| Establishment and Characterization of a Novel Cell Line (PNUH-12) Derived from a Human Squamous Cell Carcinoma of the Hypopharynx. |
| Hwan Jung Roh, Eui Kyung Goh, Soo Geun Wang, Kyong Myong Chon, Yoo Sun Kim, Jin Yeong Han |
1Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Pusan National University, Pusan, Korea. rohhj@hyowon.cc.pusan.ac.kr
2Medical Research Institute of Pusan National University Hospital, Pusan, Korea.
3Department of Clinical Pathology, College of Medicine, Dong-A University, Pusan, Korea. |
| 하인두 편평상피암에서 유래한 새로운 세포주 PNUH-12의 확립과 특성화 |
| 노환중1 · 고의경1 · 왕수건1 · 전경명1 · 김유선2 · 한진영3 |
| 부산대학교 의과대학 이비인후과학교실1;부산대학교병원 의학연구소2;동아대학교 의과대학 임상병리과학교실3; |
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| 주제어:
암세포주ㆍ두경부 악성종양ㆍ하인두암 |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cancer cell line is the basic material of various cancer research. Diverse cancer cell lines from various head and neck regions are needed for biologic research of head and neck cancer. However, cell lines derived from head and neck cancer are not common.
Recently, we have established and characterized a novel human squamous carcinoma cell line, PNUH-12, from the hypopharynx.
MATERIALS AND METHODS:
Among trials of twenty cases of head and neck cancer, we established only one specimen succeeded culture passage over 50. We characterized the cell line as follows: growth pattern and curve, morphology using phase contrast microscope and transmission electromicroscope, chromosomal anaysis, flow cytometric analysis, tumorigenecity by xenograft of cell line into nude mouse and morphological comparison, expression of cytokeratin, epithelial membrane antigen and vimentin, and P 53 mutation and its sequencing.
RESULTS:
PNUH-12 showed typical growth pattern of cancer cell line, representative morphological characteristics of squamous epithelial cell origin, multiple numerical and structural clonal abnormalities of chromosome, aneuploidy pattern of flow cytometry, and strong expression of cytokeratin. The formed tumor of nude mouse showed the identical histopathological phenotype (squamous cell carcinoma) of the original tumor of patient and similar morphology of PNUH-12. There was one point mutation of 78th base, C to G, in exon 7 of P53 gene.
CONCLUSION:
PNUH-12 can be a good control material and successufully bestowed to researchers for study of biology in head and neck cancer. There still needed more head and neck cancer cell lines from various regions and diverse cell types in future. |
| Keywords:
Cancer cell lineㆍHead and neck cancerㆍHypopharynx |
서론
암연구에 있어서 조직을 이용하는 경우는 여러 세포가 혼합되어 순수한 암세포단위의 연구를 할 수 없을 뿐만 아니라 적출되는 조직양이 부족하여 여러 가지 한계점을 가질 수 있다. 이에 반해 암세포주를 이용한 연구는 암세포를 원하는 양만큼 필요시 얻을 수 있고, 반복실험을 할 수 있으며, 암세포가 살아있는 상태에서 암세포의 다양한 생물학적 양상을 실험할 수 있고, 체내에서는 불가능한 실험조작을 가할 수 있다. 암세포주는 현재 암연구의 다양한 분야, 즉 암세포의 분화, 침습, 전이, 발암유전자의 발현과 암억제유전자의 소실 또는 변이, 항암제와 방사선 치료에 대한 감수성과 내성, 암표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 항암효과, 암세포 성장 및 억제 인자 등 악성종양의 다양한 연구분야에서 매우 유용하게 활용되고 있다. 따라서 악성종양에서의 세포주 확립은 모든 종양연구에서 가장 기본적 연구재료이다. 상부 기도 소화기 악성종양에서의 이러한 세포주 확립은 두경부 악성종양의 연구에 있어서 기초적 재료로 활용될 것으로 사료되나 두경부암에 대한 세포주의 확립은 기술적으로 어려워 1980년 이전에는 매우 드물었고 그 이후 특히 국내에서의 두경부 편평상피암종 세포주 확립에 대한 보고는 많지 않다.1-3)
저자들은 1994년 9월부터 1996년 12월까지 부산대학교병원 의학연구소와 부산대학교 암연구소에서 두경부암 세포주 수립을 위하여 시도한 20례 중 하인두암 1례에서 새로운 편평상피암 세포주(PNUH-12) 확립에 성공하고 그 특성을 규명하여 보고하고자 한다.
