서     론

   내이의 항상성(homeostasis)유지에 영향을 주는 요인들 중에서 와우혈류량의 변화는 중요한 인자로 알려져 있고 다양한 내이 질환의 원인으로 생각되고 있다.
   소음에 노출된 동물에서 angiotensin이 증가하면서 와우혈류량이 감소하며,¹⁾ 메니에르병의 원인으로도 와우혈류량의 이상이 중요한 작용을 한다고 알려져 있다.²⁾ 또한 와우혈류량의 감소가 노인성난청, 돌발성난청 등의 원인으로 연구되면서 내이혈류량의 조절이 치료의 일부로 인식되고 있다.
   이를 바탕으로 급만성 중이염과 관련된 감각신경성 난청에서도 중이염과 연관된 와우혈류량의 변화를 난청의 병인으로서 가정해 볼 수 있다. 삼출성 중이염의 병력을 가진 환자의 35.8%에서 여러 정도의 감각신경성 난청이 발생하며,³⁾ 이는 염증매개체가 정원창으로 투과하여 내이로 침투되어 일어난다. 감각신경성 난청은 급성중이염에서 속발할 수 있으며 중이염의 병력이 있는 환자에서 고주파 난청이 유의하게 많은데, 이러한 난청의 기전으로는 독소나 염증매개체들이 정원창막을 통하여 내이로 들어가 직접 유모세포를 손상시킬 수 있지만⁴⁾ 한편으로는 와우혈류량을 감소시킴으로써 간접적인 손상을 줄 가능성도 생각해 볼 수 있다.
   혈소판활성인자(platelet activating factor, 이하 PAF)는 강력한 염증의 매개체로서 미세혈관 손상에 의한 허혈에 관여한다. PAF의 조직에 대한 허혈 손상 작용은 크게 직접적 허혈의 유발과 허혈에 의한 조직반응에서의 간접적 역할로 나눌 수 있다. 전자는 PAF에 의하여 혈관저항 증가와 미세혈관 손상이 유발될 뿐만 아니라 동맥의 수축으로 조직 허혈이 생기는 것을 말하고, 후자는 PAF에 의한 유리기(free radical)의 생성과 관련이 있다. PAF는 중이삼출액에서 보고에 따라 0.44 ng/ml에서 31.5 μg/ml까지의 넓은 범위의 농도로 분포하며⁵⁾⁶⁾ 급성 중이염이나 만성화농성 중이염에서는 중이삼출액에서보다 높은 농도로 존재한다고 알려져 있다.⁷⁾
   PAF에 관한 이과적 질환의 연구는 주로 중이와 이관에서 삼출성 중이염의 병인에 관해서 알려져 있지만, 내이 질환의 병인으로서의 연구는 많지 않다. 정원창막으로 투여한 PAF에 의해 청력의 저하와 와우유모세포의 손상이 초래된다고 하였고,⁸⁾ PAF를 전신적으로 투여하였을 때도 청력의 변화와⁹⁾ 내이의 형태학적인 변화를 관찰할 수 있었다.¹⁰⁾ 그러나 PAF의 내이투여에 의한 와우혈류량의 변화에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없으며, PAF가 내이혈류량에 미치는 영향을 규명하는 것은 중이염에 속발할 수 있는 내이질환의 한가지 원인을 규명하고 또한 예방 및 치료를 할 수 있는 근거를 마련한다는 점에서 의미가 있다.
   본 연구의 목적은 중이염의 삼출액에서 발견되는 PAF의 와우혈류량에 대한 영향을 규명하는 것으로 PAF를 정원창막에 투여하여 이에 따른 와우혈류량의 변화를 관찰하였다.

재료 및 방법

실험동물의 준비
   Preyer reflex 양성을 보이며 정상 고막소견을 보이는 체중 500 gm 이상의 알비노 기니픽을 사용하였다. 전신마취를 위하여 ketamine 40 mg/kg과 xylazine 2 mg/kg을 근육주사하고 기도의 분비물을 줄이기 위해서 atropine 0.1 mg/kg을 근육주사하였다. 마취의 유지를 위하여 ketamine과 xylazine은 실험중 1시간마다 초기 주사량의 반을 주었다. 복측위(ventral position)에서 기관을 노출한 후에 16G 혈관 카테터를 이용하여 삽관하였고, 소동물용 인공호흡기(KN-55, Naiume Co. Japan)를 이용하여 일회 호흡량(tidal volume) 7~8 ml, 분당 60~80회로 호흡하도록 하였다. 혈압과 맥박수를 측정하기 위하여 24G 혈관 카테터를 이용하여 좌측 경동맥에 삽관을 하여 심장과 수평위에 위치한 혈압측정기(Spectramed p23XL, Statham)에 연결하였다. 체온은 체온계(Toshiba, ME-157B)를 동물의 항문에 삽입하여 직장온도를 측정하며 보온담요를 이용하여 37±1°C로 유지시켰다. 동물을 배측(dorsal position)으로 돌려서 미세조작기(micromanipulator)가 부착된 소동물용 고정기(custom-made)에 고정하였다. 우측 이개 후부를 따라 피부절개를 한 후 수술현미경하에서 우측 외이도와 중이골포(bulla)를 노출시켰으며 드릴을 이용하여 와우와 정원창막을 노출시켰다(Fig. 1).

