초혈액 6 ml를 두개의 시험관에 나누어 담은 후 10배 정도의 PBS를 첨가하였다. 약 15분 정도 원심분리 후 적혈구 용해 완충액(RBC lysing buffer)을 사용하여 적혈구를 제거한 후 남은 백혈구세포 만을 1 ml PBS를 첨가하여 다시 부유시킨 후 세포수를 기록하고, 첫 번째 시험관내 백혈구는 비용조직세포와 같은 방법으로 아스피린을 투여하여 30분간 배양한 후 상층액 만을 얻어 -70°C 냉동고에 저장하였다. 두 번째 시험관의 백혈구는 호산구의 Fas/Fas-L 염색에 이용하였다.

효소 면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)
   아스피린에 노출된 세포들에 의한 LT 분비치는 Peptido-Leukotriene Enzyme Immunoassay Kit(Caymon Chemical Co., Ann Arbor, MI.)를 사용하여 측정하였다. 측정방법은 시약회사에서 제공한 지침서를 참고하였으며, 405 nm에서 plate 판독기(BT 2000 Microkinetics Plate Reader, Fish Biotech, Italy)로 읽어 광학밀도(optical density；OD405)값을 구하였다.

호산구 분리(Eosinophil purification)
   말초혈액에서의 호산구 분리⁸⁾는 Ficoll plaque 용액을 이용한 밀도구배 원침방법으로 단핵구와 혈소판을 먼저 분리하여 제거한 후, 호중구에 anti-CD16 단클론 항체 표지자를 붙이고, magnetic microbead(Macs Goat Anti-Mouse IgG Micorbeads, Milteny Biotec. Auburn, CA.)가 붙어있는 이차항체로 접합시킨 후, MACS(magnetic activated cell sorting) 분리관(Mileny Biotec, Auburn, CA)을 통과시키는 방법(negative selection)으로 CD16(＋) 세포(즉 호중구)와 CD16(-) 세포(즉 호산구)를 분리하였다. 분리된 호산구의 순도는 항상 95%이상이었고 tryphan blue로 확인된 생존 세포수는 90%이상이었다.

Fas와 Fas 리간드 수용체 발현
   CD16(-)cell과 CD16(＋) 세포들은 인혈청(human serum) 20 μl을 첨가하여 암실 얼음 속에 30분 동안 두어 억제시킨 후 CD16(-)와 CD16(＋)세포는 각각 2개의 6 ml 시험관에 똑같이 나누어 담아 총 4개의 시험관으로 나누었다. CD16(＋/-) control의 1차 항체는 biotin-conjugated mouse anti-human Ig G를, 2차 항체는 R-phycoerythrin conjugated mouse anti-human IgG를 사용하였으며, Fas/Fas ligand 염색은 1차 항체로는 biotin-conjugated mouse anti-human Fas ligand를 2차 항체로는 R-phycoerythrin conjugated mouse anti-human Fas(CD95)를 사용하였고 모두에서 streptavidin-FITC conjugate를 사용하여 대조 염색하였다. 사용한 시약은 특별한 언급이 없는 것은 모두 PharMingen사(San Diego, CA)의 제품을 사용하였다. CD16(-)와 CD16(＋) cell의 Fas/Fas 리간드 발현은 Flow cytometry(FACStar Plus, Becton Dickinson Co., Mountain view, CA)를 이용하여 염색된 세포수의 백분율로 표시하였다.

통계처리방법
   통계 분석을 위해서 기준 분비치(baseline release level)를 먼저 측정하고 여기에 각 농도의 아스피린을 투여한 후 LT분비치를 측정한 후, 이수치를 기준 분비치로 나누어 각각의 양적 변화율(volume change；%)을 구하였으며, Fas와 Fas 리간드 발현은 염색된 세포수의 백분율로 하였다. 각 실험결과는 평균±SEM으로 표시하였고 실험군들의 데이터들은 student t-test와 ANOVA 방법으로 p-value를 구하였으며 유의수준은 5% 이내로 하였다.

결     과

LT 기준 분비치
   말초혈액 백혈구에서 유리되는 LT 기준 분비치는 NASP군에서 393.3±87.4 pg/ml, ASP군에서는 499.1±78.4 pg/ml, 비용세포의 경우는 NASP군에서 425.5±105.4 pg/ml , ASP군에서 650.0±112.0 pg/ml으로 통계적으로 큰 차이가 없었다(p>0.05, Fig. 1).

