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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(2); 1999 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(2): 145-151.
Localization of Phosphoinositide Specific Phospholipase Cbeta Isozymes in Rat Cochlea.
Chan Park, Seung Hoon Han, Han Kyu Suh, Hak Hyun Jung, Soon Jae Hwang, Keun Jung, Hyun Ho Lim
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. hyunho@kumc.or.kr
2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Chuncheon, Korea.
흰쥐 와우내 PLCβ 아형의 분포에 관한 Western Blot 및 면역조직화학적 연구
박 찬1 · 한승훈1 · 서한규1 · 정학현1 · 황순재1 · 정 근2 · 임현호1
고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;한림대학교 의과대학 이비인후과학교실2;
주제어: Phospholipase C beta와우.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Phosphoinositide specific phospholipase C (PLC) plays a pivotal role in the transmembrane signal transduction pathways by catalyzing the hydrolysis of phosphoinositide 4,5-bisphosphate (PIP2) to yield the intracellular second messengers, diacylglycerol (DG) and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), in response to the interaction of various ligands with the cell surface receptors. The question arises as to the physiological roles of the phosphoinositide second messenger system in the inner ear. The purpose of this study was to determine whether PLCbeta isozymes are present at the cochlea and what portion of cochlea each PLCbeta isozymes are distributed in. MAERIALS AND METHODS: Two methods, an immunohistochemical staining and western blot for PLCbeta isozymes were used in the rat cochlea. Frozen section and surface preparation were prepared for immunohistochemical staining. The PLCbeta isozymes or proteolytic digests were separated by SDS-polyacrylamide gels and then electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes. Rabbit polyclonal antibodies raised against four PLCbeta isozymes were used.
RESULTS:
Each PLCbeta isozymes showed differential expressions in the cochlea. PLCbeta1 immunoreactivity was observed in the inner and outer hair cells and the spiral ganglion cells; PLCbeta2 in the stria vascularis and PLCbeta3 mainly in the inner hair cells. PLCbeta4 was not observed in cochlea. In western blots of rat cochlea extracts, the PLCbeta isozymes stained several bands corresponding to the known molecular weight of PLCbeta monomers, which are probably proteolytic digests.
CONCLUSION:
These results suggest that differentially localized each PLCbeta isozymes in the cochlea may have specific roles in signal transduction pathway of auditory system.
Keywords: Phospholipase C betaCochlea
