서     론

   최근 산업화로 인한 대기오염 물질의 증가로 인간의 코를 포함한 기도는 여러 가지 대기 오염원에 동시에 노출되고 있으며, 따라서 호흡기 질환이 증가하고 있는 추세이다.¹⁾²⁾ 이들 대기 오염원 중 대표적 물질인 오존은 광화학적 스모그의 주된 성분을 이루는 자극적인 산화 기체로,³⁾ NAAQS(National Ambient Air Quality Standards)에서는 0.12 ppm이상의 농도에 주당 1시간 이상 노출되는 것을 금하고 있으며,⁴⁾⁵⁾ 최근에는 국내에서도 오존발생 경보의 빈도가 늘어나는 등 사회 문제화되고 있다.
   오존은 폐를 비롯한 하기도에 대하여 많은 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다.⁶⁾⁷⁾ Silverman등⁸⁾은 0.25 ppm의 오존에 노출되었을 때 천식 환자의 1/3에서 천식 증상을 악화시킨다고 하였으며, Folinsbee등⁹⁾은 0.21 ppm의 오존환경하에서 1~2시간 동안 심한 운동을 할 경우 정상인에서도 호흡기 자극 증상이 나타난다고 하였고, Hackney등¹⁰⁾은 0.3 ppm 이상의 농도에서는 가벼운 운동을 할 경우에도 기침이나 흉골하 자극 증상을 유발할 수 있으며, 1~2시간 내에 FEV1의 감소를 보인다고 보고하였다.
   1972년 Yokoyama 등¹¹⁾은 흡입된 오존의 40~70%가 비점막에 흡수된다고 하였으며, Calderon-Garciduenas 등¹²⁾은 하루중 평균 3시간 이상 오존 농도가 0.12 ppm이 넘는 날이 연중 대부분인 환경에서 생활하는 멕시코시의 어린이에서 비증상이 많이 나타나며, 이들의 비점막에서 섬모 세포의 감소 및 상피세포의 이형성을 보였다고 보고하여 오존에 의한 비점막의 손상 가능성이 제시되고 있다. 그러나 아직 비점막에 대하여 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 부족한 실정이다.
   이에 본 연구에서는 백서를 오존에 폭로시킨 후 염증세포의 침윤, 섬모의 소실, 상피층의 증식, 상피세포의 이형성, 분비세포의 증가 등 비점막의 형태학적 변화 유무를 관찰하였다.

실험 대상 및 방법

실험동물

   무균 상태로 사육된 180~210 g의 암컷 백서 25마리를 실험실 환경에 적응시키기 위해 오존에 노출시키기 일주일 전부터 온도 20~23도, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하였고 이 기간내에 상기도 감염의 증상과 다른 질환이 관찰되는 백서는 실험에서 제외시켰다. 총 25마리의 백서를 대조군, 0.3 ppm 폭로군, 0.6 ppm 폭로군, 0.9 ppm 폭로군, 1.2 ppm 폭로군으로 나누어 각각 5마리씩 할당하였다.

오존폭로

   오존폭로 장치는 Fig. 1에 도식화되어 있는 것과 같다. 폭로상자는 전신 흡입상자(whole-body inhalation chamber)의 형태로 크기는 30×20×17 cm 이었다. 오존 발생기로는 Prince ozone generator(대창기계, Korea)를 사용하였으며 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공기와 섞여 상자내로 유입되도록 하였고 오존이 상자 내에서 고른 농도를 보일 수 있도록 상자 내에 소형 선풍기를 설치하여 순환시켰다. Porta-sens model B16-14(Analytical Technology, Oaks, PA)를 이용하여 상자내의 오존 농도를 측정해가며 오존의 유입량을 조절하여 원하는 농도로 맞춘 다음 폭로 시간 내내 일정한 농도가 유지되는지 감시하였다. 그리고 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화시킨 다음 배출되도록 하였다. 모든 폭로군에서 하루 6시간씩 7일 동안 폭로하였다.

