교신저자：박용수, 403-720 인천광역시 부평구 부평동 665 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
                  전화：(032) 510-5674 · 전송：(032) 510-5674 · E-mail：parkent@olmh.cuk.ac.kr

서     론

   삼출성 중이염은 유소아에게 생기는 가장 흔한 염증성 질환으로 항생제 치료에도 불구하고 청각 장애, 언어발달 장애와 중이에 영구적 손상과 점막 변화를 남길 수 있는 질환이다. 삼출성 중이염의 원인이나 발생기전은 아직 완전히 규명되지 않은 상태로 이관의 기능 폐쇄로 인한 중이강의 환기 장애, 알레르기, 국소 염증 반응, 세균 감염 등이 있다.
   최근에는 그 발생 기전과 관련하여 면역반응과 cytokine에 대한 연구가 많이 진행되고 있으나 명확히 밝혀지지는 않았고 삼출성 중이염의 중이 저류액에서의 cytokine 검출에 대한 연구는 많으나, cytokine으로 유발한 삼출성 중이염과 그 중이 점막에 대한 병리조직학적 연구는 찾아보기 어렵다.
   현재까지 삼출성 중이염의 삼출액에서 검출된 cytokine으로는 interleukin 1, 2, 4, 6, 7, 8과 TNF(tumor necrosis factor)-α, interferon-γ, PAF(platelet activating factor) 등이 밝혀져왔다.^1-5) 
   이중 IL-2는 활성화된 T 세포에서 분비되어 T 세포에 작용하여 그들의 분화와 세포 면역 반응에 관계되는 cytokine의 생산을 유도하는 중요한 염증 매개체이다. 또한 IL-2는 사람의 삼출성 중이염의 삼출액에서 유의하게 증가하므로^6-8) 이 질환의 발생기전에 관여할 것으로 보인다.
   이에 저자들은 IL-2를 이용, 흰쥐에서 삼출성 중이염을 유발하여 삼출액의 발생과 중이 점막을 병리조직학적으로 관찰하고, IL-2 차단제인 anti-IL-2가 IL-2의 삼출성 중이염 유도를 억제할 수 있는지를 밝히고자 하였다.

재료 및 방법

재  료

실험 동물과 실험군
   동일한 조건하에서 사육한 체중 150~200 g의 건강한 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 사용하였으며, 이경 검사로 정상 고막과 중이내 삼출액이 없음을 확인하였다.
   정상 대조군은 2마리(4귀)로 IL-2의 용매로 사용된 PBS(phosphate buffered saline) 10 μl를 투여하였다. 차단제 투여 대조군은 2마리(4귀)로 anti-IL-2(0.1 μg)를 투여하였다. 실험군중 제 1 군은 IL-2를 0.01 μg, 제 2 군은 IL-2를 0.1 μg를 각 4마리(8귀)에 투여하였고, 제 3 군인 차단제 투여군은 anti-IL-2 0.1 μg를 투여 직후, IL-2(0.1 μg)를 4마리(8귀)에 투여하였다.

Cytokine
   IL-2(Biosource, Camarillo, CA, U.S.A.)는 순도 95% 이상이며, E. coli에서 생산한 recombinant human interleukin 2로 농도는 7.616×10⁶ units/mg이었으며, anti-IL-2(Biosource, Camarillo, CA, U.S.A.)는 순도 95% 이상인 mouse(monoclonal) anti-human interleukin 2를 사용하였다.

방  법

약제 투여
   케타라(ketamine hydrochloride, 유한양행) 30 mg/kg과 럼푼(xylazine, Bayer) 6 mg/kg을 근육주사하여 전신 마취시킨 후 수술용 현미경하에서 micropipette으로 고막천자를 하여 중이강에 투여하였다.
   Anti-IL-2 투여군은 anti-IL-2 0.1 μg를 중이강에 투여한 직후, IL-2를 0.1 μg 같은 방법으로 투여하였다.

조직 채취 및 표본 제작
   IL-2를 흰쥐의 중이강에 투여한지 24시간 후에 흰쥐를 전신마취시킨 후 수술용 현미경하에서 micropipette을 이용, 삼출액을 흡인하여 확인하였다.
   헤파린이 섞인 식염수 100 ml와 0.1 M PBS 완충 용액을 이용하여 pH 7.4로 맞춘 4% paraformaldehyde(Sigma, St. Louis, MI, U.S.A.)로 심장관류 고정을 하고 즉시 두부를 절취하여 양측 측두골을 적출 하였다. 그후 4% paraformaldehyde 용액에 담가 24시간 추가로 고정한 후, 0.1 M EDTA 용액(Sigma)에서 약 4~5주간 탈회시켰다. 그후 파라핀에 포매한 후 조직을 5 μm의 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켜 Hematoxylin-Eosin으로 염색하였다.