와우혈류량과 전신혈압의 측정

   와우의 점막혈류에 의한 영향을 없애기 위하여 작은 솜을 이용하여 와우 기저부의 점막을 벗겨내었다. 미세조작기를 이용하여 소식자(probe)를 와우의 기저부에 대고 젤리를 소식자와 와우 사이에 발라서 액체가 고이지 않으면서 전도가 잘 되게 하였다. 와우혈류량은 laser doppler flowmeter(BLF21 flowmeters, Transonic system Inc, USA, 이하 LDF)와 지름 0.8 mm짜리 소식자를 이용하여 측정하였다. 와우혈류량과 동시에 혈압과 맥박의 변화를 physiograph(Gould 5900 signal conditioner, TA11 monitor, Gould Inc., Oxnard, CA)를 이용하여 기록하였다.

   와우혈류량과 혈압을 측정하여 와우 혈관의 vascular conductance(VC)로 계산하여 결과를 분석하였다. VC는 그 순간의 측정된 와우혈류량(tissue perfusion unit, TPU)을 평균혈압(mean blood pressure, MBP)으로 나눈 후 100을 곱한 값이다(TPU/MBP×100).¹¹⁾

PAF 및 GBE 투여 후의 측정

   대조군으로 9마리의 동물에서 음성 대조군인 생리식염수를 작은 절편의 Gelfoam^®(Upjohn, USA)에 5 μl를 점적한 후 정원창막에 올려놓은 후 30분 동안 시간 경과에 따른 와우혈류량을 연속적으로 측정하였다. 그 후 양성 대조군으로서 와우혈류량의 감소를 일으킨다고 알려진¹²⁾ 에피네프린(0.1%) 5 μl를 같은 방법으로 투여하고 30분간 관찰하였다(N＝9). PAF를 투여한 후의 내이 혈류량의 변화는 17마리에서 안정된 상태에서 측정을 할 수 있었다. 10 μg/ml(N＝8)와 200 μg/ml(N＝9)의 PAF(Calbiochem biomedicals, USA) 5 μl를 같은 방법으로 Gelfoam에 점적하여 정원창막에 올려놓은 후 60분 동안 시간 경과에 따른 와우혈류량을 측정하였다.

분석 및 통계처리

   와우혈류량의 변화는 최초의 측정치를 0으로 정하고 시간에 따른 상대적 변화로 계산하였으며 최초 20분까지는 1분 간격으로, 그 이후는 5분 간격으로 그래프에 표시하였다. 안정된 상태의 혈류량을 얻기 위해 실험동물의 혈압이 40~100 mmHg일 때의 값을 분석에 사용하였다.
   결과는 평균±표준편차로 표시하였고 통계 프로그램으로는 SAS^®(Ver. 6.11, SAS Institute, USA)를 이용하였다. 각 동물에서의 시간에 따른 와우혈류량의 변화는 비모수 검정방법인 Wilcoxon Rank Sum test를 사용하였고 PAF실험군에서 농도에 따른 비교는 repeated measurements of ANOVA를 사용하였다. 실험의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.

결     과

대조군에서의 시간에 따른 변화

   음성 대조군으로 생리식염수를 정원창막에 투여하였을 때 30분 동안 시간에 따른 와우혈류량의 변화는 각 시간에서의 통계적 검정에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 양성 대조군으로 에피네프린을 정원창막에 투여하였을 때에는 1분 후부터 와우혈류량이 유의하게 감소하기 시작하였으며 11분 후에 최저치를 기록하고(△VC＝­3.2) 서서히 증가하여 30분 후에는 기준치보다 약간 낮은 값(VC＝­0.6)으로 회복이 되었다(Fig. 2).

