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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(11); 1999 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(11): 1343-1348.
Histochemical Staining of PetaNADPH Diaphorase in Mongolian Gerbil and CJU/A Mouse Cochleae.
Moo Jin Choo, Jin Sup Kim, Chang Keun Song, See Ok Shin, Hong Ryul Jin
Department of Otolaryngology, Chungbuk National University, College of Medicine, Chonju , Korea. mjchoo@med.chungbuk.ac.kr
Mongolian Gerbil과 CJU/A Mouse의 와우에서 βNADPH Diaphorase의 발현 양상
추무진 · 김진섭 · 송창근 · 신시옥 · 진홍률
충북대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: Nitric oxideNitric oxide synthaseβNADPH diaphorase.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Nitric oxide (NO) is an inorganic, gaseous free radical that carries a variety of messages between cells. The histochemical demonstration of neuronal betaNADPH-d is the demonstration of the presence of NOS. The purpose of this study was to identify the existence of NOS and the difference of the expression of betaNADPH-d in mouse and gerbil cochleae.
MATERIALS AND METHODS:
Each of the eight cochleae of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) and mice (CJU/A) were fixed by cardiac perfusion with 4% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer solution. The en-bloc cochleae were incubated after decalcification, and stained with betaNADPH-d and counterstained with acid fuchsin. The relative intensity of staining was decided in the same location of cochlea.
RESULTS:
Most supporting cells were strongly stained except Claudius cells and Boettcher's cells in gerbil. However, Boettcher's cells were strongly stained in mice. Outer hair cells, inner hair cells, basial membrane and lining cells of spiral limbus were strongly stained. Interdental cells of spiral limbus, inner border cells and intermediate cells of stria vascularis were moderately stained. Tectorial membrane and amorphous layer of basial membrane were not stained.
CONCLUSION:
Using betaNADPH-d staining, this study documents the presence of nitric oxide synthase in mice and gerbil cochleae and the difference of staining between two species.
Keywords: Nitric oxide synthase (NOS)betaNADPH diaphoraseCochlea
