A Study of Laryngeal Innervation by HRP Retrograde Labeling and Immunohistochemical Methods.

Kim, Young Mo; Cho, Jung Il; Han, Chan Jun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(8); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(8): 1001-1008.

A Study of Laryngeal Innervation by HRP Retrograde Labeling and Immunohistochemical Methods.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery InHa University, College of Medicine, Inchon, Korea. ymk416@inha.ac.kr

Horse Radish Peroxidase(HRP)를 이용한 역행성 추적방법과 면역조직화학적 방법을 이용한 후두신경분포에 대한 연구

김영모 · 조정일 · 한창준

인하대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실

주제어: 후두 이중 신경 지배ㆍ후두 운동신경ㆍ갑상피열근ㆍ피열간근.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Classical concept of the laryngeal neuroanatomy has been questioned by some authors. Double innervation of some intrinsic laryngeal muscles has been suggested but controversy still exists. This study investigates the possibility of double innervation of thyroarytenoid and interarytenoid muscle and also the proportion of motor component in the external and internal branch of the superior laryngeal nerve.
MATERIALS AND METHODS:
Horse radish peroxidase (HRP) retrograde labeling in dogs, and choline acetyltransferase (ChAT) immunohistochemistry in feline and human laryngeal nerves were used.
RESULTS:
Evidences suggesting the existence of double innervation in thyroarytenoid and interarytenoid muscle and the existence of sensory component in external branch and motor component in internal branch of the superior laryngeal nerve have been observed.
CONCLUSION:
This new concept of the laryngeal neuroanatomy may be helpeful for understanding some of the neurologic diseases of the larynx such as spasmodic disphonia or variability of the vocal cord position in vocal cord paralysis. Further neuroanatomic and physiologic study is needed.

Keywords: Double innervation larynxㆍMotor innervation larynxㆍThyroarytenoid muscleㆍInterarytenoid muscleㆍHRP retrograde labeling larynx