광학현미경용 표본 제작 및 염색

   마지막 폭로후 18시간에 케타민을 복강내에 주입하여 마취한 다음, 각 백서의 머리를 몸통에서 절단한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다. 채취한 조직을 바로 10% 중성 포르말린 용액에 넣어 72시간 고정한 다음, 13% formic acid 용액에서 4일 동안 탈회시킨 후 상절치 바로 뒤에서부터 경구개의 절치유두(insicive papilla)의 약 2 mm 전방 부위까지 절단하여 블록을 만들었다. 흐르는 물에 12시간 세척 후, 이 조직을 70%, 80%, 90%, 100%, 100% ethanol 용액에 각각 2시간 침적하여 탈수시킨 후, xylene처리를 하고, 파라핀에 포매하였다. Microtome을 이용하여 3~4 μm의 두께의 절편을 만든 다음 비점막의 일반적인 형태를 관찰하기 위한 Hematoxylin/Eosin(H/E)염색과 분비세포를 관찰하기 위한 Alcian blue(pH 2.5)/Periodic Acid Schiff(AB/PAS)염색을 실시하였다.

결과의 판독

   각 개체의 조직 절편을 대조군과 비교하여 염증세포의 침윤, 상피층의 비후, 섬모의 손상, 편평상피화생, 분비세포의 증가 여부를 없음, 경도, 중등도, 고도의 네 단계로 나누어 평가하였다. 상피층의 비후, 섬모의 손상, 편평상피화생 등이 점막의 극히 일부 부위에서만 관찰되는 경우를 경도, 해당부위 점막의 1/2 이상에서 발견되는 경우를 고도, 경도와 고도 사이를 중등도로 분류하였으며, 비중격 점막의 분비세포에 대한 평가는 AB/PAS 염색정도를 기준으로 평가하였고 maxilloturbinate에서 보이는 분비세포는 그 수가 적었기 때문에 없음과 경도 두 단계로 나누었다.

결     과

정상 점막의 소견

   비중격의 점막은 섬모가 있는 원주세포와 배세포로 구성된 전형적인 호흡상피로 덮혀있었으며 상피층 아래에는 작은 혈관들이 산재해 있고 드물게 점막하 분비선이 관찰되었다. Maxilloturbinate는 섬모가 없는 입방상피로 덮혀있었으며 분비세포나 점막하 분비선은 관찰되지 않았다(Fig. 2).

염증세포의 침윤
   0.3 ppm 폭로군 및 0.6 ppm 폭로군에서는 5마리중 4마리에서 경도 혹은 중등도의 주로 중성구로 구성된 염증세포 침윤을 관찰할 수 있었으며 0.9 ppm 폭로군 및 1.2 ppm 폭로군에서는 모든 개체에서 중등도 혹은 고도의 염증세포 침윤이 관찰되었다(Table 1, Fig. 3).

상피층의 비후
   0.3 ppm 폭로군 및 0.6 ppm 폭로군에서는 5마리중 1마리에서만 비중격 상피의 중등도 비후를 관찰할 수 있었으나, 0.9 ppm 폭로군에서는 2마리, 1.2 ppm 폭로군에서는 4마리에서 중등도 이상의 비후를 관찰할 수 있었다(Table 1, Fig. 3). 0.9 ppm 폭로군과 1.2 ppm 폭로군에서는 각각 3마리의 maxilloturbinate에서 중등도의 비후소견이 관찰되었다(Table 1, Fig. 3).

섬모의 손상
   0.3 ppm 폭로군에서는 비중격점막에서의 섬모의 손상을 관찰할 수 없었으나, 0.6 ppm 폭로군에서는 2개체에서 경도의 손상이 관찰되었으며, 1.2 ppm 폭로군에서는 모든 개체에서 섬모의 손상이 관찰되었다(Table 2, Fig. 3).

편평상피화생
   0.3 ppm 폭로군에서는 1마리에서 경도, 0.6 ppm 폭로군에서는 1마리에서 중등도의 편평상피화생이 관찰되었으나, 0.9 ppm 폭로군에서는 2마리, 1.2 ppm 폭로군에서는 모든 개체에서 경도 이상의 편평상피화생을 보였다(Table 2, Fig. 4).

