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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(3); 1999 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(3): 279-283.
Immunohistochemical Localization of Alpha 1-antitrypsin in the Rat Eustachian Tube and Tympanic Membrane.
Yong Joo Yoon, Woo Cheol Jeong, Yong Ki Kim
Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chonbuk National University, Chonju, Korea.
흰쥐 이관과 고막에서 Alpha 1-antitrypsin의 면역조직화학적 국소화에 대한 연구
윤용주 · 정우철 · 김영기
전북대학교 의과대학 이비인후과교실
주제어: 탄력섬유분해효소Alpha 1-antitrypsin이관고막.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The major antielastase involved in preventing breakdown of elastic fiber in the airway is alpha 1-antitrypsin. In this regard, the eustachian tube may have the protease (elastase)-antiprotease (alpha 1-antitrypsin) system.
MATERIALS AND METHODS:
Sprague-Dawley rats were perfused with 4% paraformaldehyde. After fixation, the eustachian tube containing a part of middle ear was transfered to a 0.1 M EDTA solution, followed by embedding in paraffin wax. The avidin-biotin-peroxidase procedure was used to identify alpha 1-antitrypsin.
RESULTS:
The immunoreactivity for alpha 1-antrypsin in the eustachian tube appeared strongly in the cilia of pseudostratified columnar epithelium and serous cells of the submucous glands. In the tympanic membrane, it was distributed selectively in the inner mucosal epithelium. The strong immunostaining was also noticed in the glands of external auditory canal.
CONCLUSION:
We found that elastic fibers and alpha 1-antitrypsin in the eustachian tube and tympanic membrane may be interrelated to the maintenance of the normal function of the middle ear.
Keywords: ElastaseAlpha 1-antitrypsinEustachian tubeTympanic membrane
서론 이관의 주역활이 중이강에 대한 환기, 배액기능을 하는 것으로 알려져 왔으나 최근 비인강으로부터 침범되는 감염원에 대한 방어기능이 중이염 유발의 측면에서 더욱 중요할 것으로 시사되고 있다. 이관은 연하등의 생리적 작용으로 열린뒤 이관주위 연골 등의 탄력반동에 의해 곧 원래의 위치로 돌아가 닫혀 비인강의 감염원으로부터 중이강을 보호하게 된다. 따라서 이관이 열린후 발생되는 이관연골의 탄력도와 compliance에 이상이 생길 경우 이러한 방어기전에 손상을 가져와 중이에 병변을 일으킬수 있는 중요한 원인으로서 작용 될수 있다. 