서론 계통 발생학적 측면에서 볼 때 역사가 오랜 후두의 기능은 다양하며 중요하다. 애초의 후두의 주된 역할은 호흡기의 관문으로서 하기도를 보호하고 호흡을 원활히 이루어지게 하는 것이었으나, 시간이 흐름에 따라 이러한 주기능들 외에 발성 기능을 추가로 가지게 되었다. 이러한 다양한 후두의 기능들을 볼 때 후두에 분포하는 운동신경들의 복잡성을 예측할 수 있다. 고식적인 해부학 개념으로는, 후두의 내근중 상후두신경의 외지로부터 지배를 받는 윤상갑상근을 제외한 모든 내후두근은 반회후두신경으로부터 지배를 받는다고 되어 있다. 그러나 근래에는 일부의 저자들로부터 반회신경과 상후두신경으로부터 이중으로 신경 지배를 받는 내후두근의 존재 가능성이 제기되었으며, 이러한 주장에 대하여는 아직까지 많은 논란 있다.1)2) 예를들면 피열간근이 상후두신경의 내지와 반회후두신경에 의해 이중적인 운동신경의 지배를 받는다는 주장을 몇몇 저자들이 하였으나2)3) 현재까지는 정설로 받아들여지지 않은 실정이다. 그러나 최근에 특정 내후두근에 대한 이중 신경지배의 존재 여부가 다시 제기되고 있으며,4) 그에 대표적인 근육들은 피열간근 외에도 갑상피열근을 꼽을 수 있다. 피열간근의 상후두신경내지에의한 이중 신경지배에 대한 연구는 오래전부터 제기되어 왔다. 1934년 Rethi5)는 이러한 분지가 운동신경이라고 주장한 반면에 Hofer6)는 순수 감각 신경이라고 주장하였고, 1952년 Vogel7)은 양측 성대마비 환자들에서도 피열간근 수축으로 인한 후두폐쇄가 정상적으로 일어나기 때문에 운동신경이라고 주장하는등 논란이 많은 실정이다. 갑상피열근에 대하여도 논란은 많다. 1932년 Lemere 8)는 갑상피열근도 상후두신경의 외지와 반회후두신경에 의해 이중지배를 받고있다고 주장하였으며, 그후 1993년 Sanders 등1)은 Sihler 염색법을 통하여 10개의 인간 후두중 4개에서 상후두신경외지가 반회신경과 함께 갑상피열근에 연결되어 있는 것을 확인하였다. 하지만 Sihler 염색에 의해서는 해부학적인 신경지배 양상만을 알 수 있었으므로 근육에 분포하는 상후두신경의 외지가 운동신경을 포함하고 있는지는 밝히지 못하였다. 그후 Nasri등9)은 미세수술을 통해 7마리의 개중 3마리에서 “in vivo canine phonatory model”10)을 이용하여 상후두신경의 외지로부터 나오는 갑상피열근의 분지를 확인하였다. 이들은 상후두신경의 외지가 갑상피열근의 부수적 신경으로 존재할 수 있으며, 발성시 운동신경으로서 어떠한 역할을 담당할 수 있다는 것을 시사하였다. 후두의 감각 신경계는 기도의 방어와 후두 반사에 직접적으로 관여한다는 점에서 많은 관심을 끌고 있다. 일반적으로 성문상부의 감각은 상후두신경내지에 의해서, 성문과 성문하부 점막의 감각은 반회후두신경을 통해 중추신경계로 전달된다고 알려져 있다. 그러나 이러한 고식적인 해부학 개념 역시 논란의 대상이 되고 있다. 예를 들면 순수 운동신경으로 알려진 상후두신경외지내에 감각 신경이 포함되어 있다고 주장과, 11) 이를 반박하는 연구들12)도 있어 후두 감각신경계 역시 논란이 많은 실정이다. 이와 같이 후두의 운동 및 감각신경 분포에 대하여 아직도 많은 논쟁의 소지가 있으므로, 저자들은 피열간근과 갑상피열근에 대한 상후두신경과 반회후두신경의 이중 신경지배의 가능성과, 또 이러한 상후두신경으로 부터의 이중적 신경지배의 운동신경 포함 여부를 알기 위하여 horse radish peroxidase(HRP) retrograde labeling method와 콜린성 뉴론의 특이적 표식자인 choline acetyltrasferase(ChAT)를 이용한 면역조직화학적 방법으로 상후두신경외지와 내지에서의 운동신경 섬유분포와 성상을 고양이와 후두전적출술후 얻은 사람의 후두로부터 후두 신경분포에대해 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 HRP retrograde labeling 체중 8∼10 kg의 잡종개 13마리를 sodium pentobarbital을 30 mg/kg의 용량으로 각막이 마취될때까지 정맥 주사한 뒤, 기관내 삽관하였다. 이어 경부 정중선에서 피부절개후 후두와 기관을 노출시켰다. 10마리중 2마리를 무작위로 A군으로 정하고, 30% HRP(Sigma Ⅵ) 10 μl를 생리식염수에 혼합하여 주위 조직으로 번지지 않게 조심하면서 우측 윤상갑상근에 주사하였다. 다른 2마리를 B군으로 정하고, 이들의 우측 상후두신경 외지를 찾아내어 분리하여 절단후 결찰하였고, 이어 우측 반회신경을 기관식도구에서 찾아 신경전기자극기(WR Medical Electronic RLN stimulator, Model S2LH, St. Paul. MN)로 확인후, 갑상피열근으로 가는 분지만을 남기고 후윤상피열근, 피열간근, 외측윤상피열근 등으로 가는 분지를 찾아 모두 절단 후 결찰 하였다. 진성대의 노출을 위해 갑상연골 중앙을 통하여 후두 절개술을 시행한 뒤, 다른 내후두근으로 주사되지 않도록 주의하면서 성대를 통하여 우측 갑상피열근의 부위에 생리식염수에 희석된 30% HRP 10 μl를 주사하였다. 