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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 43(1); 2000 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(1): 51-57.
Expression of Fibronectin Activities in Rat Tongue Mucosal Wound Healing Following CO2 Laser Incision.
Hyung Seok Lee, Kyung Tae, Yean Hee Yu, Joon Suk Choi, Yeon Gi Jeong
Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea.
백서 설점막에 CO<sub>2</sub> 레이저 시술 후 창상치유과정에서 Fibronectin의 발현에 관한 연구
이형석 · 태 경 · 유연희 · 최준석 · 정연기
한양대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: CO<sub>2</sub> 레이저창상 치유Fibronectin.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The CO2 laser is commonly used in the oral cavity and pharyngolaryngeal lesion, since, unlike the conventional scalpel technique, it provides excellent hemostasis and visualization and thus enables the surgeon to operate in a precise manner. Additional advantages include decreased postoperative pain and less swelling. Despite this advantage, several studies have reported impaired wound healing associated with the use of CO2 laser. Fibronectin is a high molecular weight glycoprotein and serves as a substrate for adhesion and migration of cells which repair cell defects together with fibrin. Fibronectin is involved in the generation of reticulin matrix together with the type III collagen.
MATERIALS AND METHODS:
The histological changes and the expression of fibronectin activities following incision of tongue mucosa by the CO2 laser and the conventional scalpel technique were compared over a period of 7 days in a rat model.
RESULTS:
A delay was noted in the healing of the CO2 laser wound. Both CO2 laser and scalpel wound expressed fibronectin, soon after wounding. The expression of fibronectin activities in the CO2 laser rose to the maximal level more slowly than the scalpel wound and its degree was weaker.
CONCLUSION:
Delayed expression in fibronectin may play a role in the delay of the CO2 laser wound healing.
Keywords: CO2 laserWound healingFibronectin

서     론

   

   구강 및 인두 병변에 CO2 레이저의 사용은 우수한 지혈 기능과 이로 인한 시야 확보로 정확한 절제가 가능하고 술 후 통증 및 부종이 심하지 않는 장점이 있어 임상에서 자주 사용된다. 그러나 여러 연구에서 CO2 레이저에 의한 창상 치유에 있어서는 메스에 의한 창상에 비해 지연된다고 알려져 있다.1-6)
Fibronectin(FN)은 고분자량의 당단백질로 창상 치유 과정에서 fibroblast와 결합하여 fibrin과의 상호 작용을 가능하게 하며 상피 세포의 증식과 이동을 증진시킨다.7-10) 또한 제
III 형 collagen과 함께 육아 조직의 형성에도 관여한다.11-13) Fibronectin은 창상 치유가 시작되면 증가하고 일단 상피화가 이루어지게 되면 감소하게 된다.10)11)14)
   본 연구의 목적은 CO2 레이저에 의한 설점막 창상의 치유 과정을 동물 모델을 이용하여 조직학적으로 관찰하고 창상 치유 과정에 중요한 역할을 하는 fibronectin의 발현 정도를 알아보고자 이 연구를 시도하였다.

재료 및 방법

실험 재료

   실험 동물은 체중 250~300 g 내외의 건강한 30마리의 수컷 Sprague-Dawley 흰쥐를 사용하였으며 물은 제한없이 공급하였다. 이 중 6마리를 비교군으로 하고 나머지는 실험군으로 하여 레이저 조사 직후 12시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 경과군으로 분류하였다.

방  법

   모든 동물의 전신 마취는 ketamin(50 ml/kg)과 Rompun®(10 ml/kg)을 사용하여 체중에 따라 복강 주사로 하였다. 사용된 CO2 레이저는 Sharplan Model 1055S였으며, 사용 방법은 0.5 second의 single pulse로 10 W를 쥐의 혀의 등쪽 끝에 1회 조사하였다. focusing mode로 spot size는 0.6 mm이였고 working distance는 400 mm이었다. 비교군은 15번 메스를 이용하여 같은 부위에서 5×2×2 mm의 설 점막을 절제하였다. 조작 후 경과 시간에 따라 12시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 경과 후 희생시켜 혀를 적출하였다. 이후 4°C의 10% NBF(neutral blue formalin)에 하룻밤 고정하고 파라핀 블록을 제작하였으며 6 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다.

