서     론

   두경부 종양의 치료 방침을 결정하는 데는 병기, 경부전이의 유무, 병리조직학적 분화도, 주위조직에 침윤정도 등 여러 가지 요인이 고려되고 있지만 이들의 임상적용에는 한계점이 많다. 특히 구강암에서는 초기암인 경우에 적절한 치료를 하였음에도 예상치 못한 나쁜 결과를 보이는 경우가 있다. 따라서 구강암의 경부전이 및 재발 등이 우려될 경우 적극적인 치료 방침을 결정하기 위하여 미세 혈관의 밀도, p53 유전자의 돌연변이, 종양의 두께, 염색체 이상 등을 조사하여 치료 방침결정에 이용하려는 연구가 많이 시도되어 왔다.¹⁾²⁾
   이들 중 p53 유전자는 혈관 형성을 조절한다고 한다. 즉 종양내 혈관 형성은 vascular endothelial growth factor(VEGF)와 basic fibroblast growth factor(bFGF) 등의 혈관 형성 촉진 인자와 thrombospondin-1, angiostatin 및 endostatin 등의 혈관형성 억제인자의 이중조절을 받고 있는데³⁾ p53 유전자는 혈관형성 억제인자인 thrombospondin-1 을 항진시켜 혈관 형성을 억제한다고 한다.⁴⁾
   여러 종양에서 p53 유전자와 혈관형성의 관계를 밝히고 이들을 치료 방침 결정에 이용하려는 연구가 시도되고 있다. 흑색종 등에서는 미세 혈관의 밀도가 높은 경우 전이와 재발 등의 나쁜 예후와 연관이 있다고 알려져 있고⁵⁾ 구강암에서도 미세 혈관의 밀도가 높으면 경부 림프절 전이를 일으켜 예후가 나쁘다고 보고되고 있지만²⁾ 경부전이와는 상관이 없다는 보고도 있다.⁶⁾
   한편 p53 유전자도 역시 돌연변이가 있는 경우 두경부 종양의 예후와 밀접한 연관이 있는 전이 및 재발을 잘한다고 하지만 p53 유전자의 검출 방법과 보고자에 따라 전이 및 재발과는 연관이 없다는 보고도 많이 있다.⁷⁾ 이에 저자들은 혈관형성이 종양의 성장 및 전이에 중요하리라 생각되는 구강암과 구인두암에서 종양의 혈관 형성 정도를 CD-31을 이용한 면역조직화학 염색 방법으로 미세혈관의 밀도를 측정하고 PCR(polymerase chain reaction)-SSCP(single strand conformation polymorphism) 및 염기서열 분석으로 p53 유전자 돌연변이를 관찰하여 구강암과 구인두암에서 p53과 혈관형성간에 연관성을 알아보고 또한 미세혈관의 밀도와 p53 유전자 돌연변이가 임상병리학적 인자와는 어떤 관계가 있는지를 조사하여 이들을 구강암의 치료에 이용할 수 있는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

재  료

   이 연구에 사용된 조직은 가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원 이비인후과에서 구강과 구인두 편평 상피암으로 확진되어 수술받은 25명을(설암 18명, 편도암 5명, 후인두벽암 2명) 대상으로 하였다. 평균 추적 관찰기간은 21.5개월이었다. 환자의 병기는 AJCC(American Joint of Cancer Committe, 1997)의 분류법을 따랐다.

면역조직화학 염색을 이용한 미세혈관의 밀도 측정

   면역조직화학 염색법은 Microprobe system(Fisher, Tuscon, USA)을 이용하였다. 포르말린으로 고정된 파라핀 포매 조직을 4~5 μm 두께로 잘라 Probe on plus slide에 부착시키고 Histo clear와 xylene이 1：3으로 섞인 용액이 두장의 슬라이드 사이로 들어가게 한뒤 Micro Probe 기계 안에서 45°C에서 5분간 방치했으며 이를 3번 반복하였다. 조직의 투명을 위해 무수 알콜로 1분씩 3번 주입하고 이때 반응이 잘 나오도록 깨끗이 알코올을 제거하였다. 항원을 추출시키기 위하여 citrate buffer에서 슬라이드를 5분간 전자렌지에 끓이는 과정을 3번 반복하였다. H2O2로 endogenous peroxidase를 제거해준 뒤 항체 CD-31(Biogenex mouse anti human, CA, USA)를 1：10으로 희석하여 45°C에서 1시간 30분 동안 반응을 하였다.