서론 외부자극에 의해 생성된 호르몬, 신경전달물질 등의 일차전달물질은 이차전달계를 포함한 세포내 신호전달기전을 유발하여 특정반응을 나타낸다. 이차전달물질로는 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)와 cyclic guanosine monophosphate(cGMP) 등이 알려져 있으며, 청각신경계에서 그 외에 L-glutamate, calmodulin 등이 알려져 있다.1) Phosphoinositide specific phospholipase C(PLC)는 세포외부로부터 전달되는 신호에 의해 활성화되어 phosphoinositol 4,5-bisphosphate(PIP2)로부터 세포내 이차전달물질인 inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3)와 diacylglycerol(DG)을 생성하는 효소이다. PLC에 의해 생성된 IP3는 세포내 형질내세망에 저장된 칼슘을 세포내로 방출시키며, DG는 protein kinase C(PKC)를 활성화시켜 세포내에서 다양한 작용을 한다. 2) 청각신경계에는 신경전달이나 내림프액 생성 등의 여러 생리기능에 nitric oxide, glutamate, acetylcholine, calmodulin 등의 여러 전달물질이 관여하는 것으로 알려져 있다.3) 이러한 여러 전달물질들은 외부자극에 대한 반응 외에도 상호간의 작용으로 생리현상들을 조절한다. 세포내 이차전달물질인 IP3와 DG를 생성하는 PLC는 여러 동종효소가 와우 내에 분포하는 것으로 알려져 있으나4) 정확한 분포양상이나 역할은 알려져 있지 않다. 저자들은 PLC의 동종효소 중 중추신경계에 주로 분포하는 것으로 알려진 PLCβ 의 4가지 아형(PLCβ1, β2, β3, β4)동종효소의 와우내 존재와 특이적 분포양상의 차이점을 관찰하고자 하였으며, 기존의 연구결과와 비교하여 와우조직에서 각각의 PLCβ 동종효소의 작용과 내이생리의 상관관계를 보고자 하였다. 흰쥐의 와우를 적출하여 동결절편과 표면조직표본을 얻어 면역조직화학법으로 PLCβ 아형의 분포를 관찰하였고, western blot법으로 PLCβ 아형들의 존재와 분자량을 확인하였다. 재료 및 방법 재료 성숙한 150∼200 gm 내외의 정상 Preyer reflex를 보이는 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 암수 구별없이 사용하였다. 면역조직화학염색법과 western blot법을 위한 일차항체로 rabbit polyclonal antibodies(Santa Cruz Biotechnology, California, USA:β1, C terminal epitope 1204∼ 1216, rat origin:β2, C terminal epitope 1170∼1181, human origin:β3, C terminal epitope 1198∼1217, rat origin:β4, C terminal epitope 1159∼1176, rat origin)를 사용하였다. 방법 Western blot 실험동물을 pentobarbital sodium(60 mg/kg)을 복강내에 주사하여 마취한 후 단두하여 측두골을 얻어 실체해부현미경하 4℃ PBS solution에서 해부하여 와우조직을 얻었다. 와우조직은 감각상피세포 및 외측벽인 나선인대(spiral ligament)와 혈관조(stria vascularis), 내측조직인 와우축부분(청신경 및 나선신경절)을 포함하였다. 충분한 조직을 얻기 위하여 2마리의 흰쥐로부터 4개의 측두골을 적출하였다. 양성 대조군으로 흰쥐의 전뇌를 사용하였으며, 음성 대조군으로 흰쥐의 간조직을 사용하였다. 얻어진 조직은 균질화 완충용액(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 100 g/ml PMSF) 하에서 균질화하여 4℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 그 상층액을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 사용하였다. 용해질내의 단백질 농도는 bovine serum albumin을 이용하여 염료결합법으로 측정하였다. 단백질 30 μg 상당의 용해질을 표본완충용액(0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerine, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 0.0002% bromophenol blue)에 섞고 5분간 끓인 후 8% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 12 mA의 일정 전류로 약 3시간 동안 전기영동을 시행하였다. 분자량을 알기 위하여 분자량 표준물질과 함께 전기영동하였다. 분리된 단백들은 50 mA의 일정전류로 3시간 동안 전기영동하여 nitrocellulose막(Milipore Corp., Bedford, MA)에 전이하였다.5) 단백질이 이동된 nitrocellulose 막은 비특이반응을 방지하기 위하여 blotto(5% dried milk and 0.2% Tween 20 in PBS)에서 10시간 동안 처리한 후 PBS-T(0.2% Tween 20 in PBS)로 10분간 수세하고, 1차 항체로 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 일차항체의 반응이 끝난 막은 TBS용액에 10분간 3회 수세하고 avidin-biotinylated horseradish peroxidase(HRP) complex(Vector Lab, 1:200 in TBS)용액에 45분 동안 처리하였다. 