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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 43(1); 2000 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(1): 45-50.
p27(Kip1) and Ki-67 Expression in Mucoepidermoid Carcinoma.
Choong Sik Choi, Geon Choi, Jae Joon Song, Kwang Yoon Jung, Jong Ouck Choi, Yang Seok Chae, Jong Sang Choi
1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea.
2Department of Pathology, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea.
점액표피양암종에서의 p27<sup>Kip1</sup> 및 Ki-67 표현 양상에 관한 연구
최충식1 · 최 건1 · 송재준1 · 정광윤1 · 최종욱1 · 채양석2 · 최종상2
고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;해부병리학교실2;
주제어: p27<sup>Kip1</sup>Ki-67점액표피양암종.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
p27(Kip1), novel cyclin-dependent kinase inhibitor plays an important role in the inhibition of cell cycle progression by binding to the cyclin E/cyclin-dependent kinase (CDK) 2 complex. And a nuclear antigen Ki-67, expressed in all phases of cell cycle except G0, is a reliable cellular proliferative index. The present study investigated p27(Kip1) and Ki-67 expressions in mucoepidermoid carcinoma for their usefulness of indicator in tumor progression, aggressiveness and prognosis.
MATERIALS AND METHODS:
Formalin-fixed paraffin-embedded surgical specimens were obtained from patients with mucoepidermoid carcinoma. We performed immunohistochemical staining with p27(Kip1) and Ki-67 monoclonal antibodies and compared its labeling index with patients' clinicopathologic characteristics and survival rates.
RESULTS:
There was significant correlation between low p27(Kip1), high Ki-67 expression and high grade, large tumor size, positive nodal status and high stages. Also, Ki-67 expression showed significant inverse correlation with p27(Kip1) expression and there were high survival rates in high p27(Kip1) and low Ki-67 patients. CONCLUSIONS: Therefore, p27(Kip1) and Ki-67 are good and reliable predictive markers of tumor progression, aggressiveness and prognosis in mucoepidermoid carcinomas.
Keywords: p27(Kip1)Ki-67Mucoepidermoid Carcinoma

서     론

 

   Cyclin과 cyclin-dependent kinase(CDK) 복합체는 세포 주기(cell cycle)의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.1)2) 이러한 cyclin-CDK 복합체는 주로 세포 주기 진행을 억제하는 여러 cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKI)에 의해 조절되고 있다. 일반적으로 CDKI는 구조적, 기능적 특성에 따라 INK4군과 Cip/Kip군의 두 군으로 나뉠 수 있는 데 INK4군은 p16INK4A, p15INK4B과 p18INK4C가 포함되며 주로 cyclin D-CDK4/6 복합체를 억제한다고 알려져 있다.3) Cip/Kip군에는 p21WAF1/CIP1, p27Kip1과 p57Kip2이 있으며 cyclin D-CDK4/6, cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2와 같은 다양한 cyclin-CDK 복합체를 억제한다.4) p27kip1은 처음에 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor(TGF)-β)나 접촉 억제(contact inhibition)의 자극에 의한 cyclin E-CDK2 복합체와 결합된 비활성인 형태로 발견되었고 주 역할은 세포 주기의 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 CDKI로 알려져 있다.4-6) 이전의 보고에 의하면 여러 암종에서 종양의 진행과 생존율에 대하여 p27Kip1 발현이 역 상관 관계를 보이며 또한 고 등급(high grade)의 종양시 p27Kip1이 감소된다고 하였다.7-10) Ki-67은 G0기를 제외한 세포 주기의 모든 기에서 발현되는 핵내의 항원으로 지금까지 세포의 증식능을 가장 잘 표지하는 것으로 알려져 있으며 여러 종양에서 예후를 판단하는데 도움을 주어왔다.11)12) 두경부 악성종양 중 타액선 종양은 그 발생학적 기원의 차이에 따라 다양한 조직학적 특성을 나타내며 그에 따라 그 예후도 다양한 것으로 보고되고 있다. 점액표피양암종은 가장 흔한 타액성 종양으로 그 조직학적 아형에 따라 다양한 임상 양상을 가지며 고 등급 종양일수록 빈번한 국소 재발 및 전이의 소견을 보여 50%미만의 5년 생존율을 보이게 된다.13) 이에 저자들은 타액선에서 발생되는 점액표피양암종에 있어서 조직학적 아형과 T 분류, 신경주위 침습, 림프절 전이 및 병기와 생존율에 따른 p27Kip1과 Ki-67의 표지지수(labeling index, 이하 LI로 약함) 차이를 구하여 p27Kip1과 Ki-67이 점액표피양암종의 예후인자로서의 효용 가치가 있는지 살펴보고자 하였다.