다른 6마리의 잡종개를 C군으로 정하여 우측 상후두신경은 남겨놓고 우측 반회신경을 1 cm 가량 절제후 B군에서와 같은 방법으로 우측 갑상피열근에 HRP를 주사하였다. 나머지 3 마리 개는 D군으로 정하여 양측 반회신경을 2 cm 가량 적출후 피열간근에 역시 10 μl HRP를 주사하였다. 이후 모든 대상군은 갑상연골 중앙을 3.0 Dexon으로 정확히 봉합후 Penrose 유출관을 삽입하고 2∼0 silk로 창상을 봉합하였다. 술후 5일에 대상 잡종 개의 뇌를 0.9% 생리식염수(3000 ml, 37C)로 심장관류후 4% paraform aldhyde와 0.5% gl-utaldehyde in phosphate buffer(2000 ml, 4C, PH 7.4)로 고정하였다. 관류 고정후 뇌관을 절제하여 0.1M phosphate buffer의 15% sucrose 용액에 2일간 담근 후 30% sucrose액에 7일간 담가두었다. 이어 준비된 뇌간을 제 2 경추부터 외교의 미단부까지 80 mm 간격으로 연속적인 횡절편을 만들어 diaminobenzidine cobalt-glucose oxidase법으로 HRP 화학염색후 0.03% toluidine blue로 염색하였다. 모든 절편에서 HRP에 반응하는 뉴우론을 광학현미경으로 관찰하였다. ChAT 면역조직화학적 염색 약 1.5 kg 가량의 건강한 고양이 6마리로부터 희생직후 각각의 양측 상후두신경외지 및 내지, 반회후두신경 등을 확인후 박리 적출하여 실험을 하였고, 사람에서는 4명의 후두전척출술을 받은 환자들에서 얻은 같은 종류의 신경들을 실험 하였다. 대조군으로 설하신경과 대이개신경을 실험하였다. 획득한 각각의 신경들을 즉시 4℃ Zamboni 용액(0.1M phosphate buffer, paraformaldehyde, 1M sodium hydroxide solution, 2% picric acid, pH 7.4)에 4일간 고정하고 인산완충용액(phosphate buffered saline, 이하 PBS)으로 15분간 세척한 후 조직의 급속 동결로 인한 손상을 막기 위하여 4℃ 20% sucrose 용액에 2일간 침투시킨 다음 OCT compound로 포매시켜 관상면의 조직냉동절편(10 μm)을 제작하고(Reichert-Jung, 2800 Frigo-cut N) silanized slide(DAKO Japan CO., LTD.)에 부착시켰다. 1개는 통상적인 hematoxylin & eosin 염색을 시행하였고 나머지는 상온에서 30분간 건조시킨 후 4℃ 0.9% PBST(phosphate buffer saline triton-X)에 30분 동안 처리하였다. 조직이 부착된 슬라이드를 메탄올에 용해된 0.5% H2O2에 상온에서 30분 동안 처리하고 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위하여 각 절편을 차단항체(blocking antibody)로서 PBS에 용해된 30% goat normal serum에 1시간 30분 동안 반응시키고 PBS에 30분간 세척하였다. 일차항체로서 PBS에 1：1000배 희석한 rabbit anti-ChAT antibody(Chemicon Int. Inc. Temecula, California, USA, No AB143)를 각 조직 슬라이드에 24시간 동안 4℃에서 반응시킨 후 0.9% PBS로 10분간 3회 세척하였다. Biotin이 결합된 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG 와 상온에서 1시간 동안 반응시키고 PBS로 세척한후 다시 상온에서 1시간 동안 avidin-biotin-peroxidase complex와 반응시켰다. 이어서 상온에서 20여분간 DAB(diamino benzidine) 발색반응을 시킨후 hematoxylin으로 대조염색을 하고 계열 에탄올(70%, 80%, 90%, 95%, 99%)로 탈수하고 xylen으로 탈지 과정을 거쳐 paramount로 봉합하여 광학현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 설하신경에 일차 항체 대신 goat normal serum을 가하고 이후 염색 단계는 동일하게 처리한 군을 설정하였다. 결과 HRP 주사후 대부분의 표지된 뉴우론들은 동측 의핵(nucleus ambiguus, NA)에서 관찰되었고, 일부는 망상체형성(reticular formation)에서 관찰되었다(Fig. 1). A군에서는 표지된 운동신경 뉴우론들은 의핵의 문측(rostral)에서 발견되었고, 안면신경핵의 미단부로부터 약 1.5 mm 길이에 걸쳐 있었다. 