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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(9): 1098-1102. |
| Expression of PCNA in Experimental Cholesteatoma by Implanting Autologous Free Skin Graft in Mongolian Gerbil Middle Ear Cavity. |
| Kee Hyun Park, Hong Joon Park, Won Seok Lee, Young Joon Yu |
| Department of Otolaryngology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea. parkkh@madang.ajou.ac.kr |
| 중이강내 자가 피부이식으로 유도한 실험적 진주종에서 PCNA의 표현 양상 |
| 박기현 · 박홍준 · 이원석 · 유영준 |
| 아주대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
Mongolian gerbilㆍ자가 피부이식ㆍPCNAㆍ면역조직화학적 염색. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cholesteatoma in the middle ear is characterized by the presence of a keratinizing epithelium which is believed to have hyperproliferative properties. Among the various approaches for evaluating proliferative activity, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) has been recently induced as an antigenic marker of cellular proliferation. In this study, we investigated the hyperproliferative characteristic of implanted skin in Mongolian gerbil middle ear cavity by comparing its mitotic activity with that of the retroauricular skin. A secondary purpose was to provide the morphological basis for future animal studies concerning cholesteatoma pathogenesis.
MATERIALS AND METHODS:
Using immunohistochemical technique with anti-monoclonal antibody, we investigated PCNA expressions of the implanted free skin and normal retroauricular skin of Mongolian gerbils.
RESULTS:
Experimental cholesteatoma induced by implanting free skin graft showed an average PCNA labeling index of 0.47+/-0.07 and normal retroauricular skin revealed 0.14+/-0.05. The labeling index of experimental cholesteatoma was 3.47 times higher than that of normal retroauricular skin.
CONCLUSION:
The epithelium of experimental cholesteatoma induced by implanting free skin graft in gerbil middle ear cavity proliferates at a higher rate than its normal retroauricular skin, suggesting that this animal model can be used for future study of epithelial proliferation of cholesteatoma. |
| Keywords:
Mongolian gerbilㆍAutologous free skin graftㆍPCNAㆍImmunohistochemistry |
서론
실험적으로 진주종의 병인을 연구하는 방법으로 동물 모델을 많이 사용하며, 실험동물로는 친칠라(chinchilla), 쥐(rat)와 gerbil을 흔히 이용하나 현실적으로 국내에서는 친칠라를 구하는 것이 어렵고 쥐는 중이내에 자연적인 감염이 많은 관계로 Mongolian gerbil을 실험에 많이 이용하고 있는 실정이다.
동물모델을 이용하여 중이 진주종의 발생을 유도하는 방법으로는 실험동물의 중이강내 프로필렌 글리콜(propylene glycol)등의 화학적 자극 물질을 주입하는 방법,1)2) 외이도를 수술적인 방법으로 결찰하는 방법,3)4) 이관을 전기 소작 등의 방법으로 폐쇄시키는 방법5) 그리고 중이강내 자가 피부이식을 하는 방법6)7)으로 크게 대별할 수 있다.
PCNA(proliferating cell nuclear antigen)는 세포의 증식을 잘 나타내어 주는 표지인자로서 세포 주기 중 G1기와 S기에 합성되는 DNA 중합 효소 δ 보조 단백질(DNA polymerase-δ auxillary protein)이다. G1기 후반부터 핵내에서 발현되기 시작하여 S기에 최고에 도달하고 G2기 및 M기에는 감소한다. 즉 세포의 증식 상태와 직접 관계되어 휴지기 세포에는 매우 적은 양이 존재하나 증식하는 세포에서는 증가하는 양상을 보인다.8)9) 1993년 Uchida 등10)은 인간의 진주종에서 이러한 PCNA를 처음으로 확인하는데 성공하였다.
저자들은 Mongolian gerbil의 중이강내 후이개 상피를 자가 이식하여 진주종을 유발시키고, 중이 진주종 상피세포의 증식을 확인하기 위해서 PCNA에 대한 면역조직화학적 염색방법을 사용하여 중이 진주종 상피세포의 과증식 여부를 후이개 상피의 증식 양상과 비교하여 이 동물모델이 중이 진주종의 연구 대상으로 적합한 지의 여부를 판단하고 향후 진주종의 발생 기전을 연구하는데 있어서 동물모델을 통한 형태학적 근거를 마련하고자 하였다.