   PBS(phosphate buffer saline)로 3번 수세해 준 뒤 이차 항체(Biogenex biotinlyted anti mouse, CA, USA)로 45°C에서 30분간 반응시킨 뒤 다시 PBS로 수세하였다. Peroxidase법을 이용하여 detection buffer에 45°C에서 15분간 반응시켰으며, enhancing buffer로 3번 수세한 후 다시 AEC 발색제로 45°C에서, 15분간 반응시켰다. 증류수로 깨끗이 수세한 후 헤마톡실린으로 대조염색을 하고 crystal mount로 봉입한 후 현미경으로 검경하여 미세 혈관의 밀도를 관찰하였다. 관찰방법은 종양세포주위에 가장 미세 혈관의 밀집도가 높은 곳 3군데를 선택하여 200배 시야에서 미세 혈관의 숫자를 측정하고 이중 가장 큰 값을 미세 혈관의 밀도로 채택하였다.⁸⁾ 양성 대조군으로 편도조직을 이용하였고, 음성 대조군으로는 일차항체 대신 증류수를 넣고 염색하였다. 염색 상태가 약하거나 염색이 되지 않은 조직은 슬라이드를 다시 준비하여 염색을 같은 방법으로 반복하였다.

종양세포의 DNA 추출을 위한 미세절제

   종양조직의 추출은 종양조직만을 추출하기 위하여 미세절제법을 이용하였다.⁹⁾ 종양조직은 파라핀 포매 조직에서 절편을 얻어 탈파라핀 및 헤마톡실린 에오신 염색을 한 후 2% glycerol buffer에 약 2분간 두었다가 micromanipulator(BM Korea Co, Seoul, Korea)에 부착된 30 gauge needle(Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ)로 미세절제하여 20 μl의 DNA 추출 용액(0.5% Tween 20, 1 mM EDTA, PH 8.0, 50 mM Tris-Hcl PH 8.5)에 넣었다. DNA 추출은 single step DNA extraction method(Turbett et al, 1996)를 이용하여 proteinase K(2 mg/ml)를 가하고 50°C에서 2일간 두었다가 95°C에서 10분간 두어 proteinase K 활성을 파괴하고 4°C에서 보관하여 PCR template로 사용하였다. 대조군으로 정상조직의 DNA는 같은 방법으로 림프구를 추출하여 얻었다.

p53 유전자의 변이

PCR(polymerase chain reaction)-SSCP(single strand conformation polymorphism)
   p53 유전자 변이는 exon 5, 6, 7, 8에서 검출하였다. PCR primer는 주문 합성하여 사용하였다(Clontech CA, USA)(Table 1).
   PCR은 template DNA(100 mg/μl) 1 μl, 10×PCR buffer(^＋MgCl2) 1 μl, dNTP(2.5 mM) 1 μl, 증류수 6.4 μl, primer(25 pM/μl) 각각 0.2 μl, Taq polymerase(5 U/μl) 0.1 μl [α- ³²P] dCTP 0.1 μl를 0.5 ml tube에 넣어 잘 섞고 총 10 μl의 양이 되도록 한 후 mineral oil을 한 방울 떨어뜨린 후 PCR을 시행하였다. PCR은 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하였다. PCR 조건은 exon 5에서는 95°C 1분, 65°C 1분, 72°C 1분으로 35회 시행하였고 처음 95°C는 5분, 마지막 72°C는 5분간 처리하였고, exon 6, 7, 8에서는 annealing 온도는 60°C로 하여 같은 방법으로 시행하였다. PCR 산물 10 μl을 loading dye(95% formamide, 10 mM NaOH, 0.25% bromophenol blue and 0.25% xylene cyanol) 10 μl와 혼합하고 95°C에서 5분간 변성시킨 뒤 얼음이 들어 있는 수조에서 급냉시켜 50% glycerol이 포함된 MDE gel(AT Biochem, Malvern, PA)에 적재하여 최초 7 watt로 18시간 동안 전기영동하였다. Gel을 3MM Whatmann paper에 흡착하여 말린 후, Kodak-OMAT film(Eastman Kodak, Rochester, NY)에 상온에서 48시간 노출시킨 후 현상하였다.

