서     론

   Cyclin과 cyclin-dependent kinase(CDK) 복합체는 세포 주기(cell cycle)의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 이러한 cyclin-CDK 복합체는 주로 세포 주기 진행을 억제하는 여러 cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKI)에 의해 조절되고 있다. 일반적으로 CDKI는 구조적, 기능적 특성에 따라 INK4군과 Cip/Kip군의 두 군으로 나뉠 수 있는 데 INK4군은 p16^INK4A, p15^INK4B과 p18^INK4C가 포함되며 주로 cyclin D-CDK4/6 복합체를 억제한다고 알려져 있다.³⁾ Cip/Kip군에는 p21^WAF1/CIP1, p27^Kip1과 p57^Kip2이 있으며 cyclin D-CDK4/6, cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2와 같은 다양한 cyclin-CDK 복합체를 억제한다.⁴⁾ p27^kip1은 처음에 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor(TGF)-β)나 접촉 억제(contact inhibition)의 자극에 의한 cyclin E-CDK2 복합체와 결합된 비활성인 형태로 발견되었고 주 역할은 세포 주기의 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 CDKI로 알려져 있다.^4-6) 이전의 보고에 의하면 여러 암종에서 종양의 진행과 생존율에 대하여 p27^Kip1 발현이 역 상관 관계를 보이며 또한 고 등급(high grade)의 종양시 p27^Kip1이 감소된다고 하였다.^7-10) Ki-67은 G0기를 제외한 세포 주기의 모든 기에서 발현되는 핵내의 항원으로 지금까지 세포의 증식능을 가장 잘 표지하는 것으로 알려져 있으며 여러 종양에서 예후를 판단하는데 도움을 주어왔다.¹¹⁾¹²⁾ 두경부 악성종양 중 타액선 종양은 그 발생학적 기원의 차이에 따라 다양한 조직학적 특성을 나타내며 그에 따라 그 예후도 다양한 것으로 보고되고 있다. 점액표피양암종은 가장 흔한 타액성 종양으로 그 조직학적 아형에 따라 다양한 임상 양상을 가지며 고 등급 종양일수록 빈번한 국소 재발 및 전이의 소견을 보여 50%미만의 5년 생존율을 보이게 된다.¹³⁾ 이에 저자들은 타액선에서 발생되는 점액표피양암종에 있어서 조직학적 아형과 T 분류, 신경주위 침습, 림프절 전이 및 병기와 생존율에 따른 p27^Kip1과 Ki-67의 표지지수(labeling index, 이하 LI로 약함) 차이를 구하여 p27^Kip1과 Ki-67이 점액표피양암종의 예후인자로서의 효용 가치가 있는지 살펴보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상

   1992년부터 1998년까지 본원 이비인후-두경부외과에서 점액표피양암종으로 진단받고 방사선 및 화학적요법을 시행받지 않고 수술적 치료를 받은 총 31명의 환자를 대상으로 하였다. 남자 16명, 여자 15명이며 연령분포는 16세에서 75세로 평균 연령은 51.2세이었다. 각 환자는 저 등급, 중 등급, 고 등급의 세군으로 조직학적 아형 분류를 하였고 T 분류와 림프절 전이 유무 및 병기 구분은 1997년 AJCC(American Joint Committee on Cancer)의 분류¹⁴⁾에 의해 구분하였다(Table 1).