재료 및 방법
재료
실험동물은 체중 60∼75 g의 생후 90일에서 120일된 10 마리 20귀의 정상 Mongolian gerbil(Meriones unguiculatus)을 사용하였다.
방법
Mongolian gerbil의 중이강내 자가 피부이식
Mongolian gerbil을 xylazine(상품명；Rompun, 투여량；8 mg/kg)과 ketamine hydrochloride(상품명；Ketalar, 투여량；40 mg/kg)로 근육 주사 하여 마취시킨 후 이개 뒤의 피부를 절개하고 골포를 개방하였다. pick을 이용하여 개방된 골포내 중이 점막을 제거하고 그 위에 Mongolian gerbil의 후이개 상피를 0.5× 0.5 cm 크기로 채취하여 상피의 각질층이 위에 위치하도록 이식하였다. 피부이식이 끝난 후 개방된 골포를 이개 근육과 피부로 봉합하였다.
실험동물 희생 및 조직 절편 만들기
3개월 후 실험동물을 에틸 에테르로 마취시킨 다음 흉부를 절개하여 심장을 노출하였다. 노출된 심장의 좌심실에 카데터를 삽입하고 우심실을 절개한 뒤 생리 식염수 50 cc와 10% 중성 포르말린 완충 용액 100 cc를 사용하여 관류 고정을 시행하였다. Mongolian gerbil이 완전히 고정된 것을 확인한 후 절두하였고 골포를 일괴로 채취하였으며, 실험 대조군으로 Mongolian gerbil의 후이개 상피를 채취하였다. 조직을 상온에서 10% 중성 포르말린 완충 용액에 3일간 고정한 후 5% EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 용액에 3주간 탈석회화시켰다. 농도를 달리한 에탄올 용액으로 탈수시킨 후 조직을 파라핀에 포매하였고, 5 μm의 두께로 연속적인 조직 절편을 만들었다.
면역조직화학적 염색방법
조직 절편은 통상적인 방법에 따라 헤마톡실린-에오신 염색을 한 후 광학 현미경으로 관찰하였으며, 진주종이 관찰된 절편과 인접한 절편에 대해 PCNA 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 파라핀 조직 절편을 L-라이신으로 처리한 슬라이드에 부착시킨 후 자일렌 용액에 넣어 파라핀을 제거하였고, 100%, 90%, 80%, 70%로 농도를 달리한 에탄올로 함수 처리하였다. 펩신으로 37℃에서 20분간 반응시켜 항원의 노출을 촉진시키고, 3% 과산화수소수와 메탄올을 1：10으로 섞은 용액 내에서 10분간 처리하여 내재성 과산화효소의 활성반응을 제거하였다. Blocking reagent(1：20 horse serum)를 30분간 처리한 후 1：50으로 희석한 PCNA에 대한 anti-mouse monoclonal antibody(PC 10；Novocastra Lab., U.K.)로 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS로 세척한 다음 anti-mouse biotinylated IgG(DAKO Co., Denmark) 2차 항체를 실온에서 30분간 반응시키고, ABC(avidin-biotin peroxidase complex；DAKO Co., Denmark)를 30분간 처리하였다. 최종적으로 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole；DAKO Co., Denmark)로 발색시키고, Mayer hematoxylin으로 대조 염색하여 광학 현미경하에 관찰하였다.
염색 판정 및 PCNA 표지 지수(Labeling Index) 산출
400배 시야에서 관찰하여 임의로 선택된 하나의 시야에서 세포핵이 적갈색으로 염색된 PCNA 양성 세포의 수를 세었고, 각 조직 절편에서 5 부위의 시야를 관찰하여 이들의 평균을 구하였다. PCNA 표지 지수는 한 시야에 나타난 전체 상피세포의 수에 대한 PCNA 양성인 세포 수의 비율로 나타내었다.
PCNA 표지 지수 ＝PCNA 양성 세포수/ 전체 상피세포수
실험군과 실험 대조군의 PCNA 표지 지수는 각각 산술 평균을 구하여 평균치와 표준 편차로 표시하였으며, t-test를 사용하여 이들 두 군간의 통계학적인 유의성을 살펴보았다.