대상 및 방법


대  상

   1992년부터 1998년까지 본원 이비인후-두경부외과에서 점액표피양암종으로 진단받고 방사선 및 화학적요법을 시행받지 않고 수술적 치료를 받은 총 31명의 환자를 대상으로 하였다. 남자 16명, 여자 15명이며 연령분포는 16세에서 75세로 평균 연령은 51.2세이었다. 각 환자는 저 등급, 중 등급, 고 등급의 세군으로 조직학적 아형 분류를 하였고 T 분류와 림프절 전이 유무 및 병기 구분은 1997년 AJCC(American Joint Committee on Cancer)의 분류14)에 의해 구분하였다(Table 1).

방   법


 면역조직화학적 검사

   각 환자의 파라핀 포매조직을 5 μm의 두께로 연속절편을 만들어 avidin-biotin-immunoperoxidase complex 방법을 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. Xylene으로 5분간 3회 탈파라핀화 시킨 후 100%, 90%, 80%, 70%의 알코올로 1분씩 처리 후 증류수에 함수화 하였다. 10 mM/L citrate buffer (citric acid 4.2 gm+D.W 2L+2M NaOH 25 cc, pH 6.0)에 담근 상태에서 120°C, 10분간 autoclave한 후 실온에 10분간 방치하였다. 내인성 과산화효소를 억제하기 위하여 3% 과산화수소수로 15분간 처리한 후 인산완충식염수(phosphate buffered saline, pH7.6, 이하 PBS로 약함)로 5분간 3회 세척하였다. 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% 정상 염소 혈청에서 20분간 배양하고, PBS로 10분간 3회 세척한 후에 일차항체인 p27Kip1 mouse monoclonal 항체(1:50, Transduction Laboratories, Lexington, KY)와 Ki-67 mouse monoclonal 항체(MIB-1, 1:50, Immunotech, Marseilles, France)로 실온에서 50분간 반응시켰다. 상온에서 PBS에 10분간 3회 세척하고 2차 항체인 horseradish peroxidase에 결합된 biotinylated antimouse immunoglobin과 streptovidin (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 상온에서 30분간 반응 후 PBS에 세척한 후 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)로 10분간 발색시킨 후 PBS에 5분간 세척하였다. Harris Hematoxylin으로 대조염색한 후 탈수 및 permount로 봉입하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 음성 대조군은 p27Kip1, Ki-67에 대한 일차항체 대신 PBS로 대치시키고 나머지 방법은 같은 방법으로 시행하였다.

p27Kip1과 Ki-67의 판독 및 통계학적 검증
   p27Kip1과 Ki-67의 LI는 모든 종양세포에 대한 p27Kip1과 Ki-67에 양성 반응을 보이는 핵을 가진 세포의 백분율로 하였으며 최소한 10군데에서 400배 시야에서 1000개 이상의 세포를 관찰하였다. 결과의 통계처리는 Windows용 SPSS 7.5 program을 사용하였다. 환자의 임상적 특징(신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이, 병기)과 p27Kip1 및 Ki-67의 통계학적 검증은 Mann-Whitney test로 하였으며 조직학적 아형과의 관계는 Kruskal-Wallis test로 검증하였다. 또한 p27Kip1과 Ki-67에 대한 일치성 유무여부는 Spearman's rank correlation coefficient를 이용하였다. 생존율은 Kaplan-Meier법에 따른 누적 생존율을 구하여 log rank test로 비교하였다. 다변량 분석은 Cox's proportional hazard model을 적용하여 독립적인 예후인자를 확인하였다. 통계학적인 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우로 하였다.


결     과


조직학적 아형과 p27Kip1 , Ki-67의 상관관계

   저 등급의 점액표피양암종에서 p27Kip1 LI는 76.7±17.0, 중 등급에서는 43.2± 14.7, 고 등급은 6.6±4.0으로 등급이 높을수록 표현이 감소하는 것을 보였다(Table 2, Fig. 1A, 2B, 3B). 반면에 Ki-67 LI는 저 등급, 중 등급, 고 등급에서 각각 2.4±1.5, 8.0±4.7, 48.4±14.9로 등급에 따라 증가하는 양상을 보였다(Table 2, Fig. 1B, 2B and 3B).