서론 Nitric oxide(NO)는 체내에 존재하는 무기 기체유리기로서, 신경 조직이나 신경외조직에서 새로 발견된 세포간 정보전달물질로서 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 합성된다. NO는 신경원과 신경말단에서 확산되어 주위의 신경조직의 활동성을 변화시키고, 흥분성 아미노산 신경전달물질이 과다할 때 세포독성에 관여하는 것으로 생각된다. L-glutamate 같은 흥분성 아미노산은 와우유모세포의 구심성 신경시냅스에서 생성되는 신경전달물질로 생각되고 있고, 흥분성 아미노산은 중추신경계에서 quisqualate /alpha-amino-3-hydroxy-5-met-hylisoxazole-propionic acid(AMPA)와 kainate receptor subtype, 그리고 N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor등을 통하여 작용을 하게되는데, 최근의 연구들은 quisqualate/AMPA와 kainate receptor subtype들의 작용이 NOS에 의해 합성되는 NO에 의해 매개된다고 보고하고 있다.1) 소리의 전달과정은 외이를 통해 중이내의 이소골, 와우, 청신경을 통해 뇌실질로 전달된다. 와우 내에서 소리는 물리적인 전달에서 전기적인 전달로 바뀌며, 이 과정에서 신경전달물질들이 관여하는 것으로 알려져있다. NO도 신경전달물질 중의 하나로 알려지고 있으며 기니픽과 설치류 등에서 나선신경절 세포들에 NO가 존재하는 것으로 알려져있다.2) 또한, 와우는 혈관의 분포가 풍부하여 와우 혈류에 영향을 주는 요인들에 의해서 다양한 반응을 나타내며, 와우 혈류의 감소는 돌발성 난청, 메니에르병 등 내이질환의 원인 중 하나로 알려져있다.3) 와우혈류의 조절은 혈관 내의 기초 NO의 생성에 의하여 조절 받으며 NO가 감소하면 와우혈류가 감소하는 것으로 알려져있다.4) Hope(1991)등은 조직이 paraformaldehyde에 고정되면 NOS를 제외한 모든 NADPH 의존성 효소가 비활성이 되므로 NADPH-d의 조직화학적 검사가 NOS 뉴런을 표시하는데 사용될 수 있다고 하였다.5) 따라서 본 연구에서는 NADPH-d에 선택적으로 NOS 뉴런이 염색되는 것을 이용하여 설치류의 와우에서 NOS의 존재를 간접적으로 증명함으로써 이과분야에서 동물실험에 많이 사용되고 있는 gerbil과 mouse의 와우에서 NO가 신경전달물질 중 하나로 소리의 전기적 전달에 관여하는 것을 확인하고, mouse와 gerbil 와우의 βNADPH-d에 대한 와우내의 각 세포에서의 발현 양상과, 종에 따른 차이가 있는지를 알아보고자 하였다. 대상 및 방법 실험동물은 생후 120일 정도며 몸무게가 70~80 gm 정도되는 Mongolian gerbil과 체중 50~60 gm의 수컷 CJU/A strain mouse를 사용하였다. Pentobarbital sodium을 복강 내 주사하여 전신 마취시킨 후 개흉하여 심장을 노출시키고 좌심실을 통하여 주사바늘(18 G)을 상행대동맥에 삽입하여 유입케하고 우심방을 절제하여 혈액이 유출되게 하였다. 먼저 heparin을 첨가한 생리식염수로 관류하여 혈액을 씻어내고 계속하여 고정액(4% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer solution, pH 7.4)으로 관류고정 시키고 와우를 적출하여 정원창과 난원창막을 제거한 후 골 첨부에 작은 구멍을 만들어 동일한 고정액을 외림프강에 주입하여 고실 내 관류고정을 한 후 동일 고정액에 4℃에서 하룻밤 후고정하였다. 고정된 와우는 인산완충식염수용액(0.1M phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 35% EDTA(ethylene-diaminetetraacetic acid)로 탈회반응을 3일간 시행하고 4℃에서 하루 동안 0.1M PBS으로 세척하였다. 그 다음, 37℃에서 βNADPH diapho-rase 1 mg/ml, 0.1 mg/ml nitroblue tetrazolium(NBT), 0.3% Triton X-100을 포함하는 용액에서 반응시켰다. 30분 후에 와우를 Triton X-100이 없이 βNADPH-d와 NBT이 있는 용액으로 옮긴 후 와우를 37℃에서 흔들면서 2시간 동안 반응시킨 후 pH 7.4의 차가운 0.1 M PBS로 씻어내고 graded aceton과 propylene oxide로 빠르게 탈수시키고 epoxy resin A(Epon-Araldite)에 포매하였다. En-bloc cochlea를 1 내지 2 μm 두께로 자르고 acid fuchsin으로 대조염색하고 광학 현미경(Olympus(r))으로 관찰하였다. 