결과
중이강내 자가 피부이식 후 진주종의 생성
후이개 상피를 채취하여 중이강내 이식한 10마리의 Mongolian gerbil, 20귀 중에서 3개월 후 중이 진주종이 생긴 경우는 15귀로 75%의 생성율을 보였다. 이들 15귀 중에서 3귀는 중이내 감염 상태가 심하여 제외하였고, 나머지 12귀를 대상으로 PCNA에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 실험 대조군으로는 정상적인 Mongolian gerbil에서 얻은 12귀의 후이개 상피를 사용하였다.
자가 피부이식 후 생성된 중이 진주종의 조직학적 소견
중이강내 이식된 자가 피부는 중층 편평 상피의 조직학적 구조를 그대로 유지하였고, 표피 각질의 축적과 피하 결체 조직내에 일부 염증 세포의 침윤을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
정상 후이개 상피에서의 PCNA 표현 양상
정상 후이개 상피에서 PCNA 양성 세포는 주로 기저층에 국한되어 있었 고 드물게 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
자가 피부이식 후 생성된 실험적 중이 진주종에서의 PCNA 표현 양상 PCNA 양성 세포가 기저층 및 일부 기저 상부층에서 증가된 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
PCNA 표지 지수
자가 피부이식으로 생성된 실험적 진주종에서의 PCNA 표지 지수는 0.31에서 0.55의 범위에 있었으며, 평균값은 0.47±0.07이었다. 정상 후이개 상피의 PCNA 표지 지수는 0.10부터 0.27까지 분포하였고, 평균 PCNA 표지 지수는 0.14±0.05이었다. 자가 피부이식으로 생성된 실험적 진주종에서의 PCNA 표지 지수는 정상 후이개 상피에서의 PCNA 표지 지수에 비하여 통계학적으로 의미있게 증가하였다(p< 0.01)(Fig. 4).
고찰
진주종은 중이강이나 유양동내 비정상적으로 각화 상피가 존재하는 것으로 정의할 수 있으며, 지속적인 염증 반응으로 골 파괴를 일으키고, 과증식을 하는 특징을 가지고 있다. 진주종은 조직학상으로는 정상 고막이나 상피와 같은 구조를 가지며, 단지 피하 결체 조직내에 염증 세포를 동반한다는 점 외에는 별다른 차이점이 관찰되지 않는다.11) 그러나 어떠한 기전으로 진주종이 골 파괴나 과증식 등의 특징을 유발하는지에 대해서는 아직도 잘 알려져 있지 않다. 진주종은 대부분 병이 진행된 후에야 발견되며, 따라서 초기 병인이나 진행 과정을 규명하는데는 많은 제약이 있다. 이에 실험동물을 통한 진주종의 기전 연구가 절실히 요구된다.
노쇠한 Mongolian gerbil에서 자연적으로 진주종이 생기는 것이 발견 13)된 이후 McGinn과 Chole4)는 Mongolian gerbil의 외이도를 결찰하여 실험적으로 진주종을 유발시켰으며, Wolfman과 Chole 5)는 Mongolian gerbil의 이관을 전기 소작으로 폐쇄시키는 경우 고막의 함몰과 함께 고막 이완부에 함몰부(retraction pocket)가 생기는 것을 확인하였다. Wright 등2)은 cortisporin 국소 점이제를 친칠라의 중이강내에 주입하여 만성 염증을 일으킴으로써 중이 진주종을 유발하였으며, Vassalli 등1)이 프로필렌 글리콜을 사용하여 친칠라의 중이강내 진주종을 유발하는데 성공하였다. 실험 동물의 중이강내 직접 피부를 이식하는 방법6)7)은 Hinohira 등7)이 백서의 중이강내 정상 점막 조직을 박리하고 그 위에 직접 자가 피부이식을 시행하여 중이 진주종을 유발하였다.