PAF를 투여한 군에서의 시간에 따른 변화(Fig. 3)
   PAF 10 μg/ml를 정원창막에 투여하였을 때 2분 후부터 와우혈류량은 증가하기 시작하여 6분부터 15분 사이에서 유의하게 증가하였다. 그 후 감소하여 60분 후에는 기준치 보다 낮은 값을 기록하였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. PAF 200 μg/ml를 정원창막에 투여하였을 때 와우혈류량은 약 10분 후부터 감소하기 시작하여 40분 후까지 감소하다가 증가하였으나 60분 후에도 기준치보다 낮은 값을 보였다. 이 중 15분 후와 20분 후의 변화가 유의하였으며, 이 근방의 변화들도 전반적으로 비슷하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. PAF 10 μg/ml와 200 μg/ml를 투여한 경우의 와우혈류량의 변화를 비교하였을 때 유의한 차이가 있었다(p＝0.004, Repeated measurements of ANOVA).

고     찰

   PAF는 강력한 phospholipid autacoid로서 다양한 생화학적 반응에 관여한다. 이는 허혈에 의한 미세 혈관 손상과 염증 반응에서 강력한 매개체로 작용하여 천식, 과민증, 이식거부반응, 중추신경계의 장애 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. PAF의 허혈손상에 대한 작용은 직접적인 허혈의 유발과 허혈에 의한 조직 반응에서의 역할로 나눌 수 있다. Wood 등¹³⁾은 개의 위점막에 PAF를 주입한 연구에서 PAF에 의한 점막의 허혈은 혈관 수축에 의한 것이며 이에 따른 혈관 투과성의 증가와 조직의 부종도 원인이 된다고 하였다. Yue 등¹⁴⁾은 신경조직의 허혈상태에서 PAF가 과량으로 증가하는 것을 증명하였으며 이는 뇌혈관과 뇌대사에 강력한 작용을 하여 뇌손상에 중요한 매개체가 된다고 하였다. 쥐의 척수액내로 주입한 PAF는 농도에 비례하여 정량적으로 척수혈류량의 감소를 일으키며 이에 따른 운동기능의 장애를 초래하였다.¹⁵⁾
   위와 같이 PAF에 대한 연구는 주로 신경조직이나 장기이식적 측면에서 많이 연구되었으며 이과적 질환에 대한 연구는 많지 않고, 주로 내이보다는 중이의 병변에 대하여 연구되었다. Rhee 등¹⁶⁾은 친칠라에서 중이강내에 PAF를 주입하였을 때 중이점막의 투과성 증가에 의해 삼출성 중이염이 발생하는 것과 PAF의 길항제를 미리 주입하였을 때 삼출성 중이염이 예방되는 것을 증명하였다. 또한 PAF는 이관의 점액섬모운동을 저하시키며 개방압력을 높임으로써 삼출성 중이염의 병인에 관여한다.¹⁷⁾ 중이삼출액에서 PAF의 농도는 장액성 중이염보다는 점액성 중이염에서 높게 나타나며,⁷⁾ 삼출성 중이염에서보다 급성 중이염이나 만성 화농성중이염에서 더 높은 농도로 존재한다고 하여⁵⁾ 염증의 정도나 만성화와 관련이 있을 것으로 생각된다.
   현재까지 PAF에 대한 내이 질환의 병인으로서의 연구는 드물다. 기니픽에서 PAF를 전신적으로 투여하였을 때에 청력의 저하를 관찰할 수 있었고, 내이의 형태학적인 변화도 관찰되어서 PAF가 내이 질환의 한가지 원인이 될 수 있다고 하였다.⁹⁾¹⁰⁾ 국소적으로는 정원창에 1 μg/ml의 PAF를 준 후에 청력의 저하와 와우유모세포의 손상이 일어나서 염증매개물질인 PAF가 각종 염증성 질환에서 감각신경성 난청을 일으키는 인자가 될 수 있다고 하였다.⁸⁾ 본 실험의 결과에서 와우의 허혈성 손상은 중이저류액에 존재하는 농도의 PAF로는 일어나지 않지만 과량이나 반복적으로 노출되었을 때에는 일어날 수 있음을 시사하였다. 따라서 위의 연구들과 같이 유모세포에 대한 직접적 손상 이외에도 혈류량의 변화가 PAF의 와우에 대한 손상에 일부 역할을 한다고 할 수 있다.
   Gelfoam을 이용하여 정원창막에 약제를 전달하는 방법은 많은 연구에서 사용된 방법인데, 이번 연구에서는 작은 Gelfoam조각을 뭉쳐서 그 위에 micropipette을 이용하여 약제를 적신 후 정원창막 위에 올려놓았다. 5 μl의 양은 충분히 Gelfoam조각을 적실 수 있었으며 비슷한 방법을 사용한 연구¹²⁾에서는 0.4~1.5 μl 정도로도 충분히 약제의 전달이 된다고 하였다. 투여하는 약제의 크기가 충분히 작다면 이번 연구와 같은 정원창막을 통한 약제의 투여가 적당한 방법이다. 일반적으로 분자량이 500 kDa이하인 물질은 정원창막을 통해 투과할 수 있다고 알려져 있는데¹⁸⁾ 에피네프린의 분자량은 200 kDa이하이며 PAF의 분자량은 520 kDa정도이므로 두 가지 물질 모두 정원창막을 통과하는 데에는 문제가 없을 것으로 생각된다. 단지 PAF의 분자량이 약간 크므로 통과하는 시간이 더 걸려서 와우 혈관에 반응을 나타내는 데에도 많은 시간이 걸린 것으로 해석할 수 있다. 그러나 급성 중이염때 Streptococcus pyogenes에서 분비되는 Streptolysin O에 의해 정원창막의 투과장벽이 망가지면서 투과성이 증가하여 독성물질이 통과한다는 보고¹⁹⁾나 만성중이염때는 점막이 두꺼워지면서 투과성이 떨어지면서 방어 작용을 하는 것을 고려하여 볼 때, 임상적으로 중이염이 실제로 존재하는 상황에서는 여러 가지로 이번 실험과는 다른 환경이 존재할 것이다. 따라서 중이삼출액에서 보다 과량의 PAF가 존재하면서 정원창을 투과할 가능성이나 장시간에 걸친 반복적인 노출에 의한 축적 등도 고려하여야 할 것이다.
   Ohlsen 등¹²⁾은 정원창막에 에피네프린을 올려놓은 후 와우혈류량의 변화를 관찰하였는데 농도에 따라 15~30%의 혈류량의 감소가 1분 30초부터 시작하여 10~16분까지 지속된다고 하였다. 이번 연구에서는 양성대조군으로 이를 이용하였는데 동물에 따라 다양한 결과가 나왔지만 전체적으로는 이들의 결과와 비슷한 시간대에 약 15% 정도의 혈류량의 감소가 있었다. 이러한 결과에서 이번 실험이 전반적으로 다른 연구자들과 비슷하게 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 에피네프린의 작용이 20분 이내에 완료되므로 와우 혈류에 대한 PAF의 작용은 60분 정도 관찰하는 것으로 충분하다고 생각되었다.