동일한 방법으로 10분씩 3차례 수세한 후 DAB(0.05% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0.06% H2O2/0.05 M TBS, pH 7.6)에 처리하여 3∼5분간 발색반응을 거쳐 증류수로 수세하고 건조시킨 후 관찰하였다. 면역조직화학염색 흰쥐에 pentobarbital sodium(60 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취한 후 개흉하여 심장을 노출하였다. 좌심실의 끝부분을 절개하고 굵은 주사바늘을 상행대동맥에 삽입하여 결찰하고 우심방을 절개한 후 heparin(2 I.U./cc)을 첨가한 0.9% 생리식염수로 관류하여 혈액을 씻어내었다. 연속적으로 약 300 ml의 4% paraformaldehyde 용액으로 약 1시간 동안 관류, 고정하였다. 고정된 쥐의 두개골을 해부하여 측두골로부터 와우를 얻은 후, 같은 고정액으로 정원창막을 통하여 와우를 국소고정하고 계속하여 하룻밤 동안 후고정하였다. 고정된 와우는 실체해부현미경하에서 미세해부하여 바깥쪽 골부를 제거하고 와우나선전장에 걸쳐 Corti 기관을 보존한 표면조직표본을 얻었다. 고정된 와우를 4℃ 8% EDTA용액에서 2주간 탈석회화한 후 액화질소로 급속냉동하고 OCT용매에 포매하여 16 μm 두께로 냉동절편을 만들고 poly-L-lysine이 피막된 슬라이드에 부착시켰다. 와우의 표면조직표본과 동결절편조직을 면역조직화학염색에 사용하였다. 먼저 조직을 상온에서 0.3% H2O2에 10분간 처리한 후 PBS에 10분씩 3회 수세하였다. 조직내의 비특이반응을 줄이기 위하여 3% normal horse serum(in triton X-100+1% BSA in PBS)에 40분간 incubation하고 PBS에 10분씩 3회 수세한 후 1차 항체(1:500)에 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. PBS에 10분씩 3회 수세한 후 2차 항체(biotinlabeled antimouse IgG, 1:400 in PBS)용액에 1시간 동안 처리하고 다시 PBS에 10분씩 3회 수세한 후 avidinbiotinylated horseradish peroxidase(HRP) complex (Vector Lab., 1:200 in TBS)용액에 45분 동안 처리하였다. PBS에 10분씩 3회 수세한 후 DAB(0.05% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0.06% H2O2/0.05 M PBS, pH 7.3)로 처리하여 3∼5분간 발색반응을 거친 뒤 증류수로 수세하였다. 음성대조군으로 일부 조직 슬라이드는 hematoxylin-eosin 염색을 하였다. 와우의 표면조직표본은 실체해부현미경하에서 한회전씩 조심스럽게 분리한 후 50% glycerol용액을 떨군 슬라이드 위에 붙이고, 동결절편조직은 건조시킨 후 탈수과정을 거쳐 봉입하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 결과 Western blot 표준분자량 측정 band와 비교하여 각각의 PLCβ 동종효소들의 알려진 분자량에 해당하는 130∼150 kD의 분자량 위치에서 발현된 band들을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 추가적으로 희미한 band들이 65 kD의 분자량 위치에서 발현되었다. 면역조직화학염색 각각의 PLCβ 동종효소들은 광학현미경하에서 와우의 각기 다른 부분에서 관찰되었다. PLCβ1은 내, 외유모세포와 제 1 형, 2형 나선신경절세포에서 발현되었다(Fig. 2). PLCβ3는 주로 내유모세포와 제 1 형 나선신경절세포에서 발현되었다(Fig. 3). PLCβ2는 Corti씨 기관의 세포에서는 발현이 되지 않으나 혈관조에서 약하게 발현되었으며, PLCβ4는 와우에서 발현되지 않았다(Fig. 4). 고찰 세포는 주위환경으로부터의 신호에 대하여 세포내 여러기전을 통하여 반응하며 환경에 대응하고 항상성을 유지한다. 이러한 세포반응은 외부자극에 대한 일차정보전달물질인 호르몬, 성장인자, 신경전달물질 등이 세포막에 있는 특이수용체에 결합하여 세포내로 전달되어 이차정보전달물질을 생성하여 유발된다. 