염기서열 분석
   SSCP에서 이동도의 차이를 보인 밴드만을 염기서열 분석을 시행하였다. Primer는 SSCP에서와 동일한 것을 사용하였으며 Amplicycle Sequencing Kit(Perkin Elmer, Branhburg, NJ)를 사용하여 시행하였다.

PCR 산물의 전처리
   SSCP gel에서 이동차를 보인 밴드를 잘라내어 PCR 산물을 증류수 50 μl에 넣어서 상온에서 하루동안 둔 후 이중 5 μl를 DNA template로 PCR를 시행하여 밴드를 확인하였다.

염기서열 결정반응
   각 G, A, T, C termination 혼합물 2 μl를 PCR tube들에 분주하고(tube/termination mix) 반응 tube들을 반응 혼합물이 첨가되기 전까지 얼음에 보관하였다. 반응 혼합물의 조성은 전 처리된 DNA sample 3 μl, primer(10 pmol, Foward and Reverse) 1 μl, 10×cycling Mix(Taq DNA Polymerase 100 unit, 500 mM Tris-Cl, pH8.9, 100 mM KCl, 25 mM MgCl2, 0.25%(v/v) Tween 20) 4 μl, [α- ³²P] dCTP 0.5 μl, 증류수 21.5 μl를 혼합하여 준비된 반응 mix 6 μl를 각각 네 개의 tube들에 분주하고, 약 20 μl의 mineral oil를 넣었다. 각 tube의 뚜껑을 닫고 DNA Termal cycler block으로 옮겨 PCR을 같은 조건으로 수행하였다. 반응이 종료된 후, 각 tube에 반응정지 용액 8 μl를 넣어 반응을 정지시켰다.

전기영동
   SequaGel Sequencing system(National diagnostics Inc, NY, USA)의 SequaGel Concentrate 15 ml, SequaGel Diluent 30 ml, SequaGel Buffer 5 ml을 혼합한 후 gel을 만들었고 10% ammonium persulfate 400 μl와 TEMED 60 μl를 섞은 후 유리판에 부어 gel 판을 만들었다. 염기서열 결정반응이 끝난 표본을 100°C에서 2분간 변성 후 전기영동을 시행하였다. 전기영동을 70 watt에서 3시간 한 후 3 MM paper로 옮겨 gel dryer로 80°C에서 2시간 건조시킨 후 X-ray 필름에 48시간 노출시킨 후 필름을 현상하여 관찰하였다.

자료의 분석과 통계처리
   자료의 유의성 검정에서 정상형의 p53 군에서의 미세 혈관의 밀도, 돌연변이형의 p53 군에서의 미세 혈관의 밀도의 비교는 Wilcoxon rank sum test를 이용하였고, 미세 혈관의 밀도와 p53 유전자의 변이 검출 유무에는 chi-square 검정을 이용하였다. 표본수가 적은 경우에는 Fisher's exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

면역조직화학 염색법을 통한 미세 혈관의 밀도의 측정

   환자의 평균연령은 56.6세이고 남자는 16명, 여자가 9명이었다. 25예중 7예(28%)에서 p53 돌연변이가 있었다. CD-31 항체에 혈관내벽이 염색되지 않은 2예를 제외한 23예에서 미세혈관의 밀도를 측정할 수 있었다(Fig. 1).
   돌연변이형의 p53 군에서 미세 혈관의 밀도는 2에서 25까지로 평균치는 13.3±2.80이었으며 정상형의 p53 군에서 미세 혈관의 밀도는 12에서 25까지로 평균치는 18.6±1.15이었다.
   미세 혈관의 밀도는 p53 유전자의 돌연변이와 통계적으로 유의하게 역비례 관계가 있었다(p＝0.047)(Fig. 2).

