| Expression of FGF-R and TGF-R in the Lateral Wall of the Guinea Pig. |
| Byung Don Lee, Sung Hyun Kim, Hee Young Ahn, Hyuck Soon Chang, Ju Won Kang |
| Department of Otolaryngology, School of Medicine, Soonchunhyang University, Seoul, Korea. BDLEE12@hosp.sch.ac.kr |
| 기니픽 와우 외측벽에서 FGF-R과 TGF-R의 발현 |
| 이병돈 · 김성현 · 안희영 · 장혁순 · 강주원 |
| 순천향대학병원 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
성장인자 수용체ㆍ세포의 신호전달계ㆍ와우 외측벽. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The endolymph produced from cochlear lateral wall regulates fluid balance and maintains positive endocochlear potentials. Although many immunohistochemical studies on ion transport enzymes have been reported, their mechanisms are still not completely understood. And there are no reports on the distribution of receptor tyrosine kinases in the cochlear lateral wall of the guinea pig. The purpose of this study is to evaluate the expression of the fibroblast growth factor receptor (FGFR) and transforming growth factor receptor-beta (TGFR-beta, type II) in the lateral wall of the guinea pig cochlea.
MATERIALS AND METHODS:
We investigated the immunohistochemical localization of the receptor tyrosine kinases (FGFR, TGFR-beta) in the lateral wall of the Preyer's positive, pigmented guinea pig.
RESULTS:
The results showed that receptor tyrosine kinases were expressed in the cytoplasm of the marginal cells, intermediate cells in the stria vascularis, and type II, III, IV, and V fibrocytes, but not the basal cells and type I fibrocytes, in the lateral wall of the guinea pig.
CONCLUSION:
The findings suggest that receptor tyrosine kinases are involved in the various ion transports and that they participate in the PLC-IP(3) second messenger system. |
| Keywords:
Receptor tyrosine kinasesㆍSignal transductionㆍLateral wall of cochlea |
서론
혈관선조, 나선인대 및 나선융기 등을 포함하는 와우 외측벽은 외림프보다 높은 농도의 K＋ 이온을 분비하여 내림프액을 생성하고 내이의 항상성을 유지, 조절하는 제어기관이다.1)2) 와우 외측벽에서의 이온수송에 대한 많은 연구보고가 있었지만 실험동물과 항체의 종류에 따라 양성 세포발현과 생리적 반응이 보고자마다 다르고, 복잡한 세포내외의 신호전달계(signal transduction)가 참여하므로 아직도 그의 기전에 대해서는 명확하게 알려져 있지 않다.3-6) 사이토카인은 다단백으로 생체방어나 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하는데 특히 세포의 기능조절 즉 증식, 분화 및 운동성에 관여하는 성장인자(GF, growth factor, tyrosine kinase)는 특이적인 세포막 수용체에 결합하여 신호전달로부터 생리작용을 발휘하게 된다.7)