Fibronectin에 대한 면역조직 염색

   Fibronectin의 분포 및 형성 정도를 면역 염색법으로 관찰하기 위하여 절취한 혀를 10% NBF 용액에 고정하고 6 μm의 파라핀 절편을 제작하고 염색을 시작하였다. 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 후 tris buffered saline(TBS) 용액에 세척하고 2~3% H2O2 methanol 용액에 5분간 반응시킨 다음 TBS 및 0.5% trypsin 용액에 37°C에서 15분간 적용하였다. 일차 항체는 rat의 fibronectin에 대한 rabbit anti-rat polyclonal antibody(Chemicon Int. Co.)를 1:500으로 희석하여 37°C에서 90분간 반응시켰으며 TBS로 세척하고 이차 항체(biotinylated goat anti rabbit IgG, Vectastain, USA)를 30분간 반응시킨 후 TBS로 세척하고 ABC(avidin-biotin, complex, Vectastain, USA) kit로 30분간 반응시키고 TBS에 세척하였다. 발색은 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 이용하였으며 1% methylene blue로 대조 염색 후 탈수, 청명 후 봉입하고 광학 현미경으로 관찰하였다. 정상 설조직의 결체 조직에 대한 면역 조직 반응 정도를 중등도의 양성 반응으로(Fig. 2-2) 보고 이와 비교하여 미약한 양성 반응(±), 경도의 양성 반응(+), 중등도의 양성 반응(++)과 강한 양성 반응(+++)으로 구분하였다.

결     과

상처 치유 과정의 조직학적 변화
   CO2 레이저에 의한 창상 부위는 비교군에 비해 염증 세포 침윤 및 육아조직 형성이 적었다. 창상 부위의 상피 재생은 비교군의 경우 술 후 2일 째 관찰되기 시작하였으나(Fig. 4-11) CO2 레이저에 의한 창상의 경우 술 후 3일부터 관찰되었다(Fig. 5-17). 비교군의 경우 술 후 5일 째 상피 재생이 완전히 이루어지고(Fig. 6-19) 술 후 7일 째에는 거의 정상 설조직에 가까울 정도로 복원되었다(Fig. 7-23). CO2 레이저에 의한 창상은 술 후 7일째에는 상피 재생이 완전히 이루어졌으나 유두 등의 발달이 미약한 상태였다(Fig. 7-25).

Fibronectin 활성도
   Fibronectin에 대한 양성 반응은 갈색으로 나타나며 이러한 양성 반응은 혈관, 근내막(endomysium)과 근주위막(perimysium) 주위의 상피하 기저막 (subepithelial basement membrane)에서 관찰되었다. CO2 레이저에 의한 창상와 비교군 모두 술 후 12시간부터 창상 부위에 미약하게 fibronectin이 발현되었다(Fig. 2-4 and 6). 이후 창상 치유가 진행되면서 점차 증가하여 비교군에서는 술 후 3일 및 5일에서 강한 양성 반응으로 활성도가 가장 높게 나타났으며(Fig. 5-16 and 6-20) CO2 레이저에 의한 창상의 경우 술 후 5일에 비교군의 경우보다 정도는 약하지만 중등도의 양성 반응으로 활성도가 가장 높게 나타났다(Fig. 6-22). 상피 재생이 완성되면서 점차 감소하여 비교군의 경우 술 후 7일 군에서는 중등도의 양성 반응을 CO2 레이저의 경우 경도의 양성 반응을 보였다(Table 1). Fibronectin은 초기에는 창상 부위의 기저부 육아조직에서 나타나다가 CO2 레이저의 경우 5일 군에서(Fig. 6-22) 그리고 대조군에서는 7일 군에서부터 상피층에서도 관찰되었다(Fig. 7-24).