방   법

 면역조직화학적 검사

   각 환자의 파라핀 포매조직을 5 μm의 두께로 연속절편을 만들어 avidin-biotin-immunoperoxidase complex 방법을 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. Xylene으로 5분간 3회 탈파라핀화 시킨 후 100%, 90%, 80%, 70%의 알코올로 1분씩 처리 후 증류수에 함수화 하였다. 10 mM/L citrate buffer (citric acid 4.2 gm+D.W 2L+2M NaOH 25 cc, pH 6.0)에 담근 상태에서 120°C, 10분간 autoclave한 후 실온에 10분간 방치하였다. 내인성 과산화효소를 억제하기 위하여 3% 과산화수소수로 15분간 처리한 후 인산완충식염수(phosphate buffered saline, pH7.6, 이하 PBS로 약함)로 5분간 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% 정상 염소 혈청에서 20분간 배양하고, PBS로 10분간 3회 세척한 후에 일차항체인 p27^Kip1 mouse monoclonal 항체(1:50, Transduction Laboratories, Lexington, KY)와 Ki-67 mouse monoclonal 항체(MIB-1, 1:50, Immunotech, Marseilles, France)로 실온에서 50분간 반응시켰다. 상온에서 PBS에 10분간 3회 세척하고 2차 항체인 horseradish peroxidase에 결합된 biotinylated antimouse immunoglobin과 streptovidin (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 상온에서 30분간 반응 후 PBS에 세척한 후 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)로 10분간 발색시킨 후 PBS에 5분간 세척하였다. Harris Hematoxylin으로 대조염색한 후 탈수 및 permount로 봉입하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 음성 대조군은 p27^Kip1, Ki-67에 대한 일차항체 대신 PBS로 대치시키고 나머지 방법은 같은 방법으로 시행하였다.

p27^Kip1과 Ki-67의 판독 및 통계학적 검증
   p27^Kip1과 Ki-67의 LI는 모든 종양세포에 대한 p27^Kip1과 Ki-67에 양성 반응을 보이는 핵을 가진 세포의 백분율로 하였으며 최소한 10군데에서 400배 시야에서 1000개 이상의 세포를 관찰하였다. 결과의 통계처리는 Windows용 SPSS 7.5 program을 사용하였다. 환자의 임상적 특징(신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이, 병기)과 p27^Kip1 및 Ki-67의 통계학적 검증은 Mann-Whitney test로 하였으며 조직학적 아형과의 관계는 Kruskal-Wallis test로 검증하였다. 또한 p27^Kip1과 Ki-67에 대한 일치성 유무여부는 Spearman's rank correlation coefficient를 이용하였다. 생존율은 Kaplan-Meier법에 따른 누적 생존율을 구하여 log rank test로 비교하였다. 다변량 분석은 Cox's proportional hazard model을 적용하여 독립적인 예후인자를 확인하였다. 통계학적인 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우로 하였다.

결     과

조직학적 아형과 p27^Kip1 , Ki-67의 상관관계

   저 등급의 점액표피양암종에서 p27^Kip1 LI는 76.7±17.0, 중 등급에서는 43.2± 14.7, 고 등급은 6.6±4.0으로 등급이 높을수록 표현이 감소하는 것을 보였다(Table 2, Fig. 1A, 2B, 3B). 반면에 Ki-67 LI는 저 등급, 중 등급, 고 등급에서 각각 2.4±1.5, 8.0±4.7, 48.4±14.9로 등급에 따라 증가하는 양상을 보였다(Table 2, Fig. 1B, 2B and 3B).

종양의 크기, 림프절 전이, 신경주위 침습 및 병기와 p27^Kip1 , Ki-67의 상관관계(Table 2)

   T3, T4에서의 p27^Kip1 LI는 11.5±12.7로 T1,T2의 50.0±28.4보다 감소된 결과를 보였으며 Ki-67 LI는 각각 39.4±19.9, 13.4±19.6으로 유의하게 증가되었다. 또한 림프절에 전이된 군에 있어서는 p27^Kip1이 7.9±5.3, Ki-67이 45.0±21.5인 반면 전이가 없었던 군에서는 각각 53.6±25.8, 9.4±11.8로 T 분류와 같은 결과를 보였다. 그러나 신경주위 침습에 있어서는 침습된 군에서는 p27^Kip1이 21.3±33.2, Ki-67이 25.5±18.3였고 침습이 없었던 군에서는 각각 43.0±28.8, 19.8±23.9로 위 두 결과와 비슷하였으나 통계학적 유의성은 없었다. 3기와 4기의 고 병기 환자군에서 p27^Kip1이 10.2±10.6, Ki-67이 40.0±21.4, 1기와 2기의 저 병기 환자군에서 p27^Kip1이 62.4±18.4, Ki-67이 5.3±4.4로 병기가 높을수록 p27^Kip1이 감소되고 Ki-67이 증가되었다.

p27^Kip1과 Ki-67의 상관관계

   각 조직학적 아형에 따라 고 등급일수록 p27^Kip1이 감소되고 Ki-67이 증가되어 반비예하는 일치성의 결과를 보였다(correlation coefficient= -0.797, p<0.05).