병리조직학적 검사

염증세포의 침윤정도
   각 조직절편에서 중이 갑각을 덮고있는 점막을 400배 시야에서 관찰하여 측정하였다. 2.5×2.5 μm² 크기의 격자를 상피 기저막에 맞추고 격자 안에 있는 세포 수를 세었다. 격자 선에 세포가 걸쳐진 경우에는 상측과 좌측 선에 걸린 것은 포함하였고 하측과 우측 선에 걸린 것은 제외하였다. 각 개체의 염증세포 수는 10개의 조직절편에서 측정한 수치의 평균으로 하였고, 각 군의 평균 염증세포 수는 8귀 수치의 평균으로 하였다.

상피하층의 두께 측정
   각 조직절편에서 중이 갑각을 덮고있는 점막 중 가장 두꺼운 부분의 두께를 400배 시야에서 측정하였다. 각 개체의 상피하층 평균 두께는 10개의 조직절편에서 측정한 수치의 평균으로 하였고, 각 군의 상피하층 평균 두께는 8귀 수치의 평균으로 하였다.

통계학적 검증
   각 대상군의 통계학적 분석 방법은 paired t-test에서 유의수준은 5%로 하였다.

결     과

중이 삼출액의 발생
   IL-2를 투여한지 24시간 후, 제 1 군에서는 8귀 중 6귀(75%), 제 2군에서는 8귀 중 7귀(88%)에서 삼출액이 관찰되었다. 정상대조군이나 anti-IL-2만을 투여한 대조군에서는 삼출액이 발생하지 않았다. Anti-IL-2를 전처치한 후, IL-2를 투여한 군에서는 8귀 중 1귀(13%)만이 삼출액이 관찰되었다.

중이 점막의 광학 현미경 소견

염증세포의 침윤정도
   IL-2를 0.01 μg 투여한 제 1 군에서 24시간 후 침윤된 염증세포는 14.13±3.81개 / 격자(2.5×2.5 μm²)였고, IL-2를 0.1 μg 투여한 제 2 군에서는 19.99±4.24개 / 격자로, 정상대조군의 8.10±3.11개 / 격자보다 유의하게 증가되었다(p<0.05) Anti-IL-2로 전처치 후 IL-2를 투여한 군에서 침윤된 염증세포는 8.25±3.24개 / 격자였고 이는 정상대조군과 유의한 차이가 없었다(p>0.05)(Table 1, Figs. 1, 2 and 3).

상피하층 두께의 측정
   IL-2를 투여한 제 1 군과 제 2 군에서는 대조군과 비교하여 두께가 유의하게 증가하였고(p<0.05), anti-IL-2를 전처치한 후 IL-2를 투여한 제 3 군에서는 대조군과 유의한 차이가 없었다(p>0.05)((Table 2, Figs. 1, 2 and 3).