뉴우론들은 문측에서 최대로 응집되어 관찰되었고 빗장(obex)쪽으로 가면서 점점 널리 퍼져 분포하였다. 표지된 뉴우론의 형태중 일부는 방추상 모양도 관찰되었으나, 대부분은 다극성 모양이었다. B군에서는 표지된 뉴우론이 A군에서보다 의핵내에서 좀더 미측에 위치하였다(Fig. 2). 이들의 분포는 빗장의 문측으로 1.5 mm 위치에서부터 2.5 mm 길이의 분절로 구성되어 있었다. C군에서는 표지된 뉴우론이 단지 2마리의 의핵에서만 발견되었다. 즉 나머지 4마리의 의핵에서는 표지된 뉴우론을 볼 수 없었다. 이들 2마리 개의 의핵에서 표지된 뉴우론은 B 실험군에서 보인 표지된 뉴우론의 분포와 중복되는 위치에 분포하였고, 이 뉴우론 역시 다극세포로 구성되어 있었다. 단지 C군에서 보인 차이점은 B군보다 표지된 뉴우론 수가 적다는 것이었다(Fig. 3). D군에서 역시 3마리중 2 마리에서 빗장 문측부위의 약 1.5 mm에 걸쳐 비교적 적은 수의 표지된 다극성의 뉴우론들이 관찰되었다(Fig. 4). 고양이 상후두신경외지의 ChAT 면역조직화학 염색상, 대부분의 신경섬유들은 중앙의 축삭위치에 암갈색으로 표지되는 면역 반응물질이 보였지만 소수의 염색되지 않은 섬유군도 관찰되었다. 이들 염색되지 않은 신경섬유들은 변연부에 위치하고 있었으며 작은 군집을 형성하고 있었고 신경 섬유의 직경은 상후두신경 내의 염색된 신경 섬유들보다 작았다(Fig. 5). 상후두신경내지에서는 비교적 소수의 염색된 신경섬유들이 변연부에 위치하고 있었으며, 역시 작은 군집을 형성하고 있었다. 신경섬유의 직경은 비교적 큰 모양과 작은 모양이 섞여 있었다(Fig. 6). 사람의 상후두신경외지의 ChAT 면역조직화학 염색상, 직경이 크고 작은 신경 섬유가 확연히 구별되었다. 큰 섬유들은 거의 모두 면역 반응을 보였지만 작은 섬유들에는 면역 반응이 관찰되지 않았다(Fig. 7). 고찰 후두내근을 포함한 모든 횡문근에서는, 하나의 운동신경이 최저 3개에서 최고 3,00013)개의 근섬유에 분포한다고 알려져 있으며, 이것을 운동단위라 한다. 근육의 긴장도는 이러한 운동단위의 수와 자극 빈도에 따라서 결정된다. 후두내근은 비교적 작은 운동단위로 이루어져 있으며, 보고자마다 차이는 있지만 한 운동단위는 최소 2∼3개에서 최고 250여개11)의 근섬유로 이루어 있다. 짧은 수축 시간을 가지고 있는 외측윤상피열근과 특히 갑상피열근은 20개 미만의 근섬유로 이루어진 아주 작은 운동단위를 가지고 있으며, 수축 시간이 비교적 긴 윤상갑상근이나 후윤상피열근은 200에서 250개의 근섬유로 이루어진 상대적으로 큰 운동단위를 가지고 있다.13) 이러한 사실은 이들 근육들이 주어진 역할에 따라서 아주 세분화된 해부학적 차이를 가지고 있음을 알 수가 있다. 후두내근들을 신경해부학적으로 더욱 복잡하게 만드는 것은 하나의 근육에 여러 개의 운동종판(mo-tor end plate)이 존재한다는 것이다. 갑상피열근섬유의 80% 이상, 외측윤상피열근은 약 30% 그리고 후윤상피열근에서는 5% 미만의 근섬유만이 다수의 운동종판을 가지고 있다.14) 하나의 근섬유에 이와 같이 여러개의 운동 종판이 있는 경우는 중이근, 외안근, 내후두근과 같이, 포유류에서 기능이 고도로 전문화된 근육에서만 존재한다고 알려져 있다. 또한 slow twitch 섬유인 제 Ⅰ 형에는 약 70% 그리고 fast twitch 섬유인 제 Ⅱ 형에는 30% 정도가 여러개의 운동종판을 가지고 있는 것으로 알려져, 대부분의 slow twitch 섬유가 다수의 운동 종판을 가지고 있는 것을 알 수 있다. 그 이유에 대하여는 아직 확실하게 알려진것은 없으나 갑상피열근의 경우 발성시 보다 더 확실한 신근전달체계를 보장하여 고주파 자극을 감당할 수 있게 하고, 근육의 긴장도를 순간적으로 높일 수 있는 하나의 적응기전이라 생각 된다.3) 내후두근은 발성에 필수적인 다양하고 정교하면서도 잘 조화된 기능을 수행하는 근육들이다. 이들 중 윤상갑상근은 수축시 진성대의 길이를 조절하는 실질적인 긴장근으로 알려져 있으며, 갑상피열근은 윤상갑상근에 비하여, 더 정교하고 민감하게 작용한다고 알려져 있다.10) Arnold는 이 근육들이 서로 주동근-길항근 관계이며 갑상피열근은 내긴장근, 윤상갑상근은 외긴장근이라 하였으며,15) 이러한 상관관계는 성대의 음조를 조절하는데 중요한 역할을 한다고 한다. 갑상피열근은 진성대의 주 구성원이고 갑상연골의 내측 중앙으로부터 양측 피열연골의 전외측에 부착되어 있으며, 성대인대에서 넓은 박판모양을 하고 있다. 