생존율 분석

   p27^Kip1과 Ki-67 LI의 각각의 평균값인 38.8과 20.9를 기준으로 그 값보다 높은 군을 고 p27군과 고 Ki-67군으로 하였으며 낮은 군을 저 p27군과 저 Ki-67군으로 하여 Kaplan-Meier법에 따라 누적 생존율을 구하여 통계처리하였다. 고 p27군인 경우 5년 생존율이 88.9%로 저 p27군의 42.9%보다 유의하게 높았다(Fig. 4). 또한 저 Ki-67군에서는 5년 생존율이 90.0%, 고 Ki-67군은 27.3%로 역시 유의한 차이를 보였다(Fig. 5). 점액표피양암종 환자의 성별, 연령별, 종양의 크기, 림프절전이, 병기와 p27^Kip1, Ki-67를 대상으로 다변량 분석을 시행한 결과 연령과 림프절전이를 제외한 다른 모든 변수들이 독립적인 예후인자였다(Table 3).

고     찰

   타액선에서 기원하는 점액표피양암종은 단일한 조직학적인 체계를 이루지 못하여 그 임상적인 양상을 예측하기 어려운 경우가 많다. 주로 예후를 예측하는 인자로는 등급 체계에 의해 많은 영향을 받는 것으로 되어 있으며 그에 따른 국소 및 원격 전이의 위험도의 차이를 보인다. 즉 고 등급의 조직학적 특성을 보이는 종양은 주로 90% 이상이 비분화된 세포로 구성되어 있어 점액분비 세포가 50% 이상으로 구성되어 있는 저 등급 종양보다 빈번한 재발 및 낮은 생존율을 보이는 것으로 되어있다.¹³⁾ 또한 종양의 크기, 림프절 전이와 신경주위 침습여부, 병기등이 예후를 예측할 수 있는 임상적 인자로 여겨져 왔으나 최근 다양한 암 억제 및 유발인자의 발견으로 인하여 암 세포의 생물학적 특성을 어느 정도 이해할 수 있어 종양의 진행과 예후를 예측하는 데 많은 도움을 주고 있다.
   p27^Kip1은 핵내의 세포 주기에 관여하는 다양한 cyclin-CDK복합체 특히 cyclin E-CDK2복합체와 결합하여 CDK의 활성도를 약화시키는 CDKI로 알려져 있으며 G1기의 진행을 억제하여 세포 주기를 정지시킨다.⁶⁾ 따라서 p27^Kip1표현의 감소는 이런 억제 작용의 감소로 인하여 급격한 종양의 성장을 가져오게 되어 원발 병소의 종양의 크기 뿐만 아니라 국소 및 원격 전이의 빈도를 증가시킬 것으로 예상되어 암 억제 물질로 생각되고 있다. 이전의 보고에 의하면 유방암,⁷⁾ 대직장암,⁷⁾ 폐암,⁸⁾ 전립선암⁹⁾과 구강암¹⁰⁾에서 p27^Kip1의 표현 양상이 악성도의 정도와 반비예한다고 하였으며 따라서 p27^Kip1의 감소는 종양의 진행과 침습에 관련이 있다고 생각된다. 본 연구에서도 저 등급보다 고 등급일수록 p27^Kip1의 표현이 뚜렷이 감소되는 것을 볼 수 있었으며 또한 종양의 크기가 클수록, 림프절 전이가 있는 경우와 고 병기의 종양일수록 p27^Kip1이 감소되어 이전의 보고와 일치되는 소견을 얻었다. 그러나 신경주위 침습은 전체 31예 중 6예만이 침습 소견을 보여 통계학적 유의성을 얻지는 못하였다.
   Ki-67은 종양의 증식비를 측정할 수 있는 가장 신뢰할 수 있는 표지자로 알려져 왔으며¹¹⁾¹²⁾ 본 실험에서도 고 등급의 종양에서 저 등급에서 보다 Ki-67의 표현이 증가하여 조직학적 소견 상 비분화성 세포의 양상을 보여 급격한 종양의 성장을 예견할 수 있는 고 등급 종양의 특성과 일치한다고 생각된다. 악성 림프종,¹⁵⁾ 구강암,¹⁰⁾ 비소세포성 폐암⁸⁾과 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선등의 내분비계 종양¹⁶⁾등에서는 Ki-67 표현 양상의 증가가 p27^Kip1의 감소와 관련을 보인 반면 유방암¹⁷⁾과 대직장암¹⁸⁾에서는 그러한 연관을 보이지 않았다. 