본 연구는 세포의 신호전달계에 관여하는 섬유아세포 성장인자 수용체(FGF-R, fibroblast growth factor receptor) 및 형질변환인자 수용체(TGF-R, transforming growth factor receptor, type β)를 면역조직화학염색을 통해 그의 발현과 분포를 관찰하여 이온수송에 관여하는 다양한 효소들과의 상관관계를 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
양성 이개반사인 300∼350 gram의 유색 기니픽 10마리를 대상으로 30% chloral hydrate(2 mg/kg)를 복강내 주사로 마취한 뒤, 흉강을 열고 0.1 M 인산화완충용액(PBS, pH 7.5)와 4% paraformaldehyde를 각각 100 ml씩 좌심실을 통해 관류 고정하였다. 단두 후 otic capsule을 열고 입체 현미경하에서 등골을 적출하고 와우 첨단의 외부 골편을 제거한 뒤 난원창과 정원창으로 1 ml의 4% paraformaldehyde로 재관류 후, 24시간 동안 후고정하였다. 10% EDTA로 1주일간 탈회하였으며 용액은 매일 교환하였다. 통상적인 파라핀 포매 후, 6 μm 두께로 잘라 aminopro-pylcoated APS slide에 부착시키었다. 조직의 처리는 100% xylene으로 5분씩 3회 탈파라핀화 및 100%, 95%, 85%, 75% ethanol에 5분씩 함수한 뒤 0.3% H2O2가 섞인 methanol에 10분간 넣고, 흐르는 물에 10분 동안 세정하였다. 1.5% rabbit serum으로 상온에서 1시간 blocking한 후 다시 PBS에 세척하였다. 1차 항체로는 다클론성 IgG rabbit anti-chicken 섬유아세포 성장인자 수용체 항체(rabbit polyclonal IgG, Anti-chicken FGF Receptor, residues 119-114 of the deduced cDNA sequence of the extracellular domain of the chicken FGF receptor, Upstate Biotechnology. Inc., U.S.A.) 및 rabbit anti-human 형질변환인자 수용체 항체(rabbit polyclonal IgG, Anti-human TGF-β Receptor, type Ⅱ, first 28 N-Terminal residues of the mature human TGF-β receptor, Upstate Biotechnology. Inc., U.S.A.)를 1% BSA로 1：75 및 1：7.5로 희석하여 4℃에서 12시간 처리하였고, biotin이 결합된 2차 항체는 1：200으로 희석한 anti-rabbit IgG를 30분간 상온에서 반응시켰다. 발색반응은 Vectastain Elite ABC kit(Vector Laboratories, U.S.A.)로 30분씩 상온 반응 후, DAB(Dako Corp., U.S.A.)로 1분 발색하였다. 각각의 반응마다 PBS로 5분간 3회 총 15분간 세척하였다. 핵 염색은 Hematoxylin으로 2분 염색한 후, ethanol로 탈수 및 xylene으로 투명화 과정을 거친 다음 crystal mount(biomeda, U.S.A.)로 12시간 상온 고정 후, 현미경으로 관찰하였다. 대조 염색은 1차 항체를 생략하고 상기의 과정을 반복하였다.
결과
정상 유색 기니픽을 이용하여 기저 회전부위의 와우 외측벽을 면역조직화학적 염색을 통해 섬유아세포 성장인자 수용체 및 형질변환인자 수용체(type β)의 항체를 관찰하였다. 섬유아세포 성장인자 수용체 항체(Figs. 2 and 3)에 대해서는 혈관선조의 변연세포와 중간세포, 나선인대의 Ⅱ형, Ⅲ형, Ⅳ형 및 Ⅴ형 섬유세포들에서 항체에 대한 강양성 면역반응을 보였고, 형질변환인자 수용체 항체(Figs. 4 and 5)에 대해서는 혈관선조의 변연세포와 중간세포, 나선인대의 Ⅱ형, Ⅲ형 및 Ⅴ형 섬유세포들에서 항체에 대한 강양성 면역반응을 보였으나 Ⅳ형 섬유세포는 약양성반응을 보였다. 혈관선조의 기저세포와 나선인대의 Ⅰ형 섬유세포는 음성면역반응을 보였다.