이 근육은 수축시 피열연골의 성대돌기를 전방으로 견인하여 성대의 내전을 유발하고, 성대의 긴장도와 완고함(stiffness)을 증가시킨다. 이 근육은 발성시 서로 다른 기능을 가진 두개의 부위로 구성되어 있는 것으로 알려져 있는데, 그 하나는 성대에 바로 인접한 내측근 즉 성대근이고, 다른 하나는 내측근의 바로 외측에 위치하는 외측근으로서 갑상피열근의 대부분을 차지한다. 갑상피열근의 신경지배는 매우 복잡하게 구성되어 있으며, 후두내근중 가장 많은 신경문합계를 갖고 있다.1) 이와 같이 복잡한 신경구조는 발성시 섬세한 음의 조절기능을 가능케 한다. 이 근육에 관련된 중요한 의문점중 하나는 이중신경지배 존재의 개연성이다. Lemere8)는 개를 이용한 연구에서, 상후두신경의 외지가 윤상갑상근에 분포한 후 갑상피열근을 통과하여 성대주름의 점막에 분포한다고 하였다. 그러나 그는 전기자극 후 나타나는 반응을 관찰하지 못하여 운동신경으로서의 역할을 하는지는 밝히지 못하였지만, 그의 연구는 이 근육의 이중신경 지배 가능성을 제시하였다. 그 이후 Sanders등1)은 상후두신경외지가 반회신경과 더불어 갑상피열근의 또 다른 운동신경임을 밝혔고, 그후 Nasri등9)은 갑상피열근으로 분지하는 이 부수적인 신경이 운동신경을 포함하고 있을 것이라는 것을 생리적 실험을 통하여 확인하였다. 본 연구의 A군과 B군은 윤상갑상근의 상후두신경외지의 운동신경 뉴우론과, 반회신경의 갑상피열근 운동신경 뉴우론을 비교하기 위한 것이었다. 이전에 발표된 논문들에 따르면, 종간의 차이는 있지만 윤상갑상근의 뉴우론들은 의핵의 문측에 위치한다고 알려져 있으며,12) 이러한 결과는 본 실험 A군에서의 결과와 일치하였다. 표지된 뉴우론은 B군의 뉴우론보다 문측에 위치하고 있었으며, 약 1.5 mm 정도의 길이에 분포하였다. B군에서는 HRP를 주사하기전 갑상피열근으로 가는 분지를 제외한 모든 반회신경의 분지와 상후두신경을 차단 후 표지된 뉴우론의 위치는 빗장 문측의 1.5 mm 정도에서 시작하여 빗장의 약 1 mm 미측까지 분포하고 있었으며 이러한 결과는 이전에 발표된 여러 논문들의 결과와 대체로 일치하였다.12) C군에서는 반회신경을 1 cm 가량 절제 후 갑상피열근에 HRP를 주사하여 HRP가 반회신경을 통하여 역행표지 되는 것을 차단하였으므로, 의핵에 나타난 운동신경 뉴우론은 갑상피열근에 분포하는 상후두신경외지를 통하여 표지되었음을 의미하며, 이는 상후두신경에 의한 이중운동신경 지배의 가능성을 제시한다 하겠다. 본 연구에서 6마리의 개중 2마리에서만 이러한 현상이 관찰되었고, 표지된 뉴우론들의 위치는 B군과 유사하였으나, 차이점은 뉴우론의 수가 B군에서 보다 적었다는 것이다. Sanders등1)은 10개의 사람 후두중 4개에서만 갑상피열근의 이중신경지배를 발견하였다 하였고, Nasri등9)은 7마리의 개중에서 3마리에서만 상후두신경에서 나오는 갑상피열근의 운동분지가 존재한다고 주장하였다. 이러한 결과들은 모든 갑상피열근에서 이중적 신경 지배가 이루어지는 것이 아니라, 일부에서만 있는 현상이며, 존재 유무에 따라 발성의 차이가 나타날 수 있다는 가능성을 시사한다. 피열간근에 대하여도 이들은, 이 근육이 양측 상후두신경내지와 양측 반회신경에 의한 4개의 신경지배분지를 포함하고 있으며, 이 피열간근에 분포하는 상후두신경내지에는 운동신경을 포함되어 있을 것이라 추측하였다.1) 그외에도 Kra-mmer등16) 여러저자들 역시 상후두신경에의한 피열간근의 이중운동지배의 가능성을 시사하였다. 본 연구에서는 피열간근의 상후두신경이 운동신경을 포함하고 있는지를 알기 위하여, D군에서 양측 반회신경을 모두 1 cm 가량 절제후 피열간근에 HRP를 주사하여 HRP가 양측 반회신경을 통하여 역행표지 되는 것을 차단하여 실험을 하였다. 3마리중 2마리에서, HRP로 역행표지된 운동신경 뉴우론이 양측의핵에서 관찰되었으며, 이 의핵에 나타난 운동신경 뉴우론은 피열간근에 분포하는 상후두신경에의하여 역행표지 되었음을 의미하며, 이런한 결과는 상후두신경에의한 피열간근의 이중운동신경지배의 가능성을 제시한다고 볼수 있다. 갑상피열근과 피열간근의 이중운동신경지배가 일부에서만 존재하는 이유에 대하여는 아직 알려진 바 없으나, 이들 근육들은 후두반사시 즉각적인 성대폐쇄능력과 밀접한 연관이 있으므로, 아마도 후두 진화의 초기 단계에서 기도 보호를 위한 조임근 역할과 관련이 있을 것으로 생각되며, 진화 단계에서 퇴화하였을 것이라 추정된다. 후두 신경들은 3가지 종류가 있으며 각각은 고유한 기능을 가지고 있다. 