삼출성 중이염이 발생되는 원인은 아직도 확실치 않으나 비인강과 이관을 포함한 중이의 해부조직학적 특수성과 더불어 감염시 유리되는 각종화학매개물질들, 단백분해효소들, 그리고 여러종류의 cytokine들이 복잡하게 작용하여 병변의 만성화에 관여되어 발생하는것으로 생각되며 이때 이관이 중이염 발생의 가장 중요한 원인제공을 하고 있을 것으로 고려되고 있다. 결합조직에 포함되어 있는 단백질중의 하나인 탄력소는 이미 혈관과 폐조직을 포함한 기도계의 탄력성 유지에 매우 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 왔다. 탄력소에 관련된 기도의 대표적인 질환중의 하나인 폐기종의 병인에 대한 연구에서 규명되었듯이 감염시 다형핵 백혈구에서 분비되는 대표적 단백 분해효소인 elastase와 정상기도 조직에 존재하는 항단백분해효소인 alpha 1-antitrypsin의 균형이 깨어질때 다량의 초과 elastase로 인하여 탄력소가 파괴되어 호기시 절대 중요한 탄력 반동력의 상실을 일으켜 폐기종을 초래 할 수 있다는 것이다.1) 저자들은 이미 이관의 연골부와 점막상피하 결합조직에 많은 탄력섬유가 분포되어 있다는 것을 발표한 바 있으며 탄력섬유의 파괴가 이관 개폐기능의 손상을 초래하여 중이염 유발과 밀접하게 관계 될 수 있을 것으로 시사한바있다.2) 한편 대표적인 항단백분해효소들이 기도 즉 폐, 기관지, 기관, 하비갑개, 상악동 등의 점막하 장액선에서 증명되어 왔으나3-5) 이관과 고막에서는 증명되지 않았다. 이에 저자들은 elastase로 부터 탄력섬유의 손상을 막아주는 alpha 1-antitrypsin의 존재를 흰쥐의 이관과 고막에서 면역조직화학적으로 증명하기 위하여 본실험을 하게 되었다. 재료 및 방법 실험동물 및 조직처리 실험동물로 체중 250~300그램의 Sprague-Dawley계 흰쥐 20마리를 암수 구별없이 사용하였다. 마취는 sodium pentobarbital(Mebumal(r))을 체중 kg당 30 mg을 복강내 주사하고 수술 현미경하에서 외이도 및 고막을 관찰하여 중이의 이상여부를 확인한 뒤 건강한 쥐를 선택하여 흉곽을 절개하고 심장을 노출시킨뒤 좌심실을 통하여 상행 대동맥으로 100 ml의 0.1 M phosphate buffered saline(PBS)을 주입한뒤 4% paraformaldehyde 고정액 500 ml를 잇달아 관류시켰다. 두부를 절단 후 이관의 고골구와 인두구를 노출시켜 이들 양측구를 통하여 동 고정액을 몇차례 관류시킨 다음 고막과 중이 일부를 포함한 이관을 채취하여 수시간 동고정액에 넣어 침전고정을 하였다. 조직표본 제작 고막과 중이일부를 포함한 이관부를 수술현미경하에서 미세조작하여 0.1 M PBS에 수회 세척한뒤 0.1 M EDTA(ethylene diamine tetracetic acid, pH 7.6)로 매일 갈아 주면서 약 3주동안 탈회과정을 거친뒤 다시 0.1 M PBS에 몇차례 세척하여 alcohol과 xylene의 처리를 거쳐 paraffin에 포매하여 5 μm두께로 절편을 얻어 면역조직화학법에 사용하였다. 면역조직화학법(Avidin-Biotin Complex Method) Poly L-lysine으로 도포된 슬라이드위에 부착된 절편을 xylene으로 탈파라핀한 후 내인성 과산화 효소의 반응을 피하기 위해 1% H2O2에 반응시켰으며, 또한 비특이적인 단백반응을 막기 위해서 정상 염소혈청과 반응시켰다. Alpha l-antitrypsin의 면역국소화는 avidin-biotin immunoperoxidase(ABC)법을 사용하였는데 간기하면 다음과 같다. Alpha l-antitrypsin에 대한 특이 면역조직 화학반응을 시행하기 위하여 먼저 제 1 차 항체인 rabbit anti-rat synthetic alpha l-antitrypsin antiserum(Peninsula Laboratories Europe Ltd, Merseyside, England)을 PBS에 1:100으로 희석하여 각 절편당 100 ul씩 떨어뜨려 주위로 번지지 않는 것을 확인한뒤 4℃에서 48시간 동안 반응 시켰다. 그리고 PBS에 30분씩 3차례 세척한 후 제 2 차 항체로서 biotinylated goat anti-rabbit immunoglobulin(Dakopatts AB, Hagersten, Sweden)을 1:500으로 PBS에 희석시켜 4℃에서 24시간 적용시켰다. 