종양의 크기, 림프절 전이, 신경주위 침습 및 병기와 p27Kip1 , Ki-67의 상관관계(Table 2)

   T3, T4에서의 p27Kip1 LI는 11.5±12.7로 T1,T2의 50.0±28.4보다 감소된 결과를 보였으며 Ki-67 LI는 각각 39.4±19.9, 13.4±19.6으로 유의하게 증가되었다. 또한 림프절에 전이된 군에 있어서는 p27Kip1이 7.9±5.3, Ki-67이 45.0±21.5인 반면 전이가 없었던 군에서는 각각 53.6±25.8, 9.4±11.8로 T 분류와 같은 결과를 보였다. 그러나 신경주위 침습에 있어서는 침습된 군에서는 p27Kip1이 21.3±33.2, Ki-67이 25.5±18.3였고 침습이 없었던 군에서는 각각 43.0±28.8, 19.8±23.9로 위 두 결과와 비슷하였으나 통계학적 유의성은 없었다. 3기와 4기의 고 병기 환자군에서 p27Kip1이 10.2±10.6, Ki-67이 40.0±21.4, 1기와 2기의 저 병기 환자군에서 p27Kip1이 62.4±18.4, Ki-67이 5.3±4.4로 병기가 높을수록 p27Kip1이 감소되고 Ki-67이 증가되었다.

p27Kip1과 Ki-67의 상관관계

   각 조직학적 아형에 따라 고 등급일수록 p27Kip1이 감소되고 Ki-67이 증가되어 반비예하는 일치성의 결과를 보였다(correlation coefficient= -0.797, p<0.05).

생존율 분석

   p27Kip1과 Ki-67 LI의 각각의 평균값인 38.8과 20.9를 기준으로 그 값보다 높은 군을 고 p27군과 고 Ki-67군으로 하였으며 낮은 군을 저 p27군과 저 Ki-67군으로 하여 Kaplan-Meier법에 따라 누적 생존율을 구하여 통계처리하였다. 고 p27군인 경우 5년 생존율이 88.9%로 저 p27군의 42.9%보다 유의하게 높았다(Fig. 4). 또한 저 Ki-67군에서는 5년 생존율이 90.0%, 고 Ki-67군은 27.3%로 역시 유의한 차이를 보였다(Fig. 5). 점액표피양암종 환자의 성별, 연령별, 종양의 크기, 림프절전이, 병기와 p27Kip1, Ki-67를 대상으로 다변량 분석을 시행한 결과 연령과 림프절전이를 제외한 다른 모든 변수들이 독립적인 예후인자였다(Table 3).