   이번 연구에서는 두 가지 농도의 PAF에 대한 변화를 관찰하였다. PAF의 허혈작용을 고려하여 볼 때 혈류량의 감소가 예상되었으나 실제 중이 삼출액에 존재할 수 있는 농도인 10 μg/ml로 주었을 때 오히려 혈류가 증가하다가 서서히 줄어들었는데, 이는 이 정도의 농도에서는 허혈보다는 염증 반응을 유도하는 과정에서의 충혈 등으로 초기에 혈류량이 증가되는 것으로 해석할 수 있다. 또한 Hu 등²⁰⁾이 rat의 심장에 PAF를 관류하면서 관상동맥의 혈류량의 변화를 관찰한 연구에서 저농도에서는 혈관확장을 일으키고 고농도에서는 혈관확장에 이은 혈관수축을 일으키는 이중 작용을 보였는데 이번 연구의 결과도 PAF의 농도에 따른 두가지 작용을 반영한다고도 할 수 있을 것이다. 실험의 후반에서 혈류량이 줄어드는 것은 와우 외측벽에서 염증으로 인한 부종에 인한 것으로 추정할 수 있으나 이 점은 향후 실험에서 조직학적으로 규명해야 할 것이다. 또한 실험 후반으로 가면서 유효한 결과를 얻은 동물의 수가 많이 줄어서 40분 이후의 변화는 상대적으로 의미가 적다고 생각한다.
   직접적인 유모세포의 손상과는 별도로 와우혈류량의 변화에 의한 허혈성 손상만을 생각할 때 PAF가 중이삼출액에서와 비슷한 농도로 존재할 때에는 허혈성 손상을 일으키지 않는다고 생각된다. 그러나 과량으로 주었을 때는 혈류량이 감소하였으며, 이러한 결과는 PAF가 과량으로 중이삼출액에 존재할 때에나 반복적으로 내이에 침투할 때를 가정하여 볼 때 내이에 허혈성 손상을 줄 가능성이 있다는 것을 의미한다.
   향후 어떤 농도에서 와우혈류량이 감소하기 시작하는지의 경계농도를 찾는 것이 필요할 것이며, 이번 연구의 결과를 뒷받침하기 위해 혈류량의 변화에 따른 조직학적인 규명도 필요할 것으로 생각한다.

결     론

   중이삼출액에 존재하는 농도의 PAF는 내이의 허혈성 손상을 일으키지 않으나 과량으로 노출이 될 경우 와우허혈은 PAF에 의한 내이기능 손상의 기전 중 한가지가 될 수 있다고 생각된다.

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