운동신경은 후두 외근과 내근의 운동을 유발하며 자율신경은 혈관과 후두 분비선을 조절하고 감각신경은 말초자극을 감지하여 중추신경계로 보내는 역할을 한다. 후두에서 구심성 신경작용에 대한 연구는 이들이 기도의 방어와 호흡 반사에 직접적으로 관여한다는 점에서 관심을 끌고 있으며 특히 호흡 반사는 경벽압(transmural pressure)과 공기의 흐름과 연관되어 호흡 양상과 상기도 근육을 조절하는 것으로 알려져 있다. 즉, 후두내에 존재하는 일부 수용체들이 찬 공기를 감지하여 상기도의 기관지 경련 또는 연축을 유발하는 것으로 미루어 기도의 평활근 장력 조절에도 후두의 구심성 신경계가 깊이 관련되어 있음을 알 수 있다. 발성에 있어서 청각기외에 후두 감각 신경으로부터의 되먹임회로를 통하여 중추신경계에서 음조, 음의 강도, 음질등을 조절하게 된다. 이러한 되먹임회로의 조절은 후두내 여러 구심성 수용기들에 의해 이루어지며, 그 한 예로 후윤상피열근과 특히 피열간근에 분포하고 있는 근방추(muscle spindle)는 감수성이 탁월한 신장수용기(stretch receptor)로서 호흡과 발성시 성대의 위치를 결정하는데 아주 중요한 역할을 할 것이라 여겨진다.17) 그러므로 후두의 감각 신경계에 대한 정보는 음성 생성 조절의 생리적 기전을 이해하는데도 도움을 줄 것이다. 일반적으로 성문 상부는 상후두신경의 내지에 의해, 성문 하부는 반회후두신경에 의해 신경 지배를 받는다고 알려져 있지만 윤상갑상근의 운동신경을 포함하고 있는 상후두신경의 외지에 감각신경계의 신경섬유를 일부 포함하고 있다는 여러 저자들의 보고가 있으며,3)4) 이는 고유수용체에 신경지배(proprioceptive innervation)를 하리라고 여겨지고있다. 그러나 아직도 상후두신경외지의 신경분포양상은 그간 해부학적, 전기생리학적, 조직화학적방법 등으로 많은 학자들에 의해 연구되어졌지만 연구결과마다 차이가 있어 논란의 여지가 많다. 1932년, Lemere8)가 개를 이용한 전기생리학적, 조직학적연구를 통해 상후두신경의 외지가 윤상갑상근과 갑상피열근를 뚫고 들어가 성문 하부의 점막에 신경지배한다고 보고한 이래 1958년 Andrew18)는 쥐를 이용한 전기생리학적 연구에서 상후두신경외지의 작은 신경 섬유에서 성문 하부 점막으로부터의 활동 전위를 기록할 수 있었다고 하였다. 1968 년 Suzuki등19)은 고양이를 이용한 전기생리학적 연구에서 성문 하부 전면의 심부구조와 윤상갑상막주변의 점막에 접촉과 압력 자극에 따른 구심성흥분파를 상후두신경외지의 신경 섬유에서 기록하고 여기에 상당수의 구심성신경군이 존재함을 주장하였다. 이에 반해 1986년 Yoshida등20)은 고양이의 상후두신경내지와 반회후두신경을 절단한 후 결절신경절에 WGA-HRP(wheat germ agglutinin-horse radish peroxidase)를 주입하여 벽내경로(intramural course)와 말초 경로를 추적한 결과 Suzuki가 주장했던 부위에서 표지되는 감각 신경을 전혀 발견하지 못했고 이처럼 상반된 결과를 적절히 설명하지 못하였으나, 거꾸로 상후두신경외지에 HRP를 주입한 후 이를 추적한 결과 결절신경절 문측의 중간 부위에서 산재하고 있는 소수의 세포체들이 염색됨을 관찰하였으며 의핵의 문측에서도 상당수의 표지된 세포체들을 발견하여 상후두신경외지의 감각 신경 존재를 일부 증명하였으나 의핵보다 상위 중추인 미주신경배측핵(nucleus dorsalis nervi vagi)이나 고립로핵(nucleus tractus solitarius)에서는 명확히 표지되는 세포체들을 관찰할 수 없어 명확한 중추 투사경로를 밝히지 못하였다. 본 연구에서는 Ach E(acetylcholinesterase)보다 콜린성 신경을 훨씬 민감하게 특이적으로 염색시킬 수 있는 ChAT를 이용하여 상후두신경외지에 대해 염색을 시행하였다. Acetylcholine은 일찍이 중추신경과 말초신경에서의 중요한 신경 전달물질로 판명되었으며 이들이 신경활성을 가진다고 여겨져 왔지만 이를 가시화 할 수 있는 적절한 방법이 없어 가수분해 효소인 Ach E를 이용한 조직화학적 방법으로 간접적인 콜린성 경로를 표지 하였다.21) 그러나 Ach E가 콜린성 뉴론에만 국한되어 존재하지 않으며 운동신경근 대 감각신경근의 Ach E의 비는 3：1에 불과한데 반해 ChAT의 비는 무려 400：1로서,22) 보다 특이성 있는 표지자로서 ChAT에 대한 연구로 눈을 돌리게 되었다. ChAT는 Acetyl CoA와 Choline으로부터 신경 전달 물질인 acetylcholine의 합성을 촉매하는 합성효소로서 신경계에서 콜린성 뉴론의 single N-terminal과 C-terminal amino acid residue를 갖고 있다는 것이 밝혀지면서 정제된 이들 효소에 대한 항체를 얻을 수 있어, 면역조직화학적 염색법을 이용하여 신경계에서 감각신경과 운동신경을 감별할 수 있는 도구의 하나로 쓰여지고 있다. 