말초혈액 백혈구에서 아스피린 농도증가에 따른 변화
   말초혈액 백혈구에서 아스피린 자극에 의한 LT분비는 두 군에서 모두 아스피린 농도 증가에 따라 증가하였으며, 이는 ASP군에서 더욱 현저하였으며, ASP군에서 10 mg/ml의 고농도를 제외하고 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 2).

비용세포에서 아스피린 농도 증가에 따른 변화
   비용세포의 경우 NASP군에서는 아스피린농도에 비례하여 LT분비가 약간 증가하였으나, ASP군에서는 오히려 약간 감소하는 경향을 보였다. 그러나 최고 농도를 제외하고는 통계적 의의는 없었다(Fig. 3).

Fas/Fas 리간드 발현양상
   호산구 즉 CD16(-)세포의 Fas발현은 NASP군(p<0.0001) 및 정상 대조군(p<0.05)에 비하여 ASP군에서 현저히 감소하였다. 그러나 정상 대조군과 NASP군 사이에서는 현저한 차이는 없었다(p>0.05). 호중구 즉 CD16(＋)세포의 Fas발현은 NASP군과 정상 대조군 보다 ASP군에서 더 적게 발현되었으나, 세 군간 통계적 의의는 없었다(p>0.05). Fas 리간드 발현의 경우 세 군 모두 유의성이 없었다(Figs. 4,5,6).