분비세포의 비후 및 증가
   0.3 ppm 폭로군에서 비중격의 분비세포는 대조군과 차이가 없었으나, 0.6 ppm 폭로군 중 2마리, 0.9 ppm 폭로군 및 1.2 ppm 폭로군 중 4마리에서 분비세포가 비후 혹은 증가된 소견을 보였다. 정상 maxilloturbinate에서는 보이지 않았던 분비세포가 각 군의 5마리중 3~4마리에서 관찰되었다(Table 2, Fig. 5).

고     찰

   외부로부터 해로운 자극 물질에 대하여 방어 작용을 하는 것으로 알려진 비점막은 대기오염 물질에 노출되었을 때 점막내 염증세포, 특히 중성구가 증가하는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ Hotchkiss 등¹⁴⁾은 백서를 각각 0.12, 0.8, 1.5 ppm의 오존농도에 폭로시켰을 때 모든 군에서 비세척액 및 비점막에서 중성구가 증가되어 있음을 보고하였다.
   본 연구에서도 오존에 폭로된 모든 군에서 중성구의 침윤이 증가되어 있었고 농도가 증가할수록 중성구의 침윤정도는 심해지는 경향을 관찰할 수 있었다.
   Hotchkiss 등¹⁵⁾은 0.5 ppm의 오존에 백서를 8시간 동안 폭로시켰을 때 점막의 다른 변화 보다도 중성구의 침윤이 가장 먼저 관찰된다고 하였다. 이러한 중성구의 증가가 방어작용의 일환으로 생각되지만 침윤된 중성구로부터 생산되는 단백분해효소나 세포에 독성을 가진 산화 유리기로 인해 상피세포가 손상되어 상피의 괴사 혹은 탈락이 일어날 수 있다.¹⁶⁾
   Harkema 등¹⁷⁾은 원숭이를 하루 8시간씩 6일 동안 0.15 ppm 혹은 0.3 ppm의 오존농도에 폭로시켰을 때 비점막 상피세포에서 섬모가 짧아지거나 소실되어 있음을 관찰하였으며, 90일간 폭로시켰을 때에는 상피세포가 대부분 섬모가 없는 dome 모양의 표면을 갖는 비섬모세포로 대치되어 있음을 보고하였다. 또 오존의 평균농도가 11.08 ppb인 사웅파울루 시내 중심가에서 사육한 백서는 대조군에 비해 비점막의 섬모세포가 감소되어 있음이 보고되어 있다.¹⁸⁾ 그러나 Harkema 등¹⁹⁾은 백서를 0.12 ppm 혹은 0.8 ppm의 농도에 하루 6시간씩 7일 동안 폭로시켰을 때 섬모의 손상이나 소실을 관찰할 수 없었다고 보고하였다. 이러한 다양한 결과는 오존농도 및 폭로기간, 폭로방법, 실험동물 등이 각각 다르기 때문이라고 생각한다.
   본 연구에서는 0.3 ppm 폭로군의 비중격점막에서는 섬모의 소실을 관찰할 수 없었으나, 1.2 ppm 폭로군에서는 정도의 차이는 있지만 모든 개체에서 섬모가 소실되어 있는 소견을 보였다. 그러나 광학현미경적 관찰만으로는 섬모의 손상 정도를 정확하게 판단하기 어려워 전자현미경을 이용한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
   손상을 받은 조직은 재생 및 회복과정을 거치게 되며, 자극이 계속될 때에는 더 이상의 손상을 막으려는 반응이 일어나게 된다. 오존에 폭로된 후에는 이러한 반응의 일환으로 상피층이 비후 혹은 증식되는 것으로 보고되어 있다.²⁰⁾ Harkema 등¹⁹⁾은 0.12 ppm과 0.8 ppm의 농도에 백서를 7일간 폭로시켰을 때 0.12 ppm 폭로군에서는 상피층의 비후소견을 보이지 않았으나 0.8 ppm 폭로군에서는 maxilloturbinate의 상피층이 증식되어 있었다고 보고하였으며, 평균 오존농도 11.08 ppb인 사웅파울루 시내 중심가에서 사육된 백서에서도 비중격의 상피증식과 비후를 관찰할 수 있었다고 보고되어 있다.¹⁸⁾