본 연구에서 ChAT를 이용하여 고양이와 사람에서 상후두신경외지를 염색한 결과 신경의 축삭부위에서 면역물질이 관찰되었으며 신경초에서는 보이지 않았다. 고양이의 상후두신경외지의 축삭에서 갈색의 ChAT 면역반응물질이 보이는 신경섬유군과 보이지 않는 신경섬유군으로 크게 구분되었는데 염색되지 않은 신경섬유들은 전체 신경 섬유의 12.7%를 차지하는 것으로 나타났다(Fig. 5). 사람의 상후두신경외지에서도 역시 ChAT 면역반응물질이 보이는 신경섬유군과, 감각신경군으로 믿어지는 보이지않은 섬유군으로 구분되며, 고양이에서보다 더욱 확연하게 구분지어 지는 것을 볼 수 있다(Fig. 7). 감각 신경세포에 비해 운동신경세포내 ChAT 함유량이 Ach E 보다 100배 이상 많은 사실로 미루어 보아 이전의 Ach E를 이용한 감각 신경과 운동신경의 구별법보다 ChAT를 이용한 면역조직화학적염색이 훨씬 민감하며, 특이성이 높을 것으로 추정된다. 그러므로 본 연구에서 고양이의 상후두신경외지의 동일섬유속내에 염색되지 않은 신경의 비율이 12.7%인 사실은 가음성율을 감안하더라도 무시할 수 없는 부분일 것이며, 사람에서는 그 비율이 더 많다고 생각된다. 즉, 본 실험의 결과는 상후두신경외지내에 현재까지 알려진바와는 다르게 일부 감각신경이 포함되어 있음을 시사하며, 이 감각신경들은 형태학적으로 ChAT 면역반응물질로 표지된 신경섬유들보다 단면의 직경이 작아 구분이 되는 듯 하지만, 동일 섬유속내에 여러 크기의 신경섬유들이 섞여 있으므로 신경의 모양과 크기만으로 운동신경과의 구별은 어렵다고 하겠다.22) 후두의 방어반사와 호흡 조절에 있어서 상후두신경외지내의 감각신경의역할은 상후두신경내지 또는 반회신경에 비해 크지는 않으리라 생각되지만 이들의 보조적 역할을 배제할 수는 없으며, 상후두신경내지로 인한 구심성입력에 의해 나타나는 전체적인 반응에 추가적인 기여를 할것으로 추정된다. 7) 순수 감각신경으로 알려져있는 상후두신경내지에 운동신경이 포함되어 있는지는 역시 현재까자 일부 저자들에 의하여 많은 논란의 대상이 되고 있다.8)16) 최근에 Krammer등16)이 실험을 통하여 쥐의 상후두신경내지에 운동신경이 포함되어 있으며, 이 운동신경이 피열간근에 분포한다고 주장한 바 있다. 본 연구에서도 이를 확인하위하여 고양이의 상후두신경내지에 ChAT 면역조직화학적 염색을 실시한 결과 신경의 변연부에서 ChAT에 면역 반응을 나타내는 신경섬유가 비록 소수지만 나타났다는 사실을 확인하였다(Fig. 6). 이러한 결과는 현재까지 감각신경이라고만 알려져있던 상후두신경내지내에 운동신경이 존재하고 있다는 것을 시사하며, 이는 본 연구 일차실험의 D군의 결과와 일맥상통한다고 할 수 있다. 즉, 이 운동신경들이 피열간근에 분포하고있는 부수적인 운동신경일 가능성을 한층 높여 주고 있다. 이와 같은 결과들에 대해서는 향후 기능적인 측면과 추가적인 형태학적인 연구가 부가되어야 할 것이다. 즉 감각신경을 표지할 수 있는 신경전달 물질의 특이성 있는 항체를 이용한 추가적인 면역조직염색법 등을 통해 이들의 성상을 규명하고 감각신경 또는 자율신경으로 구분해야 하겠다. 특히 감각신경계 중 후두반사 그리고 호흡과 발성조절에 관여하는 여러 수용기에 대한 지속적인 해부학 및 생리학적 연구가 필요하며, 이들의 신경경로와 신경전달 물질에 대한 이해는 뇌간과 같은 상위 중추에서 이들의 경로를 확인하기 위한 기초가 될 것이다. 피열간근과 갑상피열근의 부가적인 운동신경의 존재 가능성은 해부학적으로도 큰 관심사일 뿐만 아니라, 임상적으로도 큰 의미를 지닌다 하겠다. 이러한 개념은 현재까지 일반화 되어있는 후두신경해부학에 대한 고식적인 개념과 상반되는 듯 하지만, 아직도 해결되지 않고 있는 많은 임상 현상들을 이해하는데 도움을 줄 수 있으며, 그의 한 예로 반회신경마비 환자에 있어서 마비된 성대위치의 다양성과 마비 후 발성 조절능력의 차이에 대한 의문점을 이해하는데 도움을 줄 수 있으며, 특히 갑상피열근의 이중 신경 지배 개념은 연축성발성장애와 같은 일부 신경학적인 후두질환을 이해하고 치료하는데 도움을 줄 수 있는 하나의 요소가 될 수 있으리라 생각된다. 이를 위하여는 향후 지속적인 해부학적 및 생리학적 연구가 병행되어야 할 것이다.