p53 유전자의 돌연변이
   p53 유전자의 돌연변이 7예는 모두 1개의 염기가 치환되는 점돌연변이였으며 다른 아미노산으로 바뀌는 missense mutation이었다(Fig. 3).
   돌연변이의 exon별 분포는 exon 5에서 4예로 가장 많았으며 exon 6, 7, 8에서 각각 1예씩이었다. 돌연변이의 codon별 분포는 codon 154에서 279사이에 나타났다. 염기치환의 종류는 G-T, G-A, C-T, C-A, G-C, A-T, T-A 변이가 각각 1예씩으로 transversion이 4예(57.1%), transition이 3예(42.9%)였다(Table 2).

임상병리학적 특징과의 상관 관계

   p53 유전자의 돌연변이는 주위조직의 침윤정도가 1 cm이상인 15예에서는 6예(40.0%) 1 cm미만인 10예에서는 1예(10.0)%로 침윤정도가 1 cm이상인 경우에 p53 유전자의 돌연변이 빈도가 높았으나 통계적으로 유의하지 않았다. 그밖에 나이, 경부림프절 전이의 유무 및 재발에 따른 p53 유전자의 돌연변이, 미세혈관의 밀도는 양군간에 차이를 보이지는 않았다(Table 3).

고     찰

   종양내의 혈관형성이 종양세포의 성장과 전이에 영향을 준다고 알려지면서 많은 실험과 임상연구를 통하여 혈관형성 정도가 고형암의 예후 인자로 인정되고 있다. 또한 종양발생의 기전을 분자생물학적으로 설명하려는 노력으로 종양 발생과 진행, 예후 등과 연관이 있는 많은 종양유전자와 종양억제 유전자가 밝혀지고 연구되었는데 이들 역시 종양의 예후와 연관이 있다고 한다. 특히 p53 유전자는 돌연변이가 있는 경우 두경부 종양의 생존률이 낮아지고 방사선 치료의 효과도 떨어진다고 알려져 있고¹⁰⁾ 종양내 혈관형성에도 관여한다고 한다. 즉 종양 유전자와 종양억제 유전자는 종양내 혈관형성을 조절하는데 종양유전자인 ras는 혈관형성을 촉진하는 VEGF(vascular endothelial growth factor)를 과발현시켜 혈관형성을 항진시키고 종양억제유전자인 p53은 VEGF를 억제하고 혈관형성을 억제하는 thrombospondin-1을 항진시켜 혈관형성을 억제한다고 한다.³⁾ 그러나 p53 유전자에 돌연변이가 생겨 p53 유전자의 기능을 상실하면 thrombospondin-1의 생산이 억제되어 혈관 형성이 항진될 수 있지만⁴⁾ p53 유전자를 통한 혈관 형성 조절 기전은 세포 및 조직의 특이성이 있어 종양의 종류에 따라 다른 결과를 보일 수 있다고 한다.¹¹⁾
   흑색종⁵⁾에서는 p53 유전자의 돌연변이가 생기면 혈관형성을 억제하는 thrombospondin-1의 생산이 억제되어 종양의 혈관형성이 증가하지만 담관암에서와 같이 종양에 따라서는 p53 유전자와 thrombospondin-1는 관련이 없다는 보고도 있다.¹²⁾
   본 연구에서도 p53 유전자의 돌연변이가 있을 때 미세 혈관의 밀도가 적게 관찰되는 역비례 관계를 보여 구강암에서는 조직의 특이성 때문에 p53이 thrombospondin-1을 조절을 하지 않고 다른 요인이 관여할 수 있다고 생각된다. 종양내에서 혈관형성 정도를 관찰하는 방법에는 여러 가지가 있으나 면역조직화학 염색법을 통한 미세혈관의 밀도 측정은 여러 종양에서 종양의 성질을 잘 나타내는 유용한 인자로 미세 혈관의 밀도가 높으면 림프절 전이를 잘하여 나쁜 치료 결과를 보인다고 한다.⁵⁾