고     찰


  
CO2 레이저는 1964년 Bell 연구소에서 개발된 이래 여러 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 전자파 스펙트럼 중 적외선 부위에 해당되는 10.6 ㎛ 파장의 빛을 방사하며 물에 잘 흡수된다. CO2 레이저에 의한 조직 절개는 조직 내 수분의 순간적인 증발에 의해서 가능하다. 즉 CO2 레이저가 조직에 조사되면 거의 완전히 흡수되어 열에너지로 변환된다. 조직의 대부분은 액체 성분으로 되어 있으므로 열에너지에 의해서 조직 내 수분은 순간적으로 증발하여 조직 결손이 생기게 된다. 레이저 광선을 초점에 맞추어(focusing mode) 조사하면 조직 절개 및 절제가 가능하고 초점을 흐리게 하면(defocusing mode) 보다 넓은 부위에 레이저가 조사되어 단위 면적 당 에너지가 감소되어 조직 응고가 일어난다.
   구강 부위와 같이 혈관이 많은 부위의 병변을 메스로 절제할 경우 출혈의 위험이 따르게 된다. 특히 항응고제 치료를 받고 있거나 혈소판 기능을 억제하는 아스피린이나 비스테로이드성 항염증제를 투약하고 있는 환자에서는 더욱 그러하다.
CO2 레이저는 직경이 0.5 mm까지의 혈관을 봉인하여 비교적 출혈이 없는 상태에서 절제가 가능하게 한다. 또한 신경 말단을 봉인하여 술 후 통증이 적고 임파선도 봉인하여 부종도 덜하며 혈관과 임파선의 봉인으로 종양 수술 시 종양세포의 파종 위험을 감소시킬 수 있다. 
   Hall1)은 쥐 실험에서
CO2 레이저에 의한 창상 치유가 메스에 의한 창상보다 지연된다고 하였다. Buell과 Schuller3)CO2 레이저에 의한 창상이 술 후 3주간은 메스에 의한 창상에 비해 긴장력(tensile strength)이 약하지만 결국은 같아진다고 하였다. Moreno 등5)CO2 레이저에 의한 창상 치유가 지연됨은 상피 이동의 시작이 지연되어서이지 상피 이동 속도가 감소되어서 나타나는 것은 아니라고 하였다. 즉 일단 상피 이동이 시작되면 메스에 의한 창상과 같은 속도로 진행된다고 하였다. 본 실험에서도 CO2 레이저에 의한 창상이 일반 메스에 의한 창상보다 그 치유가 연장되었다. CO2 레이저에 의한 창상 치유 지연은 주위 조직에 대한 열손상에 의해 일어나는 것으로 보고 있다.4)15) 결체 조직의 열손상으로 생성된 괴사 조직이 분해되는 데 염증 세포의 활성이 더 오래 필요하다. 또한 레이저에 의해 미세 혈관의 손상으로 창상 치유에 필요한 영양분이나 혈장 성분, 그리고 염증세포들이 창상 부위에 잘 도달하지 못하여 창상 치유가 지연되는 것으로 설명하는 보고 있다.14)15) 이러한 열손상 범위를 감소시키기 위해 continuous mode보다는 레이저 pulse length를 감소시킨 superpulse mode를 사용하여 창상 치유 지연 정도를 감소시킨 보고도 있다.15)
   Fibronectin은 분자량이 220,000~250,000의 두 개의 아단위가 산성의 pH (5.5~6.0)에서 황화 결합에 의해 형성된 중합체이다.7)8) FN은 혈장에 존재하는 혈장형(pFN)과 조직 내 여러 세포에서 만들어지는 조직형이 있다.10) FN은 창상 부위에 즉시 나타나 결손 부위를 복원하기 위한 세포의 부착과 이동에 매개체로 작용하게 되고 창상 치유가 이루어지게 되면 사라지게 된다.9-11)
   창상이 생기면 상피 세포가 창상 부위로 이동하게 되고 치유 중인 상피 아래로 육아 조직이 형성되며 새로운 혈관이 형성된다.10)11) 창상 치유과정의 초기에 발현되는 FN은 주로 pFN으로 이는 손상 당한 혈관으로부터 유리된다. 후기에 발현되는 FN은 섬유 모세포 및 상피세포에서 만들어진다.10) FN은 섬유 모세포가 육아 조직으로 이동하는데 관여하며 또한 제
III 형 collagen과 함께 육아 조직의 망상형 간질(reticulin matrix)을 형성하는 데에도 관여한다.11-13) 성숙된 육아 조직의 제 III 형 collagen의 fibrillogenesis에도 관여한다.12)
   본 연구에서는
CO2 레이저에 의한 창상이나 메스에 의한 창상 모두 FN이술 후 즉시 나타났으나 이후 창상 치유가 진행되면서 CO2 레이저의 경우 술 후 5일에, 메스에 의한 창상의 경우 술 후 3일과 5일에 최대로 발현되다가 이후 감소하였다. CO2 레이저에 의한 창상은 일반 메스에 의한 창상에 비해 더 늦게 최고치에 도달하고 전반적으로 발현 정도도 낮아 이것이 CO2 레이저에 의한 창상 치유가 지연되는데 어느 정도 관여하였을 것으로 사료된다. 또한 레이저에 의해 혈관이 봉인되고 혈장 및 조직액이 증발되어 창상 치유 초기에 중요한 역할을 담당하는 pFN의 양이 적고, 주위 조직의 열손상으로 섬유 모세포 및 상피세포에 의한 FN의 합성이 감소되어서 CO2 레이저에 의한 창상에서 FN의 발현도가 낮아지게 된 것으로 사료된다.

결     론


   구강 및 인·후두 병변에 흔히 이용되고 있는 CO2 레이저를 실험 동물을 이용하여 고식적인 메스에 의한 방법과 창상 치유 과정을 비교한 결과 CO2 레이저에 의한 창상이 일반 메스에 의한 창상보다 그 치유가 지연되었다. 창상 치유 과정에 중요한 역할을 담당하는 Fibronectin의 발현에 있어서는 일반 메스에 의한 창상에서와 같이 술 후 즉시 나타났으나 더 늦게 최고치에 도달하고 전반적으로 발현 정도도 낮아 이것이 CO2 레이저에 의한 창상 치유가 지연되는 데 어느 정도 관여하였을 것으로 사료된다.


REFERENCES
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