다시 PBS로 30분간 3번 세척한 후 avidin biotin comlplex(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 1:200으로 희석하여 30분 동안 반응시켰다. 조직절편은 기질액에 0.03% diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma Co, St Louis, MO, USA)을 용해시켜 흡지에 여과시킨 후 H2O2를 0.01%가 되도록한 용액에 5분간 반응시킨 후 gelatin으로 처리된 슬라이드에 얹어 실온에서 건조시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다. 대조군을 일부 절편에서 일차 항체대신 정상염소혈청을 반응시켰고 다음과정은 상기방법과 동일하게 진행하였다. 결과 고막의 alpha l-antitrypsin 존재 및 분포의 특징은 먼저 중이강에 면한 고막의 내점막상피에 양성소견이 나타났으며(Fig. 1) 중간의 결합조직층에서는 거의 반응소견을 발견할 수 없었다. 그리고 외측 편평상피의 면역반응은 확인되지 않았다. 외이도 상피하 결합조직의 선조직에선 강한 alpha l-antitrypsin 양성반응이 나타났으며(Fig. 2), 골부와 연골에서는 반응이 관찰되지 않았다. 이관에선 내강에 면한 상피의 섬모에 가장 강한 염색소견을 볼 수 있었고, 위중층원주상피세포에서는 양성반응이 관찰되었으나 배세포에서는 alpha l-antitrypsin 에 대한 반응이 나타나지 않았다(Fig. 3). 상피하 결합조직에서는 전반적으로 미약한 반응이었다. 이관의 결합조직층의 선조직은 장액선과 점액선으로 나뉘어지는데(Fig. 4) 이중 장액선에서 alpha l-antitrypsin 에 대하여 양성반응이 나타났다(Fig. 5). 한편 이관연골과 구개범장근에서는 alpha l-antitrypsin 양성반응이 관찰되지 않았다. 고찰 삼출성 중이염 등을 포함한 만성 중이질환이 발생하는 원인을 규명하기 위하여 이과의들은 많은 노력을 기울여왔으나 비인강과 이관을 포함한 중이의 너무도 복잡한 해부학적 배경인자와 감염시 분비되는 각종화학매개물질, 단백분해효소, 그리고 여러종류의 cytokine들이 일으키는 생화학적 작용과 더불어 자체의 개체 면역력등이 복합되어 발생되기 때문에 아직도 병인을 명확히 설명 입증하는데는 어려움이 많다. 특히 이관은 길고, 좁아 해부학적인 견지에서도 그 말단부의 중이강에 많은 문제를 일으킬 가능성이 잠재되어 있으며 이관의 고실구와 인두구사이의 경사가 완만하여 비인강으로부터 각종 감염원의 침범에 대한 좋은 조건이 될 수 있다. 이러한 이관 자체의 해부학적 특수성 때문에 이관은 중이염의 병인 연구가들에게 매우 큰 관심을 불러 일으켜 왔다. 이관은 상벽과 내벽 깊이 그리고 외벽 일부를 연골이 덮고 있으며 기관, 기관지와 달리 훨씬 많은 선조직이 주위를 둘러싸고 있는데 특히 내측에 많은 점액선과 장액선들이 차지하고 있다. 이관주위 선조직중 점액선분비액은 주로 이관내의 점액 섬모정화계의 기계적인 방어기능 유지에, 그리고 장액선은 염증반응시 분비되는 각종 단백분해효소에 대한 화학적 방어기능에 필요한 항단백분해효소를 생성하고 분비하는 것으로 알려져 있다. 최근 중이염의 병인 연구에서 새롭게 주목을 받고 있는 이관의 중이강에 대한 방어 기전은 어느정도 상반된 의미를 부여한다. 즉 중이강의 환기를 위해 이관이 열린다음 신속히 닫혀야 하는데 이관의 연골경첩부의 탄력섬유의 손상이 있을 경우 탄력반동(elastic recoiling)을 상실하여 빠르게 닫히지 않는다면 이때 열린 이관을 통하여 중이강내로 비인강내의 감염원이 흡입될 수 있다. 따라서 정상적인 이관 개폐기능에 중요한 이관연골의 탄력성 장애에 대한 손상을 규명하는 것은 새로운 각도에서 중이염의 병인을 밝힐수 있는것 이다. 유소아들은 성인과 달리 중이의 발육이 미발달되어 중이염이 호발 되는 것으로 알려져 있다. Tomoda등6)은 나이별로 이관의 탄력섬유의 분포를 비교하였는데 탄력섬유가 어린 연령에서는 성인에 비해 매우 결핍되어 있다고 보고하고 있으며, John등7)은 폐의 탄력소치가 유소아에서 감퇴되어 있으며 7세 전후에 성인치에 도달된다고 보고하고 있다. 따라서 이러한 조건들이 유소아에서 기도관련 질환이 호발되게 하는 원인중의 하나로서 간주되고있다. 탄력섬유 분해효소는 골수의 골수전구체에서 생성되며 성숙된 다형핵백혈구에 저장되어 분비되는 단백효소중의 하나로서 단백분해효소들 가운데 가장 조직에 파괴적인 효소로서 최근 몇십년동안 임상 그리고 기초연구를 통하여 높은 관심을 갖게한 바 있다. 