   두경부 종양에서는 미세 혈관의 밀도가 높으면 재발과 전이를 잘한다고 보고되기도 하나¹⁾ 비인강암과 다른 두경부 종양의 경우 미세 혈관의 밀도가 높으면 방사선 치료에 반응을 잘하므로 예후가 좋고 미세 혈관의 밀도가 종양의 생존률과는 상관이 없다는 보고도 있다.²⁾¹⁰⁾ 본 연구에서도 병기, 경부전이 및 재발 등의 예후 인자와 미세혈관의 밀도는 연관이 없었는데 이는 구강암은 원래 혈관조직이 풍부하므로 종양의 성장과 전이에 새로운 혈관을 만들 필요가 없어 혈관형성에 의존성이 적기 때문이라고 설명할 수 있다.¹³⁾ 또한 미세 혈관의 밀도 측정의 결과는 염색하는 항체나 측정방법에 따라 차이가 많은데 본 연구에 이용한 항체인 CD-31은 factor VIII과 달리 림프혈관 내벽에는 염색이 안되고 혈관의 내벽에만 선택적으로 염색이 되는 미세 혈관의 밀도를 측정하는 선별적인 방법이지만¹⁴⁾ 미세혈관의 밀도를 측정하는 방법이 다양하고 방사선 치료에는 혈관형성 정도가 많을 때 반응을 잘하나 혈관형성정도가 많을 때 전이를 잘하는 등 치료에 대한 혈관형성의 역할이 복잡하다는 것을 고려할 때 구강암과구인두암에서는 면역 조직화학 염색법을 통한 미세혈관의 밀도 측정만으로 종양의 전이 및 재발과 혈관형성의 관계를 밝히기는 어려울 것으로 생각된다. 그러므로 기존의 미세혈관과 새로운 미세혈관을 구별하여 관찰할 수 있는 새로운 방법을 개발하고 혈관 생성에 관여하는 다른 인자들을 포함하여 추가 연구를 하는 것이 필요할 것으로 생각되었다.
   p53 유전자와 두경부 종양의 예후와의 관계는 p53 유전자의 돌연변이가 있는 경우 생존률이 떨어지고 재발을 잘하여 돌연변이가 있는 경우 좀더 적극적인 치료방법을 시도해 볼 수 있는 예후 인자로 적용할 수 있다는 가능성이 많이 보고되고 있지만⁷⁾ 본 연구에서는 연관성을 찾을 수 없었다. 이것은 증례 수가 적고 p53 유전자의 돌연변이를 보였던 3예에서 수술 후 수개월 이내에 다른 질환으로 사망하여 치료결과를 충분히 추적 관찰하지 못하였기 때문으로 생각된다.
   또 p53 유전자의 돌연변이는 검출방법에 따라 다양한 결과를 보이는데 PCR-SSCP에 의한 p53 유전자 돌연변이 검출은 빠르고 90%의 정확도가 있으나 이동차를 보인 검체가 모두 돌연변이가 있는 것이 아니어서 염기서열 분석을 통하여 확인하여야 하며 시간이 많이 걸리더라도 직접 염기서열 결정반응을 시행하는 것이 좋다고 한다.
   본 연구에서도 PCR-SSCP에서 이동차를 보였던 증례 중에 염기서열을 분석하여 확인한 결과 돌연변이가 없는 것으로 판명된 증례가 있으므로 모든 조직을 직접 염기서열 결정반응으로 확인하는 것이 좋을 것으로 생각되었다. 그리고 exon 5-8뿐 아니라 다른 exon을 포함하여 직접 염기서열 결정 반응으로 돌연변이를 모두 검출하고 분석하면 p53 유전자의 돌연변이와 구강암과 구인두암의 예후 관련인자와 연관성을 찾을 수도 있을 것으로 생각된다.