고찰
와우 외측벽에서의 이온수송에 대한 연구는 Tasaki 등의2) 내림프 직류전위의 발견과 Quick 등이8) 와우가 이온수송과 증식이 풍부한 신장과의 해부학적, 생리학적 및 약리학적 유사성을 보고한 이래, 혈관선조, 나선인대 및 주변조직이 내림프의 양이온을 유지하여 내림프 양성 직류전압 형성에 관여함을 알게 되었으며, 특히 와우 외측벽에서의 이온수송, 즉 Na＋/K＋-ATPase, Na＋/H＋ exchanger, creatine kinase, adenylyl cyclase 및 carbonic anhydrase에 대한 많은 연구보고가 있지만 아직도 확실히 알려진 바는 없다.3-6)
상피세포에서의 이온수송은 up-regulation 과 down-regulation에 의해 항상성을 유지하며, 그의 경로가 매우 복잡하여 어느 하나의 효소에 대한 연구만으로는 불충분하다. 또한 실험동물의 종류와 조직의 분포에 따라 다양한 결과를 나타낸다. 이온수송에 관여하는 구조로는 혈관선조, 나선인대의 9종류의 섬유세포군, 외구세포, suprastrial cell, spiral limbus cell 및 Reissner씨 막 등이 있는데, 각각의 세포들이 이온수송 효소에 서로 다른 양성반응을 보인다.9) 특히 혈관선조의 변연세포와 중간세포는 거의 모든 이온 수송 효소들에서 양성반응을, 기저세포는 carbonic anhydrase에서만이 양성반응을, Ⅰ형과 Ⅲ형 섬유세포는 Na＋/K＋-ATPase의 아형에 음성반응을 보였으나 Ca2＋ ATPase, carbonic anhydrase 및 creatine kinase에 양성 면역반응을 보였다. 이는 와우 외측벽의 세포들이 각기 다른 이온수송 역할을 함과 동시에 외부 자극에 부분적인 손상을 받더라도 내림프 생성에는 서로 유기적인 관계를 이루면서 항상성을 유지한다고 생각된다.
본 연구에 사용된 성장인자 수용체(RTKs, receptor tyrosine kinases, tyrosine kinase receptors, growth factor receptors)는 신호전달계를 기본으로 하여 외부 자극으로부터 세포내 활성을 유도시키는 세포막 수용체로 아직까지 와우 외측벽에 대한 면역조직학적 연구 및 보고된 바 없으며, 그 특성에 대해서 그다지 중요하게 여기지 않았으나 최근 저자의 연구에 따르면,10)11) 와우 감각상피세포계에서 양성 반응을 보였고, 외측벽에서 PLC-IP3(phospholi-paseinositol triphosphate) second messenger system과의 연계성도 있을 것으로 생각되었다.
다양한 조직으로부터 생산되는 사이토카인 중의 하나인 GF는 세포의 운동, 증식, 분화, 복제 및 이동에 촉진과 억제의 양면성을 가지며 서로 상호작용과 항상성 유지를 하고 있다. GF가 결합하는 세포막 고유의 RTKs는 세포질에 SH2(src homology 2 domain)가 존재하는 intrinsic tyrosine kinase계인 상피 성장인자 수용체(EGF-R, epidermal growth factor receptor), 인슈린양 성장인자 수용체(IGF-R, insulin-like growth factor receptor), 혈소판유래 성장인자 수용체(PDGF-R, platelet derived growth factor receptor)및 FGF-R 등이, Serine/threonine kinase계인 형질변환인자 수용체로 나뉘어 진다. 이들 GF가 세포막 고유의 수용체와 결합하여 이량체를 형성하면 세포내 do-main의 tyrosine kinase가 활성화되어 tyrosine 잔기가 인산화한다. 자가인산화된 수용체의 SH2 단백질에서 PLC-γ1 등의 복잡한 경로를 거쳐 세포내 신호전달계를 활성화하며, PLC-β1과도 부분적인 공유를 한다.6)12)