고     찰

   삼출성 중이염의 원인과 기전은 완전히 알려져 있지 않으며 그 가설에는 이관 장애에 의한 중이내 환기 이상, 알레르기 반응, 병원균과 연관된 국소 면역 기능 장애 등이 있다.
   삼출성 중이염의 삼출액 내에는 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 하는 많은 염증 매개체가 있다.⁹⁾ 삼출성 중이염에서 염증 반응의 지속에 면역 복합체가 중요한 역할을 하고¹⁰⁾ prostaglandin과 leukotriene, 여러 효소와 면역 글로불린 등이 중이 저류액에서 증명되었다.¹¹⁾ Cytokine은 대식세포, 임파구, 중성구, 섬유모세포 등에서 내독소나 바이러스 등의 자극에 의해 분비되는 강력한 당단백으로 염증 반응의 조절과 생체 면역 반응을 조절하는 역할을 담당한다.³⁾⁴⁾ 사람의 삼출액에서 발견되는 cytokine으로는 interleukin 1, 2, 4, 6, 7, 8과 TNF(tumor necrosis factor)-α, interferon-γ, PAF(platelet activating factor) 등이 있다.^1-5)
   그러나, 삼출성 저류액에서 cytokine의 검출과 정량 방법이 다르고, 사람에 대한 cytokine과 중이 점막에 대한 병리조직학적 연구는 매우 어려워 동물 모델에 의한 연구가 많이 시행되고 있으며, 쥐의 중이 점막은 사람의 것과 아주 유사하기 때문에 사람의 중이염 연구의 모델로 사용하기에 적절하다.¹²⁾
   IL-2는 주로 활성화된 T 임파구에서 분비되어 T 세포에 작용, 이의 분화와 증식에 관여하며 또 다른 cytokine의 분비를 촉진한다. 또한 세포 상해성 T 세포(cytolytic T-cell) 또는 LAK(lymphokine-activated killer) 세포를 생성하기도 하는 등 면역, 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.¹³⁾
   실험동물에서 삼출성 중이염을 일으키는 방법은 이관폐쇄, 내독소의 중이강 내 투여, 면역 반응에 의한 것 등이 있으며,⁹⁾ cytokine을 이용하여 중이강내 투여로 삼출성 중이염을 유발하는 방법도 그 중 한 방법이다. Cytokine을 이용한 보고는 TNF, IL-1과 IL-2를 guinea pig의 중이에 고막 천자를 통해서 투여하여 삼출성 중이염이 유발됨을 확인한 경우,¹³⁾ 혈소판 활성 인자로 chinchilla에서 삼출성 중이염을 유도한 경우¹⁴⁾와 interleukin 8을 이용하여 휜쥐에서 중이 염증을 유도한 경우가¹⁵⁾ 있으며, 국내에는 cytokine, 특히 IL-2를 중이강에 투여하여 삼출성 중이염의 유발을 보고한 문헌은 없다.
   IL-2를 guinea pig의 중이강내 투여한 실험에서의 시간에 따른 분석에서는 IL-2투여시 cellular response가 가장 큰 시간은 24시간이었고, 72시간이 지나면 cellular response가 감소되고 자연 소실되는 결과를 보였다.¹³⁾ Rat에서는 guniea pig의 일련의 염증 반응과 차이가 있을 수 있기 때문에, rat에서의 염증 반응의 경과에 대한 연구가 보충되어야겠지만, 본 실험은 삼출성 중이염의 유발과 차단에 중점을 두어, 그 결과를 토대로 분석시간을 설정하였고 IL-2의 투여 농도도 그 논문을 참조하였다.
   혈소판 활성 인자를 건강한 chinchilla에 투여하여 삼출성 중이염을 유도하고, 차단제로 이를 차단한 연구가¹⁴⁾ 있었으나, 본 연구와 같이 사람과 중이 점막이 매우 유사한 흰쥐를 모델로 중이강내 IL-2를 투여하여 삼출성 중이염 발생과 함께 중이점막의 병리조직학적 검사를 시행하고, IL-2 antagonist를 투여, 삼출성 중이염 발생을 억제한 연구는 없었다.
   본 실험의 anti-IL-2는 receptor blocker로 binding inhibition을 하므로, anti IL-2와 IL-2가 서로 직접 binding하여 중화되는 것이 아니고, receptor binding blocker로서 IL-2에 의한 염증반응을 유의하게 차단하였다고 볼 수 있다. 또한 anti-IL-2는 동종 이식반응(allograft reaction)이나 graft versus host 반응, 그리고 일부 면역 질환이나 암에도 적용가능성이 높은 것으로 보고되고 있다.¹⁶⁾ 그러나 IL-2는 다양한 serum inhibitor에 의해 억제되며,¹⁷⁾ 인간과 rat 또는 다른 동물에서도 특이적인 inhibitor가 없는 것으로 알려져,¹⁸⁾ 다른 물질에 의해서도 본 실험과 같은 차단효과가 가능 할 수 있어, 또 다른 연구가 필요할 것으로 사료된다.
   중이점막의 면역 체계는 IgA에 의한 체액성 기전과, T cell과 B cell의 세포 면역 반응이 관계되어 있다.¹⁹⁾ 중이점막은 감염시 중이의 방어 체계에서 첫 번째로 중요하며, 이들 방어 체계는 상피 세포층의 점막 섬모 체계와 상피하층(subepithelial space)으로 구성되며, 중이염시 병리적 변화를 갖는다.²⁰⁾ 삼출성 중이염의 경우, 중이 점막은 상피하층의 부종과 염증 세포의 침윤, 그리고 모세혈관의 투과성 증가가 특징적으로 관찰되며, 이는 분비선의 증식과 상피내, 상피하 분비선의 형성을 특징으로 하는 만성 중이염과 구별된다.²⁰⁾
   본 실험은 IL-2를 이용하여, 삼출성 중이염을 실험적으로 유발시킬 수 있었으며, 이때 중이점막은 국소 염증반응에 의해 급성 염증세포의 침윤, 특히 다핵구의 침윤이 증가되었으며, 상피하층의 부종으로 인한 점막 두께의 증가가 관찰되었다. 사람의 삼출성 중이염에서 IL-2가 장액성보다 점액성 삼출액에서 고농도로 검출되어 오래 진행된 점액성 중이염에서 더 중요한 역할을 할것이라는 보고가 있지만 본 실험에서 유도된 중이염에서는 삼출액은 모두 장액성이었고, 중이 점막의 소견도 급성 염증 반응에 해당되었다. 따라서 만성, 점액성 삼출성 중이염에서의 연구가 추가적으로 필요할 것이다.
   본 실험에서 anti-IL-2는 IL-2에 의한 삼출성 중이염의 발생을 억제하였다.
   그러나, anti-IL-2의 중이 삼출액 생성 차단에 대한 효과를 궁극적으로 판단하기 위해서는 IL-2로 유도한 것이 아닌, 세균이나 내독소, 알레르겐, 이관 폐쇄 등으로 유발한 중이염과 만성 삼출성 중이염에서 anti-IL-2의 효과를 판정하는 것이 필요하리라 생각된다.