고     찰

   Samter씨 삼징환자에서 아스피린 과민성 발생기전은 현재까지도 명확하지는 않지만, 적어도 일부는 아라키돈산 대사장애와 관련이 있다고 알려졌다. 즉 아스피린이 cyclooxygenase를 억제하여, lipooxygenase 경로로 아라키돈산 대사를 이동시켜 LT생성을 증가시킴으로써 아스피린 과민 반응을 일으킨다는 것이 정설이다.³⁾ 그러나 아스피린 과민성 비용환자에서 LT의 생산 증가는 아스피린에 의한 것만은 아니다. 아스피린을 투여하지 않은 상태에서도 아스피린 과민성 환자의 경우 말초혈액 단핵구의 아라키돈산 대사율이 정상 대조군보다 높게 유지되어 있음을 알 수 있는데, 이는 이들 환자에서는 cyclooxygenase와 lipooxygenase 양쪽 경로를 통한 아라키돈산 대사율이 전반적으로 증가되어 있음을 의미한다.¹⁰⁾ 염증세포에서 LT분비 증가는 아스피린과민성 환자의 병태생리에 있어 중요한 역할을 한다.¹¹⁾ 비용과 호산구에서 아라키돈산 대사율을 비교해보면, 비용에서는 정상 비점막이나 만성염증성 부비동 점막보다 15-li-pooxygenase 활성이 30배 이상이며, 호산구가 많이 포함된 비용의 경우 호산구 없는 비용보다 15-lipooxygenase 활성이 7배 이상이다.¹²⁾ 따라서 호산구가 아스피린 과민성 기전에 관여할 수 있을 것으로 생각되지만, 아직도 명확히 밝혀져야 할 점이 많다. 저자들의 연구 결과 아스피린 과민성 비용환자 군이 비아스피린 과민성 비용환자 군보다, 아스피린 농도를 증가시킴에 따라 LT의 분비가 훨씬 더 증가하는 것을 관찰하였다. 그 이유는 잘 알 수 없으나 Mewes등¹⁰⁾은 아스피린 감수성 환자의 백혈구는 LT분비에 대한 감수성이 증가되어 있어서 아스피린 첨가와 같은 비특이적 자극에 노출시 LT분비가 증가할 것이라고 하였다. 본 실험결과 혈액에서 아스피린 자극에 의한 LT분비는 두 군에서 모두 아스피린 농도증가에 따라 증가하였으며, 아스피린 과민성 비용환자 군에서 더욱 현저하여 두 연구결과와 일치하여 이런 가설이 타당함을 보여주었다. 그러나 이런 증가경향은 비용세포의 경우 혈액의 경우와 반드시 일치되지는 않았다. 즉 NASP군에서는 아스피린농도에 비례하여 LT분비가 약간 증가하였으나, ASP군에서는 증가하지 않고 오히려 약간 감소하는 경향을 보였다. 그러나 이런 경향은 최고 농도를 제외하고는 통계적 의의는 없었다. 이러한 실험결과로 몇 가지 가설을 유추해 볼 수 있다. 첫째, 아스피린에 노출시 말초혈액에서 비용조직에 미치는 영향은 약간의 시차가 있어야할 것으로 사료되나 본 실험은 그 전에 마쳤으므로 미처 농도증가가 잘 일어나지 않았을 수도 있겠으며 둘째, ASP환자 비용의 경우 잘 모르는 어떤 인자가 작용하여 LT분비가 억제되거나 분비가 일어나지 않았을 것, 셋째, 아스피린에 의한 비용내 섬유세포나 그 밖의 세포에 대한 성장 억제작용에 의한 효과¹³⁾에 의해서 LT분비가 감소되었을 것 등이다. 만약 세 번째 가설 즉 아스피린에 의한 비용세포성장억제 및 LT분비감소효과가 저농도에서 고농도로 갈수록 현저하다면 실제로(in vivo) 아스피린 탈감작이나 비용종의 국소치료제로서의 이용 가능성¹⁴⁾을 시사한다고 하겠다.
   LT분비에 어떤 세포가 관여하는지는 확실치 않다. Fisher등¹⁵⁾은 아스피린 과민성 천식환자에서 아스피린 유발검사시 비세척액 내 tryptase, histamine, cysteinyl leukotriene 수치가 증가하였다고 하였다. Tryptase는 비만세포에 대해 특이적이며, 이 효소는 아스피린에 반응하여 비만세포가 활성화될 때 증가한다. 따라서 비만세포가 LT분비에 관여하리라 생각되며 그 밖의 세포에 관하여는 현재까지도 잘 알려지지 않았다. 그러나 Samter씨 삼징 환자의 경우 호산구 증다증을 보이며 비즙내에서 호산구가 현저히 증가되는 것을 자주 관찰할 수 있는 것으로 보아 아스피린 과민성 환자의 비용발생에 호산구가 어떤 역할을 하리라 짐작할 수 있겠다. Samter씨 삼징 환자의 경우 호흡기 점막에서의 여러 가지 복잡한 일련의 과정에 의해 상기도 및 하기도 호흡기 질환이 동반된다. 즉 비만세포의 활성화, 호산구 증다증, 만성 염증 매개물질의 생산 등이 일어나며 아스피린 복용시 더욱 악화된다.¹⁶⁾ 이와 같은 기전은 비아스피린 과민성 비용환자의 경우는 다를 것으로 여겨진다.
   호산구는 알레르기 반응에 관여하는 강력한 염증세포이다. 여러 가지 병적, 생리적 조건하에서 호산구가 축적된다는 사실에 대해서는 상당히 규명되었으나, 호산구의 분해(resolution) 조절기전은 거의 알려져 있지 않다. 최근 연구^17-19)에 의하면 호산구의 세포고사가 지연되면서 만성 호산구 감염에서 이들 세포가 축적된다고 한다. 어떤 과정을 거쳐 호산구가 기도에서 제거되는지는 확실치 않다. 호산구가 생체내(in vivo)나 시험관내(in vitro)에서 제거되는데는 세포죽음의 과정인 세포고사(apoptosis) 과정을 필히 거쳐야 한다. Wolldey¹⁹⁾등은 호산구의 세포고사는 천식에서 호산구성 염증반응 완화를 촉진시킨다고 하였으며 이를 응용한 새로운 약제 개발을 제시하였다. 저자들의 연구결과 호산구의 Fas 발현 정도에 있어서 아스피린 과민성 비용환자가 정상인이나 비아스피린 과민성 비용환자보다 훨씬 더 낮다는 것을 알게 되었다. 이러한 사실은 호산구 죽음 조절기전이 아스피린과민성 비용환자의 경우는 덜 효율적이어서 결국 호산구증다증을 일으키며, 더 나아가서는 이러한 지속적이고 만성적인 호산구 환경에 의해 비용이 발생될 것으로 생각되었다. Fas 수용체 발현의 감소가 아스피린 과민성 비용환자에서 자주 관찰되는 호산구 증다증 기전의 일부는 설명할 수 있을 것으로 생각되나, 아스피린 과민성 기전에 관해서는 아직도 많은 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 판단된다.

결     론

   아스피린 과민성 비용과 비아스피린 과민성 비용환자에서 비용 발생에 관여하리라 생각되는 LT분비양상과 Fas/Fas-L의 발현양상을 관찰한 결과 두 군 환자에서 LT 분비와 Fas/Fas-L발현 양상의 차이점을 발견하였고, Fas수용체 발현이 감소되거나 Fas/Fas-L의 상호 작용의 결함이 아스피린 감수성과 상관없이 비용의 병인에 중요한 역할을 하리라 사료되었다.

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