   Graeber 등¹⁵⁾(1996)의 연구에 의하면 p53 유전자의 돌연변이가 있는 경우 종양세포는 혈관형성이 억제된 상태에서도 성장할 수 있어 p53 유전자의 이상이 새로운 혈관형성보다 종양의 성장과 전이에 밀접한 관계가 있을 것이라고 추정할 수 있다. 따라서 앞으로는 돌연변이에 의한 단백질 변화가 실제로 어떻게 종양의 발생과 전이에 영향을 미치는지 연구해야 할 것으로 생각된다. p53 유전자 돌연변이는 인종, 생활습관, 종양의 종류 등에 따라 차이를 보이는데 미국은 exon 7⁷⁾ 일본은 exon 5, 8¹⁶⁾ 영국은 exon 4¹⁷⁾에서 흔히 발견되며 지역별로도 염기치환 양상이 달라 미국의 경우 두경부암의 63%가 G-T transversion이 나타나고¹⁸⁾ 일본의 경우는 두경부암의 50%에서 G-A transition이 나타난다고 한다.¹⁶⁾ 종양유발인자가 음주, 흡연 등으로 비슷한 후두암과 구강암도 염기치환 양상이 달라 후두암은 폐암과 비슷한 G：C-T：A transversion이 많고 구강암에서는 G：C-A：T transition이 80%로 많다는데¹⁹⁾ 이는 각각의 종양이 다양한 원인을 갖고 p53 유전자의 각 부위별 기능이 다르다는 것을 나타낸다.²⁰⁾
   즉 구강암은 담배의 수용성 N-nitrosamine이 원인이 되고 후두암에서는 담배의 연소 물질이 원인이 되기 때문에 염기치환 양상이 다르게 나타날 수 있다고 한다.¹⁹⁾ 본 연구에서는 exon 5에서 돌연변이가 가장 많이 관찰되어 지역적으로는 일본과 비슷한 양상을 보였고 증례가 적어 염기치환의 특징은 찾을 수 없었다. 돌연변이의 hot spot도 종양에 따라 차이가 있어 간암의 경우는 codon 249에서 흔히 일어나고 두경부 종양에서는 codon 238~248 부위에서 hot spot을 이루고 있다 하나¹⁷⁾ 본 연구에서는 hot spot에서는 돌연변이가 없었고 codon 156에서 codon 279까지 돌연변이가 산재해 있었다.
   이상의 결과에서 구강암과 구인두암의 혈관 형성에는 p53 유전자의 돌연변이만 관여하는 것이 아니고 다른 인자도 함께 작용할 것으로 추정되었고 p53 유전자의 돌연변이의 검출은 직접 염기서열 결정반응을 통하여 확인하고 돌연변이에 의한 단백질 변화가 실제로 어떻게 종양의 성질에 영향을 미치는가 계속 연구하는 것이 필요할 것으로 생각되었다.

결     론

   구강암과 구인두암의 혈관 형성에 종양억제유전자인 p53 유전자가 어떻게 작용하는지 알아보고 이들을 예후 인자로 임상에 이용할 수 있는지 알아 본 결과 독립적인 예후 인자로 미세혈관의 밀도와 p53 유전자변이의 유효성을 입증하지는 못하였지만 혈관 형성에는 p53 유전자 뿐 아니라 다른 인자가 관여할 수 있다는 것을 추정할 수 있었다. 따라서 종양의 혈관 생성 능력을 측정하는 새로운 방법을 개발하여 혈관형성에 관여하는 여러 인자를 같이 연구하고 p53 유전자 돌연변이를 정확하게 검출한 후 이들이 종양의 발생과 전이에 어떤 역할을 하는지 밝히는 것이 두경부 종양의 생존률을 향상시키는데 기여할 것으로 생각된다.

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