탄력섬유분해효소의 주공격원은 탄력소이며 또한 bradykinin과 C3, C5를 활성화하여 기저막과 세포에도 손상을 일으킨다.8) 다형핵백혈구에서 분비되는 단백분해효소는 폐기종을 포함하는 많은 다양한 질환들에서 조직붕괴를 일으킨다. 최근 다형핵백혈구의 elastase는 급성염증이 있을시 기도에서 분비를 증가시키는 중요한 역할을 하며 의미있게도 이러한 탄력섬유분해효소가 만성부비동염의 비분비액에서 증가되어 있다는 것이 증명되었다.9) 정리하면 탄력섬유분해 효소의 주작용은 결합조직에 포함하고 있는 단백질인 탄력소를 파괴하며 그외 상기도의 점막섬모에 손상을 주어 정화작용에 지연을 일으키고 또한 상피세포에도 병변을 일으키게 되는 것이다.10) 기도의 대표적인 질환의 하나인 폐기종을 일으키는 병인에 관한 최근의 유력한 설은 elastase-antielastase계의 균형이 손상됨으로써 결합조직내의 탄력소 붕괴가 주요한 원인으로서 간주되고 있다.1) 인간의 alpha l-antitrypsin은 혈장에 존재하는 주요한 단백효소로서 분자량 54 kDa의 당단백질이며 394 residue의 단일 폴리펩티드와 3개의 탄수화물연쇄를 포함하며, 인간의 간세포와 대식세포에 존재하고 때론 호중구에서도 발견되기도 한다.11)12) 한편 이러한 길항작용을 하는 elastase와 alpha l-antitrypsin은 서로 같은 세포에 공존하여 존재하기도 한다.12) 항단백분해효소들은 비점막의 장액세포에 다량 선택적으로 존재하며 비분비액 전체 단백질중 가장 중요한 부분을 차지하고 있으며 기관, 기관지, 비갑개점막, 상악동의 점막하 선조직의 장액세포에서 국소화 되어 왔다.3-5) 본실험에서도 이관의 선조직을 구성하는 점액선과 장액선중 장액선에 분포되어 있어 일치하였으며, 기도의 상피층에서는 저자마다 차이가 있었고 본 실험에서는 이관의 상피층에서 alpha l-antitrypsin에 대한 양성소견이 관찰되었다. Alpha 1-antitrypsin은 인간 호흡기에서 주요한 항단백분해효소이므로 부족시 에는 조기에 시작되는 점진적인 기도의 파괴를 일으킬 수 있다. 건강한 상태에서는 탄력섬유분해효소가 분비되어도 자연적으로 존재하는 alpha l-antitrypsin 보호하에 거의 손상을 받지 않으나 과다한 탄력섬유분해효소의 분비, 흡연, 탐식작용시 백혈구에서 생성되는 산화물들에 의해 alpha 1-antitrypsin이 비활성화 되어 elastase에 대한 억제작용을 상실하게된다.13-15) 결론적으로 이관에서 이러한 탄력섬유분해효소와 항탄력섬유분해효소 사이의 대등한 균형이 무너질 때 탄력섬유가 파괴되어 이관의 신속한 잠귐장치의 손상을 일으켜 이관의 중요한 3대기능중의 하나인 비인강으로부터 중이강의 보호방어 기능이 손상되어 중이염이 초래될 수 있다는 개념하에 앞으로 탄력섬유분해효소(elastase)와 항탄력섬유분해효소 (alpha l-antitrypsin)의 관계를 확립하는 연구가 더 이루져야할것으로 사려된다. 결론 고막의 alpha l-antitrypsin의 존재 및 분포의 특징은 중이강에 면한 고막의 내층 점막상피에 존재하였고 중간의 결합조직층과 외이도에 면한 편평상피층에서는 거의 반응소견을 발견할 수 없었으며 외이도가 고막으로 이행되는 부위의 상피하 결합조직의 선조직에선 강한 alpha l-anti-trypsin양성반응이 나타났고, 외이도 골부와 연골부에서는 반응소견이 관찰되지 않았다. 이관에선 내강에 면한 상피의 섬모에 alpha l-antitrypsin에 대한 가장 강한 염색소견을 보였고 상피층의 배세포에서는 반응이 나타나지 않았다, 상피하 결합조직에서는 미약한 반응뿐이었고 점액선에서 반응이 보이지 않았으나 장액선에선 양성반응을 나타내었다. 이상의 소견을 종합하면 이관과 고막은 기관지, 폐와 마찬가지로 기도의 연장선에 있는 기관으로서 이곳엔 매우 풍부한 탄력섬유가 분포되어 있는 것으로 알려져 있기때문에 elastase로부터 탄력섬유의 손상을 막아주는 alpha l-antitypsin 존재의 확인은 elastase로 부터 중이의 탄력섬유의 손상후 초래될 수 있는 중이염의 병인을 규명하는데 기여 할 것으로 기대된다.
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