이러한 진주종을 연구하는 중요한 목적 중의 하나는 진주종의 과증식 성향을 측정하는 것으로 최근 PCNA를 포함한 Ki-67 및 bromodeoxyuridine과 같은 몇몇 핵단백질이 증식하는 세포에서 발현됨이 밝혀졌다. 14) PCNA는 세포의 증식을 잘 나타내 주는 표지인자로서 세포 주기 중 G1기와 S기에 합성되는 DNA 중합 효소 δ보조 단백질이다. G1기 후반부터 핵내에서 발현되기 시작하여 S기에 최고에 도달하고 G2기 및 M기에는 감소한다. 즉 세포의 증식 상태와 직접 관계되어 휴지기 세포에는 매우 적은 양이 존재하지만, 증식하는 세포에서는 증가하는 양상을 보인다.8)9)
본 연구결과에서 중이강내 자가 피부이식을 한 후 유도된 실험적 중이 진주종에서는 상당히 많은 수의 PCNA 양성 세포가 기저 상부층에서 관찰되었는데 이것은 여기에서 주로 증식이 일어남과, 능동적으로 증식이 가능한 세포의 수가 증가되어 있음을 시사해 준다. 일부에서는 기저층보다도 기저 상부층에서 PCNA 양성 세포가 많이 나타나는 것을 볼 수 있었스며, 이것은 Bujia 등15)이 진주종 상피의 기저 상부층에서 상피성장인자수용체(epidermal growth factor-receptor)을 증명한 결과와 증가된 PCNA 양성 세포가 기저층과 기저 상부층에서 발현된다는 사실9)15)을 뒷받침하는 것으로 과증식 성향에 의해 진주종 상피의 성장이 촉진되어 기저층보다도 상부에서 PCNA 양성 세포가 많이 나타난 것으로 사료된다.
중이강내 자가 피부이식으로 유도된 중이 진주종에서 평균 PCNA 표지 지수가 후이개 상피보다 통계학적으로 의미있게 증가된 것은 Chang 등16)이 인간의 진주종에서 연구한 결과와 Park 등17)이 외이도를 결찰 후 유발된 실험적 진주종에서 연구한 결과와 동일하였다.
Ottaviani 등18)은 tritium-thymidine을 이용하여 진주종의 표지 지수가 정상 상피보다 2.8배 증가되어 있슴을 증명하였고, Chang 등16)은 인간의 진주종이 외이도 상피보다 3.24배 증가된 증식 성향을 보임을 보고하였다.
진주종내 각질 세포가 비정상적인 증식 성향과 비조절성(dysregulation)을 보이는데 대한 설명으로서 피하 결체 조직내 염증 반응에 의해서 피하 결체 조직의 활성도가 증가되고 상피의 재생 속도가 증가되는 것이 하나의 원인으로 알려져 있으며, 이때 분비되는 TGF-α(transforming growth factor-α), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), IL-1(interleukin-1)이나 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 성장 인자(growth factor)에 의한 상피의 성장 속도 증가가 또 다른 요인으로 생각되고 있다.15)
따라서 가능한 진주종의 형성 기전으로는 다음과 같이 설명할 수 있다. 만성 염증에 의해서 피하 결체 조직의 활성도가 증가되고, 사이토카인 및 성장 인자들이 분비되어 고막과 외이도에 이미 존재하고 있는 상피 생성 중심부의 활성도가 증가되거나 새로운 상피 생성 중심부가 다른 부위에서 형성되어 이에 의해 상피 세포의 과증식이나 이동 속성의 변화가 생겨 표피 각질이 축적되면서 진주종이 생기는 것으로 생각된다. 본 연구결과에서 Mongolian gerbil의 중이강내 자가 피부이식으로 유도된 실험적 진주종의 상피세포가 정상 후이개 상피보다 높은 증식 성향을 나타내었고, 이것을 통해서 Mongolian gerbil을 이용한 동물모델이 중이 진주종의 병인을 연구하는데 유용함을 알 수 있었다.
결론
Mongolian gerbil의 중이강내 자가 피부이식으로 유도된 실험적 중이 진주종 상피에서 정상 후이개 상피에 비해서 PCNA 양성 세포가 증가되었음을 관찰할 수 있었으며, 이것은 실험적 중이 진주종 상피가 정상 후이개 상피 보다도 높은 증식의 성향을 반영하는 것으로, Mongolian gerbil을 이용한 동물모델이 향후 중이 진주종의 병인을 연구하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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