실험에 사용된 용액과 시약들은 모두 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 결과 βNADPH-d에 대한 염색의 강도를 gerbil과 mouse의 각각의 와우에서 동일한 부위를 비교하였다. 상대적인 강도는 염색이 안되었을 경우를 (-), auditory nerve의 염색정도를 (+), 가장 강한 경우를 (+++), 그 중간 정도를 (++)로 하여 표기하였다. Reissner's membrane과 spiral limbus의 lining cell들은 gerbil과 mouse 모두 강하게 염색되었다. 두 종에서 모두 organ of Corti의 외유모세포는 강하게 염색되었고, Deiter's cell은 중등도로 염색되었다(Fig. 1). Gerbil의 내유모세포는 강하게 염색되었고 지지세포에서는 Hensen's cell, tectal cell, pillar cell, inner phalangeal cell의 기저부, inner border cell 등은 강하게 염색되었으나, Claudius cell, Boettcher's cell, 그리고 inner sulcus cell 등은 중등도로 염색되었다. Boettcher's cell은 mouse에서는 외유모세포보다 더욱 강하게 염색되어, gerbil과 많은 차이를 보였다. 그러나 tectorial membrane과 basilar membrane의 amorphous layer는 gerbil과 mouse 모두에서 염색되지 않았다(Fig. 2). 혈관조는 mouse에서는 변연세포와 중간세포에서는 중등도로, 기저세포에서는 약하게 염색되었다. 그러나, gerbil에서는 기저세포와 변연세포에서 강하게 염색되어 차이가 있었으며 혈관내피세포는 강하게 염색되었다(Fig. 3). Spiral ligament cell과 spiral prominence cell, 그리고 external sulcus cell 등은 강하게 염색되었다. 대부분의 청신경섬유와 나선신경절세포의 I형과 II형 세포는 염색이 되지 않거나 매우 약하게 염색되었으나, 전정신경절의 세포들은 강하게 염색되었다(Fig. 4). Mouse의 와우에서 βNADPH-d의 상대적인 강도는 gerbil과 비슷한 양상을 보였으나, 가장 다른 점은 Boettcher's cell과 혈관조의 세포에서의 염색 강도가 차이를 보였다(Table 1). 고찰 NO는 체내에 존재하는 무기 기체유리기로써 매우 불안정하며 반응성이 강한 화학물질이며, 최근 여러 분야에서 독립적인 연구들이 NO의 생물학적 중요성을 밝혀주고 있다.6)7) NO는 혈관에서 아세틸콜린에 의한 혈관확장을 유발시키는 EDRF(endothelium-derived relaxing factor)와 같은 물질로서 혈관을 확장하여 심혈관계에서 중요한 조절인자로 작용하고 또한 혈소판 응집 등에 중요한 역할을 한다.7) 또한, 중추신경계와 말초신경계에서 신경전달물질을 조절하는 작용을 하고,8) DNA의 합성을 억제하여 항미생물작용 및 항암 작용을 나타내며,9) 이외에 호르몬 분비에 관여하는 등6) 여러 가지 다양한 작용을 하는 것으로 알려져있다. NO는 L-arginine을 기질로 하여 NOS에 의해 L-citrulline과 함께 생성된다. NO를 합성하는 효소는 크게 비유발성 NOS(cNOS)와 유발성 NOS(iNOS)로 구분할 수 있다. cNOS는 이미 세포 내에 존재하는 아미노산으로 어떤 자극에 의하여 활성화되는 것이고, iNOS는 자극에 반응하여 새로 합성되는 아미노산이다.6) cNOS에는 neuronal type의 nNOS와 endothelial type의 eNOS가 있으며 이들은 calcium과 calmodulin이 존재하여야 활성화된다. iNOS는 대식세포, 중성구세포와 간세포 NOS등이 있는데, calcium과 calmodulin에는 영향을 받지 않는 것으로 알려져있다.8) NO는 형성되어 확산에 의해 다양한 목표물에 작용할 수 있는데, soluble guanylate cyclase의 구성체인 heme과 결합하여 이 효소의 활성을 증가시킴으로써 세포내 c-GMP의 농도가 증가하여 신경조직과 심혈관계에서 여러 가지 생리학적인 작용을 하게 된다. 