이차정보전달물질로는 cAMP와 cGMP가 잘 알려져 있는데 최근에 inositol phospholipid로부터 생성되는 정보전달물질이 알려지고 있다.1) Phosphoinositide specific phospholipase C(PLC)는 세포외 일차신호에 의하여 활성화되어 phosphonositol 4,5-bisphosphate(PIP2)로부터 이차정보전달물질인 inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3)와 diacylglycerol(DG)을 생성하는 가수분해과정을 주도하는 효소이다.6) PLC에 의해 생성된 IP3는 세포내 형질세포망에 존재하는 특이수용체와 결합하여 저장된 칼슘을 세포질내로 방출시킨다. DG는 protein kinase C(PKC)를 활성화시켜 세포내에서 다양한 작용을 나타낸다.2) 이러한 PLC의 기능은 크게 두가지로 볼 수 있는데, 하나는 다른 신호전달물질에 대한 세포의 반응성을 변화시키는 것으로 신경계통에서 볼 수 있는 주된 기능이다. IP3는 휴식기의 칼슘양을 조절하여 시냅스전 소통에 중요한 역할을 한다. 또한 DG/PKC경로는 세포의 흥분성을 증가시켜 신경전달물질의 유리를 촉진시킨다고 생각된다.8) 또 다른 기능은 세포를 직접 활성화시키는 것으로, IP3는 칼슘이온을 유리시켜 근육수축, ion channel 개폐, 세포성장이나 신경계의 정보저장 등의 여러가지 생리현상을 유발한다.6)7) PLC의 작용으로 PIP2에서 IP3와 DG가 생성되는 과정은 명확하게 밝혀져 있지 않지만, cAMP생성기전과 유사하게 세포막내 guanine nucleotide binding protein(G protein)을 통하여 PLC가 활성화된다고 알려져 있다. PLCβ의 활성화에도 또한 여러 종류의 G protein이 관여하나 와우내 G protein의 분포나 phosphoinositide계와의 관계가 정확하게 밝혀져 있지 않다.9) 현재까지 여러 조직으로부터 다수의 PLC 동종효소들이 정제되어 PLC-β, γ, δ 등으로 분리되었다. 현재 밝혀진 PLC 동종효소는 10개가 넘으며 이는 조직의 기능에 따라 서로 다른 동종효소가 존재하고 있음을 의미한다고 볼 수 있다.10) 그 중 PLCβ 는 네가지 아형이 밝혀져 있는데11-14) 타 동종효소와 비교하여 주로 중추신경계에 분포한다고 알려져 있다.15) 청각계에서 와우의 이차정보전달계는 와우 내림프계와 외유모세포운동이나 시냅스와 같은 생리작용에 관여한다. Oba 등은 PLCβ1이 guinea pig의 외유모세포에 발현되었다고 보고하였으며, PLCγ1이나 PLCδ1은 내, 외유모세포에서 발현되지 않았다고 보고하였다. 또한 외유모세포에 발현된 PLCβ1이 IP3 이차정보전달계를 통하여 외유모세포의 완서운동에 관여할 수 있다고 보았다.4) 본 연구에서 저자들은 흰쥐 와우의 각 부분에 β1, β2, β3, β4의 PLCβ 아형들의 분포양상을 면역조직화학염색법과 western blot법을 이용하여 알아보고자 하였다. western blot법을 이용한 분석에서 흰쥐의 와우에는 각각의 PLCβ 아형들이 130∼150 kD의 분자량으로 발현되었다. 추가적인 band들이 65 kD주위에서 발현되었는데, 이는 PLCβ 아형들의 분해산물이거나 처리과정중에 발생한 부산물로 여겨진다. 면역조직화학염색법에서 각각의 PLCβ 아형들이 와우조직내 여러부위에 다양하게 분포한다는 결과로부터 phosphoinositide계와 여러 신경전달물질이나 호르몬과의 연관관계에 대한 정보를 얻을 수 있다. 내, 외유모세포와 제 1, 2형 나선신경절세포에 존재하는 PLCβ1은 와우내의 원심성, 구심성 신경전달체계에 관계되는 것으로 여겨진다. 유모세포와 나선신경절세포의 시냅스에는 nitric oxide 등의 여러 신경전달물질이 관여하는데, PLCβ1은 IP3 이차정보전달계를 통하여 이러한 정보전달과정에 관여한다고 여겨진다. 한편 외유모세포의 완서운동에는 calmodulin과 calmodulin dependent protein kinase에 의한 calcium의 활성화가 관여한다고 보고되고 있는데3)7) PLCβ1은 DG/PKC 등의 이차정보전달계을 통하여 외유모세포의 완서운동에 관여한다고 여겨진다. PLCβ1이 청각계의 원심성, 구심성 신경전달체계에서 어떠한 역할을 하는지에 대해서는 뇌간청각경로의 면역조직화학염색법을 통하여 상호 연관성이 규명되어야 하겠다. 혈관조는 와우측벽을 이루는 조직으로 변연상피세포층에서 내림프액을 생성한다. 내림프액의 삼투압농도는 cAMP에 의해 조절되는데 cAMP의 생성에는 adenylate cyclase 외에도 phosphoinositide, calcium/calmodulin, nitric oxide/cGMP 등의 여러 이차정보전달계가 관여하는 것으로 알려져 있다.17) 혈관조에서 PLCβ2는 와우 내림프액의 조절에 관여한다고 생각할 수 있다. 내유모세포와 제 1형 나선신경절세포에서 발현된 PLCβ3는 PLCβ1과 함께 구심성 신경전달계에 관여하는 것으로 여겨진다. 이상에서와 같이 와우내 PLCβ 동종효소들의 분포를 밝히는 것은 외부로부터의 정보전달과정의 첫단계인 수용체나 다른 이차정보전달계에 관여하는 물질의 분포와 비교하여 상호관계를 규명하여 청각전달계를 이해하는데 유용한 자료가 될 것이라 생각된다. 결론 저자들은 면역조직화학염색법과 western blot법을 이용하여 흰쥐의 와우에서 PLCβ 동종효소들의 다양한 분포양상을 알아보았다. 이러한 특징적인 분포양상은 각각의 PLCβ 동종효소들이 와우내에서 서로 다른 생리작용에 관여한다는 것을 보여주고 있다. 이러한 동종효소들의 정확한 기능을 알기위해서는 다른 이차정보전달계와의 상호작용과 함께 중추청각신경계에서의 연관성을 규명하여야 할 것이다.18)
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