본 연구에서는 전자의 보고와 같이 Ki-67의 표현이 증가할수록 p27^Kip1의 표현이 감소하였는데 연속된 절편에 각각을 염색하여 같은 부위를 확인하여 그러한 결과를 알 수 있었다. 그러나 Ki-67은 G0를 제외한 모든 기에서 발현되기 때문에 Ki-67 발현의 감소가 G1기에서만 세포 주기를 억제시키는 p27^Kip1 발현의 증가와 직접적인 관련이 있다고는 생각하기 힘들다. 세포의 증식에는 여러 다른 cyclin, CDK와 CDKI의 상호 작용에 의존하므로 p27^Kip1 단독으로 증식능을 예측하기는 어려우며 다른 세포 주기 억제 물질에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
   Kaplan-Meier법과 Cox proportional hazard model에 모두 p27^Kip1과 Ki-67은 점액표피양암종 환자의 예후와 밀접한 관련이 있는 것을 확인할 수 있었다. 평균생존 기간이 고 p27군에서는 71개월로 저 p27군의 30개월 보다 두배 이상 차이를 보였으며 또한 5년 생존율에서도 두배 이상의 차이를 보였다. 또한 저 Ki-67군에서는 평균 생존기간이 67개월이었고, 고 Ki-67군에서는 19개월의 생존기간으로서 마찬가지로 두배 이상의 5년 생존율의 차이를 보여 p27^Kip1와 Ki-67이 점액표피양암종의 예후인자로 유용할 것으로 생각된다.
   Kawamata등¹⁹⁾은 p27^kip1이 p16이나p21등의 다른 CDKIs와는 달리 여러 암종에 있어서 유전자의 탈락이나 점 변이등 유전자의 결함을 찾을 수 없다고 하였다. 그러나 다른 대부분의 연구 결과는 주로 p27^Kip1의 단백량을 결정하는 요인은 ubiquitin-mediated proteasomal proteolysis에 의한다고 하여¹⁸⁾²⁰⁾ 한 종양에 있어서 일정량의 p27Kip1의 발현이 나타나는 것이 아니라 종양의 분화 및 침습 정도, 병기, 재발등의 환자의 임상양상에 따라 p27^Kip1의 발현에 차이가 날 수 있다. 본 연구에서도 재발로 인하여 4차예의 수술을 받고 생존해있는 중 등급의 환자에서 염색이 가능했던 3개의 파라핀 포매조직을 분석한 결과 1995년 처음 수술시의 p27^Kip1 LI가 0.5로 고 등급경향을 보였으나 1996년에는 7.5로 1997년에는 22.8로 증가된 것을 관찰하여 그러한 사실을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 이러한 p27^Kip1의 생성과 분해를 조절하는 기전에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   점액표피양암종이 고 등급일수록, 종양의 크기가 클수록, 양성림프절 전이가 있고 고 병기인 환자의 경우 p27kip1 표현의 감소와 Ki-67표현의 증가를 보여 p27kip1와 Ki-67의 표현이 점액표피양암종의 진행과 악성도를 예측하는 표지자로 활용될 수 있을 것으로 생각되며 예후 인자로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

1. Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer II: cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell 1994;79:573-82.

2. Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science 1996;274:1672-7.

3. Hirai H, Roussel MF, Kato JY, Ashmun RA, Sheer CJ. Novel INK4 proteins, p19 and p18, are specific inhibitors of the cyclin D-dependent kinases CDK4 and CDK6. Mol Cell Biol 1995;15:2682-8.

4. Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, Koff A, Roberts JM, Tempst P, et al. Cloning of p27, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell 1994;78:59-66.

5. Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, Sherr CJ, Massague J, Roberts JM, et al. p27, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-β and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev 1994;8:9-22.

6. Sheer CJ, Roberts JM. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinase. Genes Dev 1995;9:1149-63.

7. Fredersdorf S, Burns J, Milne AM, Packham G, Fallis L, Gillett CE, et al. High level expression of p27^kip1 and cyclin D1 in some human breast cancer cells: Inverse correlation between the expression of p27^kip1 and degree of malignancy in human breast and colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:6380-5.

8. Kawana H, Tamaru JI, Tanaka T, Hirai A, Saito Y, Kitagawa M, et al. Role of p27^kip1 and cyclin-dependent kinase 2 in the proliferation of non-small cell lung cancer. Am J Pathol 1998;153:505-13.

9. Tsihlias J, Kapusta LR, DeBoer G, Morava-Protzner I, Zbieranowski I, Bhattacharya N, et al. Loss of cyclin-dependent kinase inhibitor p27^kip1 is a novel prognostic factor in localized human prostate adenocarcinoma. Cancer Res 1998;58:542-8.

10. Jordan RCK, Bradley G, Singerland J. Reduced levels of the cell-cycle inhibitor p27 (Kip1) in epithelial dysplasia and carcinoma of the oral cavity. Am J Pathol 1998;152:585-90.

11. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker HH, Schwab U, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984;133:1710-5.

12. Choi G, Yoo KM, Yoo DH, Chae SW, Jung KY, Choi JO. Ki-67 index in the head and neck squamous cell carcinomas and tumor adjacent epithelia. Korean J Otolaryngol 1998;41:760-6.

13. Alvi A, Myers EN, Carrau RL. Malignant tumors of the salivary glands. In: Myers E N, Suen JY, editors. Cancer of the head and neck. Philadelphia: Saunders Publishers, 1996:532-4.

14. Flemming ID, Cooper JS, Henson DE, Hutter RVP, Kennedy BJ, Murphy GP, et al. AJCC cancer staging manual. Philadelphia New York: Lippincott-Raven Publishers, 1997:53-8.

15. Sanchez-Beato M, Saez AI, Martinez-Montero JC, Mateo MS, Sanchez-Verde L, Villuendas R, et al. Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 (KIP1) in lymphoid tissue: p27 (KIP1) expression is inversely proportional to the proliferative index. Am J Pathol 1997;151:151-60.

16. Lloyd RV, Jin L, Qian X, Kulig E. Aberrant p27kip1 expression in endocrine and other tumors. Am J Pathol 1997;150:401-7.

17. Tan P, Cady B, Wanner M, Worland P, Cukor B, Magi-Galluzzi C, et al. The cell cycle inhibitor p27 is an independent prognostic marker in small (T_1a, _b) invasive breast carcinomas. Cancer Res 1997;57:125 9-63.

18. Loda M, Cukor B, Tam SW, Lavin P, Fiorentino M, Draetta GF, et al. Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent inhibitor, p27, in aggressive colorectal carcinomas. Nat Med 1997;3:227-30.

19. Kawamata N, Morosetti R, Miller CW, Park D, Spirin KS, Nakamaki T, et al. Molecular analysis of the cyclin dependent kinase inhibitor gene p27kip1 in human malignancies. Cancer Res 1995;55:22 66-9.

20. Pagano M, Tam SW, Theodoras AM, Beer-Romero P, Sal GD, Chau V, et al. Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin- dependent kinase inhibitor p27. Science1995;269:682-5.