세포 독성은 NO가 세포의 Fe-S 아미노산을 저해하며, 핵산의 합성을 저해하고, 핵산과 반응하여 핵산을 파괴하거나 변이를 유발하여 발생한다.6) 와우는 혈관의 분포가 풍부하여 와우 혈류에 영향을 주는 요인들에 의해서 다양한 반응을 나타내며, 와우 혈류의 감소는 돌발성 난청, 메니에르병등 내이질환의 한 원인으로 알려져있다.4) 와우 혈류의 조절은 혈관 내의 기초 NO의 생성에 의하여 조절 받으며 NO가 감소하면 와우 혈류가 감소하는 것으로 알려져있다.5) 본 연구에서도 혈관내피세포는 강하게 염색되었는데 이는 eNOS가 존재하며 와우의 혈류조절에 NO가 관여한다는 증거일 수 있을 것이다. 혈관조세포가 염색되는 것에서 볼 때 앞에서 언급한 바와 같이, cNOS의 주요한 근원이라 생각되며 와우에서의 혈류량 조절에도 NO가 깊이 관여할 것으로 사료된다. 청각 신경계에서 흥분성 아미노산인 L-glutamate는 와우유모세포 구심성신경시냅스의 신경전달물질로 작용하는데,10) 이 흥분성 아미노산은 중추신경계에서 그 작용이 NOS에 의해 생성되는 NO에 의해서 매개되는 것으로 알려져있다.11) Chen 등은(1995) guinea pig의 와우에 NO의 공여체인 sodium nitroprusside(SNP)를 와우내로 확산시킨 후 cochlear microphonics와 summating potential, endocochlear potential, compound action potential을 측정한 결과, 300 μM 이상의 농도에서는 모든 soundevoked response를 감소시키며, 이것은 SNP가 NO를 생성하여 혈관조와 외유모세포를 통해 와우의 기능에 영향을 주었기 때문이라 하였다.12) 최근 Zdanski(1994) 등은 쥐의 와우에서 βNADPH-d를 이용한 면역화학적 염색을 통하여 나선신경절 세포와 와우축의 신경섬유에서 양성표현을 보여 NOS의 존재 가능성을 확인하였으며, 활성화된 NOS의 함유를 보기 위하여 citrullin을 면역조직화학적 염색을 하여 나선신경절 세포에서 활성화된 NOS의 존재를 확인하였다.13) Dawson(1991)등은 NOS에 염색되는 모든 세포들이 NADPH-d에도 염색이 되어 뇌와 말초 조직의 NOS와 NADPH-d는 동일하다고 하였다.13) 본 연구에서 en-bloc cochlea는 βNADPH-d에 염색이 잘 되어 와우에서의 NOS를 확인할 수 있었고, aceton과 propylene oxide로 빠르게 탈수시키고 resin embedding을 하여 현미경으로 구조를 잘 관찰할 수 있었다. 전체적인 양상에서 와우첨부 쪽이 기저부보다 염색 정도가 강하게 염색되었는데 이는 두 가지로 추정해 볼 수 있을 것이다. 첫째는 고정시 와우첨부 쪽에 하나의 구멍을 뚫고 고정액을 주입하였는데, 일반적인 βNADPH 조직화학염색 방법에서는 뼈와 조직에 침투할 수 있는 두께가 비교적 제한되며 기저부에서 뼈와 조직이 더 두터워서 염색 반응이 접촉할 기회가 적었을 가능성이다. 둘째는 와우의 해부학적 구조에서 이해하는 것이다. 와우첨부 쪽으로 갈수록 organ of Corti, 내외유모세포의 크기 및 보조세포들의 크기가 커진다.15) 이들 세포들은 βNADPH에 대해 상대적으로 강하게 염색되므로, 와우첨부 쪽에서 전반적으로 염색 정도가 더 강하다고 생각할 수 있을 것이다. 이러한 현상은 다른 와우 신경전달물질 분포와 synapse에 대해 연구된 결과와는 다르게 나타나 NOS의 종류 및 역할에 대해 더 연구가 필요할 것으로 생각된다.16) Gerbil과 mouse의 와우의 βNADPH-d에 대한 가장 큰 차이점은 Boettcher's cell과 혈관조 세포들이었다. Boettcher's cell에서는 mouse에서 강하게 염색되었으나, gerbil은 중등도로 염색되었다. 또한 혈관조의 세포들은 mouse에서는 변연세포에서 강하게, 중간 세포에서는 중등도로, 기저세포는 약하게 염색되었으나, gerbil에서는 기저세포에서 강하게 염색되어 다른 양상을 보였다. 나선신경절세포는 매우 약하게 염색되었으나 내이도의 전정신경절세포에서는 강하게 염색되었다. 이러한 결과들은 와우내에 종(species)간의 차이와 세포들의 역할이 다를 수 있다는 것을 암시하였다. 결론 Mongolian gerbil과 CJU/A mouse의 와우의 βNADPH-d에 대한 염색 결과, 와우에서 βNADPH-d 발현으로 와우내의 세포에서 NOS가 존재하며, 세포에 따른 차이가 있음을 알 수 있었다. 이러한 세포간의 차이는 기능에서도 차이가 있을 것을 시사한다고 사료된다. 또한, 혈관조 세포들과 Boettcher's cell에서 gerbil과 mouse의 염색 양상의 차이는 와우 세포 내의 NOS의 분포도의 종간의 차이가 있을 수 있을 가능성을 시사하였다.
REFERENCES
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