   본 연구에서도 0.9 ppm 이상의 고농도 폭로군 중 일부 개체의 비중격 혹은 maxilloturbinate에서 중등도 이상의 상피층의 증식 혹은 비후를 관찰할 수 있었다.
   원주상피는 외부로부터의 자극 물질에 대하여 민감하여 손상을 받기 쉬우나 편평상피세포는 비교적 손상을 덜 받는다고 알려져 있다. Calderon-Garciduenas 등¹²⁾은 대기오염이 심한 멕시코시에 살고 있는 어린이의 비강세척액에서 편평상피세포가 증가되어 있는 것을 관찰하였다.
   본 연구의 결과 0.3 ppm 폭로군 및 0.6 ppm 폭로군에서는 1마리에서만 각각 경도 및 중등도의 편평상피화생이 관찰되었으나, 1.2 ppm 폭로군에서는 모든 개체에서 발견되었으며 저농도군에 비해 편평상피화생을 보이는 부위가 넓어지는 경향을 보였다. 따라서 오존과 같은 유해 자극이 계속되면 방어작용으로 원주상피세포들이 편평상피화될 수 있으며 이러한 현상은 고농도에 폭로되었을 때 더 현저할 것으로 생각한다.
   Harkema 등¹⁹⁾은 0.8 ppm의 농도에 백서를 7일간 폭로시킨 후 바로 희생시켰을 때에는 상피가 비후되어 있고 핵분열이 많은 양상을 보였으나, 마지막 노출후 7일에 희생시킨 백서에서는 핵분열 양상은 보이지 않고 분비물질을 함유하고 있는 세포가 많이 증가되어 있는 양상을 보였다고 하였다. 또 Lemos 등¹⁸⁾은 사웅파울루 시내 중심가에서 사육한 백서의 비중격 점막에서 대조군에 비해 점액물질이 유의하게 증가되어 있음을 보고하였고, Harkema 등¹⁷⁾도 원숭이에서 오존폭로시 정상적으로 점액세포가 있는 비중격 뿐만 아니라 점액세포가 없는 maxilloturbinate에서도 분비세포를 관찰할 수 있었다고 하였다.
   본 연구에서도 0.3 ppm 폭로군의 비중격에서는 분비세포 및 분비물질의 증가를 관찰할 수 없었으나, 0.9 ppm 폭로군 및 1.2 ppm 폭로군에서는 4마리에서 증가를 관찰할 수 있었다. 또 정상 maxilloturbinate에서는 보이지 않았던 분비세포가 모든 오존 폭로군의 5마리중 3~4마리에서 관찰되어 오존폭로 후 상피에서 분비세포 이형성이 나타남을 알 수 있었다.
   오존에 의해 손상된 점막에서 점액세포가 증가하는 현상은 많은 점액을 분비하여 오존의 독성효과를 감소시키고 따라서 더 이상 비점막의 손상을 막고 하부 폐조직를 보호하기 위한 적응기전으로 생각된다.
   오존에 폭로시 비점막에서 보이는 각각의 변화가 무엇을 의미하는지는 아직 확실치 않다. 그러나 제일 먼저 중성구가 침윤되고 침윤된 중성구로부터 생산되는 여러 단백분해효소 및 산화유리기에 의해 비점막이 손상을 받게되어 상피세포의 괴사 및 탈락을 보이게 될 것으로 생각한다. 그리고 손상을 받은 비점막에서는 치유과정 혹은 적응과정으로 세포증식이 일어나며 오존 폭로가 계속될 경우 호흡상피가 편평상피로 화생되고, 방어기전의 일환으로 분비세포의 수가 증가하는 것이 아닌가 생각한다.

결     론

   백서를 오존에 폭로한 후 광학현미경하에서 비점막의 형태학적 변화를 관찰한 결과 중성구의 침윤, 섬모의 소실 등이 보이고, 상피층의 증식 및 비후, 그리고 호흡상피의 편평상피화생 및 분비세포의 비후 혹은 증가를 관찰할 수 있었으며 이러한 변화는 저농도군에 비해 고농도 폭로군에서 현저하였다.
   이러한 비점막의 형태학적 변화는 오존에 의한 손상과 손상을 받은 비점막에서 일어나는 치유과정 혹은 적응과정으로 생각된다. 그러나 이러한 변화가 얼마나 지속되며, 또한 농도에 따른 손상의 회복정도 등에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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