고     찰


   타액선에서 기원하는 점액표피양암종은 단일한 조직학적인 체계를 이루지 못하여 그 임상적인 양상을 예측하기 어려운 경우가 많다. 주로 예후를 예측하는 인자로는 등급 체계에 의해 많은 영향을 받는 것으로 되어 있으며 그에 따른 국소 및 원격 전이의 위험도의 차이를 보인다. 즉 고 등급의 조직학적 특성을 보이는 종양은 주로 90% 이상이 비분화된 세포로 구성되어 있어 점액분비 세포가 50% 이상으로 구성되어 있는 저 등급 종양보다 빈번한 재발 및 낮은 생존율을 보이는 것으로 되어있다.13) 또한 종양의 크기, 림프절 전이와 신경주위 침습여부, 병기등이 예후를 예측할 수 있는 임상적 인자로 여겨져 왔으나 최근 다양한 암 억제 및 유발인자의 발견으로 인하여 암 세포의 생물학적 특성을 어느 정도 이해할 수 있어 종양의 진행과 예후를 예측하는 데 많은 도움을 주고 있다.
   p27Kip1은 핵내의 세포 주기에 관여하는 다양한 cyclin-CDK복합체 특히 cyclin E-CDK2복합체와 결합하여 CDK의 활성도를 약화시키는 CDKI로 알려져 있으며 G1기의 진행을 억제하여 세포 주기를 정지시킨다.6) 따라서 p27Kip1표현의 감소는 이런 억제 작용의 감소로 인하여 급격한 종양의 성장을 가져오게 되어 원발 병소의 종양의 크기 뿐만 아니라 국소 및 원격 전이의 빈도를 증가시킬 것으로 예상되어 암 억제 물질로 생각되고 있다. 이전의 보고에 의하면 유방암,7) 대직장암,7) 폐암,8) 전립선암9)과 구강암10)에서 p27Kip1의 표현 양상이 악성도의 정도와 반비예한다고 하였으며 따라서 p27Kip1의 감소는 종양의 진행과 침습에 관련이 있다고 생각된다. 본 연구에서도 저 등급보다 고 등급일수록 p27Kip1의 표현이 뚜렷이 감소되는 것을 볼 수 있었으며 또한 종양의 크기가 클수록, 림프절 전이가 있는 경우와 고 병기의 종양일수록 p27Kip1이 감소되어 이전의 보고와 일치되는 소견을 얻었다. 그러나 신경주위 침습은 전체 31예 중 6예만이 침습 소견을 보여 통계학적 유의성을 얻지는 못하였다.
   Ki-67은 종양의 증식비를 측정할 수 있는 가장 신뢰할 수 있는 표지자로 알려져 왔으며11)12) 본 실험에서도 고 등급의 종양에서 저 등급에서 보다 Ki-67의 표현이 증가하여 조직학적 소견 상 비분화성 세포의 양상을 보여 급격한 종양의 성장을 예견할 수 있는 고 등급 종양의 특성과 일치한다고 생각된다. 악성 림프종,15) 구강암,10) 비소세포성 폐암8)과 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선등의 내분비계 종양16)등에서는 Ki-67 표현 양상의 증가가 p27Kip1의 감소와 관련을 보인 반면 유방암17)과 대직장암18)에서는 그러한 연관을 보이지 않았다. 본 연구에서는 전자의 보고와 같이 Ki-67의 표현이 증가할수록 p27Kip1의 표현이 감소하였는데 연속된 절편에 각각을 염색하여 같은 부위를 확인하여 그러한 결과를 알 수 있었다. 그러나 Ki-67은 G0를 제외한 모든 기에서 발현되기 때문에 Ki-67 발현의 감소가 G1기에서만 세포 주기를 억제시키는 p27Kip1 발현의 증가와 직접적인 관련이 있다고는 생각하기 힘들다. 세포의 증식에는 여러 다른 cyclin, CDK와 CDKI의 상호 작용에 의존하므로 p27Kip1 단독으로 증식능을 예측하기는 어려우며 다른 세포 주기 억제 물질에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
   Kaplan-Meier법과 Cox proportional hazard model에 모두 p27Kip1과 Ki-67은 점액표피양암종 환자의 예후와 밀접한 관련이 있는 것을 확인할 수 있었다. 평균생존 기간이 고 p27군에서는 71개월로 저 p27군의 30개월 보다 두배 이상 차이를 보였으며 또한 5년 생존율에서도 두배 이상의 차이를 보였다. 또한 저 Ki-67군에서는 평균 생존기간이 67개월이었고, 고 Ki-67군에서는 19개월의 생존기간으로서 마찬가지로 두배 이상의 5년 생존율의 차이를 보여 p27Kip1와 Ki-67이 점액표피양암종의 예후인자로 유용할 것으로 생각된다.
   Kawamata등19)은 p27kip1이 p16이나p21등의 다른 CDKIs와는 달리 여러 암종에 있어서 유전자의 탈락이나 점 변이등 유전자의 결함을 찾을 수 없다고 하였다. 그러나 다른 대부분의 연구 결과는 주로 p27Kip1의 단백량을 결정하는 요인은 ubiquitin-mediated proteasomal proteolysis에 의한다고 하여18)20) 한 종양에 있어서 일정량의 p27Kip1의 발현이 나타나는 것이 아니라 종양의 분화 및 침습 정도, 병기, 재발등의 환자의 임상양상에 따라 p27Kip1의 발현에 차이가 날 수 있다. 본 연구에서도 재발로 인하여 4차예의 수술을 받고 생존해있는 중 등급의 환자에서 염색이 가능했던 3개의 파라핀 포매조직을 분석한 결과 1995년 처음 수술시의 p27Kip1 LI가 0.5로 고 등급경향을 보였으나 1996년에는 7.5로 1997년에는 22.8로 증가된 것을 관찰하여 그러한 사실을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 이러한 p27Kip1의 생성과 분해를 조절하는 기전에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.

결     론


   점액표피양암종이 고 등급일수록, 종양의 크기가 클수록, 양성림프절 전이가 있고 고 병기인 환자의 경우 p27kip1 표현의 감소와 Ki-67표현의 증가를 보여 p27kip1와 Ki-67의 표현이 점액표피양암종의 진행과 악성도를 예측하는 표지자로 활용될 수 있을 것으로 생각되며 예후 인자로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다.


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