REFERENCES
1) Sanders I, Bei-lian U, Mu L, Li Y, Biller HF. The innervation of the human larynx. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:934-9. 2) Wu BL, Sanders I, Mu L, Biller HF. The human communicating nerve: An extension of the external superior laryngeal nerve that innervates the vocal cord. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994;120:1321-8. 3) Abo-El-Enene MA. Functional anatomy of the larynx (ed. Thesis), London, Engl`and, Univ of London press;1967. p.35-51. 4) Franca B, Ysubone H, Mathew OP, Sant'Ambrogio G. Afferent activity in the external branch of the superior laryngeal and recurrent laryngeal nerves. Ann Otol Rhinol Laryngol 1991;100:944-50. 5) Rethi A. Anatomishes spiegelbild des mechanismus der taschenbandstimme und die rekurrensfrage (1). Monatsschr Ohrenheik 1935;69:586-94. 6) Hofer G, Jeschek J. Die lahmung des nervus reccurens beim menschen. Z Hals-Nasen-Ohrenheik 1940;45:401-17. 7) Vogel P. Unpublished Doctoral Dissectation, Loyola Univ;1952. 8) Lemere F. Innervation of the Larynx. Part Ⅰ. Am J Anat 1932;51:417-34. 9) Nasri S, Beizai P, Secarz JA, Kim YM, Berke GS. Crossinnervation of the thyroarytenoid muscle by a branch from the external division of the superior laryngeal nerve. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology 1997;106:594-7. 10) Choi HS, Berke GS, Ye M, Kreiman J. Function of the TA in a canine laryngeal model. Ann Otol Rhinol Laryngol 1993;102:769-76. 11) Piquet J, Barets A. Observation sur l'innervation motrice du muscle vocal. Acta Oto-Laryng 1960;51:203-6. 12) Pasaro R, Lobera B, Gonzalez-Baron S, Delgado-Garcia JM. Cytoarchitecturic organization of laryngeal motoneurons within the nucleus ambuguus of the cat. Exp Neuor 1987;96:528-39. 13) Wyke BD. Recent advances in neurology of phonation: Phonatory reflex mechanism in the larynx. Brit J Dis Commic 1967;2:2-14. 14) Rossi G, Cortesia G. Morphological study of the laryngeal muscles in man. Acta Oto-Laryng 1965;59:575-92. 15) Arnold GE. Physiology and pathology of the cricothyroid muscle. Laryngoscope 1961;71:687-753. 16) Krammer EB, Streinzer W, Millesi W, Ellbock E, Zrunek M. Zentral lokalisation motorischer komponenten im ramus internus des N. Laryngeus superior: Eine HRP-studie bei der ratte. Laryng Rhinol Otol 1986;65:617-20. 17) Okamura H, Katto Y. Fine structure of muscle spindle in interarytenoid muscle of the human larynx. Vocal physiology: Voice production mechanism and functions. Edited by Osamu Fujimura. Raven Press Ltd., New York;1988. p.135-43. 18) Andrew BL. A functional analysis of the myelinated fibers of the superior laryngeal nerve of the cat. J Physiol 1958;133:420-32. 19) Suzuki M, Kirchner JA. Afferent nerve fibers in the external branch of the superior laryngeal nerve in cat. Ann Otol Rhinol Laryngol 1968;77:1059-71. 20) Yoshida Y, Sato T, Tanaka Y. Laryngeal sensory innervation: Origins of sensory nerve fibers in the nodose ganglion of the cat. Journal of Voice 1989;3:314-7. 21) MacIntosh FC. The distribution of acetylcholine in the peripheral and the central nervous system. J Physiol (Lond) 1941;99:436-42. 22) Welsch F, Schmidt DE, Dettbarn WD. Acetylcholine, choline acetyltrans-ferase and cholinesterases in motor and sensory nerves of the bull frog. Biochem Pharmacol 1972;21:847-56.