결     론

   이상의 결과에서 저자들은 IL-2로 흰쥐에서 삼출성 중이염을 실험적으로 유도하여, IL-2는 삼출성 중이염 발생에 중요한 역할을 하는 cytokine임을 확인하였고, IL-2의 삼출성 중이염 유도를 그것의 antagonist로 차단하여, 삼출성 중이염 발생이 억제됨을 확인함으로써, 추후 다른 방법으로 유도된 삼출성 중이염의 차단이 보완된다면, 사람의 삼출성 중이염의 치료에 임상적인 적용을 시도할 수 있으리라 여겨진다.

1. Ophir D, Hahn T, Schattner A, Wallach D, Aviel A. Tumor necrosis factor in middle ear effusions. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1988;114:1256-8.

2. Maxwell K, Leonard G, Kreutzer DL. Cytokine expression in otitis media with effusion. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1997;123:984-8.

3. Yellon RF, Leonard G, Marucha P, Sidman J, Carpenter R, Burleson J, et al. Demonstration of interleukin 6 in middle ear effusions. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1992;118:745-8.

4. Juhn SK, Tolan CT, Garvis WJ, Cross DS, Giebink GS. The levels of IL-1 beta in human middle ear effusions. Acta Otolaryngol Suppl (Stockh) 1992 ;493:37-42.

5. Himi T, Suzuki T, Kodama H, Takezawa H, Kataura A. Immunologic characteristics of cytokines in otitis media with effusion. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 1992;157:21-5.

6. Yellon RF, Leonard G, Marucha PT, Craven R, Carpenter RJ, Lehmann WB, et al. Characterization of cytokines present in middle ear effusions. Laryngoscope 1991;101:165-9.

7. Bikhazi P, Ryan AF. Expression of immunoregulatory cytokines during acute and chronic middle ear immune response. Laryngoscope 1995;105:629-34.

8. Gloddek B, Lamm K, Haslov K. Influence of middle ear immune response on the immunological state and function of the inner ear. Laryngoscope 1992;102:177-81.

9. Nakata J, Suzuki M, Kawauchi H, Mogi G. Experimental otitis media with effusion induced by middle ear effusion. Laryngoscope 1992;102:1037-42.

10. Yamanaka N, Somekawa Y, Suzuki T, Kataura A. Immunologic and cytologic studies in otitis media with effusion. Acta Otolaryngol (Stockh) 1987;104:481-6.

11. Jung TTK. Arachidonic acid metabolites in otitis media pathogenesis. Ann Otol Rhinol Laryngol 1988;97:14-8.

12. Albiin N, Hellstrom S, Stenfors LE, Cerne A. Middle ear mucosa in rats and humans. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 1986;126:2-15.

13. Catanzaro A, Ryan AF, Batcher S, Wasserman SI. The response to human rIL-1, rIL-2, and rTNF in the middle ear of guinea pigs. Laryngoscope 1991;101:271-5.

14. Rhee CK, Jung TTK, Miller S, Weeks D. Experimental otitis media with effusion induced by platelet activating factor. Ann Otol Rhinol Laryngol 1993;102:600-5.

15. Johnson M, Leonard G, Kreutzer DL. Murine model of interleukin-8 induced otitis media. Laryngoscope 1997;107:1405-8.

16. Waldman TA. The IL-2/IL-2 receptor system: A target for rational immune intervention. Trend in Pharmacologic Sciences 1993;14:159-664.

17. Kucharz EJ, Goodwin JS. Serum inhibitors of interleukin-2. Life Sciences 1988;42:1485-91.

18. Friemel H, Wolf V, Werner H, Plantikow A, Ulmer AJ, Musehold J. The socalled interleukin-2 inhibitory activity of human serum is largely cytoxic to mouse cells. Imun letters 1990;26:259-64.

19. Bernstein JM, Tsutsumi H, Ogra PL. The middle ear mucosal immune system in otitis media with effusion. Am J Otolaryngol 1985;6:162-8.

20. Paparella MM, Sipila P, Juhn SK, Jung TT. Subepithelial space in otitis media. Laryngoscope 1985;95:414-20.