GF와 결합된 수용체는 자가인산화가 되면서 세포내 작용시간을 기준으로 수초에서 수분(혹은 수십분)이내의 early response'와 수시간 이상의 late response'로 구분된다.13) early response는 세포외 자극으로 인하여 세포막과 세포질 내에서 작용하는 이온수송 등으로 Na＋/H＋ anti-port, PLC-IP 3 second messenger system에 의한 세포질의 Ca2＋ 이온 증가, pH의 증가, PKC(protein kinase)의 활성화 및 당수송 등이 있으며, late response는 early response를 거쳐 보통 24시간 정도 후에 핵에 도달하여 세포의 유사분열을 진행하게 된다. 특히 와우 외측벽에서 이온 수송에 중요한 역할을 담당하는 Na＋/K＋-ATPase는 PLC, Calmodulin 및 GAP(GTP-activating protein) 경로의 adenylyl cyclase를 통해서, 그리고 확실치 않으나 Cl- channel과 Na＋/Cl-/K ＋-cotransporter는 adenylyl cyclase에 의해서, 내림프 수종에 관여하는 Ca2＋ 이온은 세포내 Ca2＋ 농도와 Ca2＋-ATPase의 활성화로 세포와 세포간, 세포 내에서, 그리고 각각의 이온간에 서로의 항상성을 유지 조절하고 있는 것이다.14)15)
본 연구와 저자의 연구16)에서 EGF-R, IGF-R, PDGF-R, FGF-R 및 TGF-R에 대한 양성 면역반응이 기저세포와 Ⅰ형 섬유세포를 제외한 모든 외측벽의 세포에서 보인 것은 혈관선조의 경우, 변연세포와 중간세포에서 Na＋/K＋-ATPase에 의한 Na＋ 이온흡수와 K＋ 이온방출을 Na＋/H＋ exchanger 혹은 PLC-γ1과 β1을 통한 H＋ 과 Ca2＋ 이온수송과 동시에 Cl- channel의 활성화가 일어난다고 생각하며, 기저세포는 혈관선조의 중간세포와 나선인대의 섬유세포사이에서 gap junction으로 연결해주는 passive transport의 역할만 존재하므로 이온 수송에 중요하지 않다는 것이 조직학적 특성과 일치한다고 볼 수 있고, 또한 나선인대의 Ⅰ형 섬유세포에서는 GF-RTKs의 신호전달계를 거치지 않는 Ca2＋ channel이 존재하며, 주위 섬유세포들의 이온 수송을 도와주는 역할을 하는 것으로 여겨진다. Ⅲ형 섬유세포의 경우에는 신장의 혈관간세포에서와 마찬가지로 전형적인 voltage-activated Ca2＋ channel과 관계없이 vol-tage-independent, receptor-operated Ca2＋ pathway가 존재하여 성장인자에 의해 Ca2＋ 이온의 방출이 이루어짐을 암시한다고 하겠다.17)18) 저자의 기니픽 와우에서 PLC 아형에 대한 연구에서도11) 혈관선조의 기저세포와 나선인대의 Ⅰ형 섬유세포에서 β1과 γ1이 음성 면역반응을 보인 것도 일반 세포에서와 마찬가지로 RTKs가 PLC-IP 3 second messenger system과 신호전달계를 서로 공유하고 있다고 생각한다.
결론
정상 유색 기니픽의 와우 외측벽을 면역조직화학 염색으로 세포막에 존재하는 성장인자 수용체 항체(섬유아세포 성장인자 수용체 항체, 형질변환인자 수용체 항체)의 발현을 관찰하였다. 혈관선조의 기저세포와 나선인대의 Ⅰ형 섬유세포를 제외하고, 혈관선조의 변연세포와 중간세포, 나선인대의 Ⅱ형, Ⅲ형, Ⅳ형 및 Ⅴ형 섬유세포들에서 섬유아세포 성장인자 수용체 항체 및 형질변환인자 수용체 항체에 대한 양성 면역반응을 보였다.
이러한 결과에서, 와우 외측벽의 각 세포들은 이온수송의 역할이 서로 다르지만 내림프의 항상성을 유지하며, 또한 같은 세포들에서 각 항체에 대한 양성 반응을 보인 것은 각 수용체의 종류에 관계없이 GF-RTKs의 신호전달계가 동일하고, 특히 RTKs와 PLC-IP 3 second messenger system과의 연계성이 외측벽에도 존재함을 암시하며, 향후 와우 외측벽에 대해 다양한 GF와 그의 RTKs에 대한 세포생리학적 연구를 통하여 이온수송에 대한 신호전달계의 증명이 필요할 것으로 생각한다.
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