재료 및 방법
세포주 수집에 사용한 재료는 1994년 9월부터 1995년 12월까지 부산대학교병원 이비인후과에 입원한 20례의 두경부악성종양 환자에서 수술중에 채취한 악성 고형종양조직을 사용하였으며, 이 조직을 오염되지 않게 무균적으로 처리하여 gentamycin과 fungizone을 함유한 수송배지인 MEN 배지에 담아 세포배양실로 옮겼다. 고형종양조직을 무균적 환경하에서 수술칼이나 날카로운 metzenbaum으로 1∼3 mm정도의 크기로 잘게 부수어 5% 탄산가스와 95% 산소가 공급되고 적절한 습기와 37℃ 온도가 유지되는 배양기속에서 collagenase B와 DNAase로 밤새(overnight) 처치한 후, 조각들을 10% FCS(fetal calf serum), gentamycin(50 μg/mL), nystatin(50 μg/mL)을 함유한 MEM배지가 담긴 Petri dish로 옮겨 배양기속에서 배양하여 세포의 모양을 역위 위상차현미경을 통하여 관찰하였다. 3∼5일 후 상피세포와 섬유아세포가 자라기 시작하면 섬유아세포의 과도증식을 막기 위해 감별트립신 처리(0.05% trypsin-2 mM EDTA)와 scraping 방법으로 위상차현미경 아래서 선택적 분리 과정을 거쳐 섬유아세포를 제거하여 순수한 종양세포만 자라게 하였다. 상피계통의 종양세포가 각 dish에서 75∼95% 합류(confluency)에 도달하면 초기에는 분리비율이 1：2이상 되지 않게 분주하였다. 그 후 계속되는 계대배양동안에 가장 적절한 배양액조건을 맞추고, 일부는 액체질소에 동결 보존시키면서 적어도 30세대 이상의 계대 배양을 하였다.
총 20례의 두경부 상피세포암 조직을 대상으로 상기의 과정을 거쳐 계대배양을 시행하였으나 이중 18례는 세균, 진균, mycoplasma 등에 감염되거나 섬유아세포의 과성장에 의하여 계대배양에 실패하였다. 또한 1례는 감염없이 30세대이상의 계대배양에는 성공하였으나 특성화 수립과정중 누드마우스에 대한 종양세포의 이종이식실험에서 낮은 종양발생율과 누드마우스에 발생한종양이 원발종양과 다른 병리조직학적 소견을 보여 제외하였다. 하인두 편평상피암 환자로부터 채취한 1례에서 감염되지 않고 50세대 이상의 계대배양을 거친 PNUH-12 편평상피암 세포주를 얻었고, 세포주의 특성을 확립할 수 있었다. PNUH-12가 유래한 환자는 현재까지 본원에서 추적관찰중으로서 술전 방사선치료나 화학요법은 받지 않았고 수술당시 병기는 T 2N 1M 0이였으며 전이된 경부임파절이 아닌 원발부위인 하인두에서 종물을 채취하였다. PNUH-12를 새로운 세포주로서 수립하기 위하여 이 세포주의 특성에 관하여 다음의 실험을 하였다.
Growth characteristics
종양세포들의 성장속도를 측정하기 위하여 50세대 계대배양시의 5×10 4-10 5개의 종양세포를 25 cm2 플라스크에 분주하고 14일 동안 세포의 수를 12시간마다 측정하였으며 매 측정시 총3회를 실시하여 세포의 성장속도와 성장양상을 구하고, 세포의 수가 2배로 늘어나는 시간(doubling time)을 산출하였다.
Morphology
Monolayer로 배양중인 종양세포의 형태학적 특징을 관찰하기 위해서 배양세포를 계대배양 기간중 시간별로 위상차현미경으로 관찰하고, 배양중인 종양세포가 상피세포기원을 형태학적 특징을 갖는지에 대하여는 배양세포를 따로 분리하여 투과전자현미경으로 분석하였다.
Chromosome analysis
염색체 분석을 위한 종양 세포의 배양 및 중기 세포의 수확은 통상적인 in situ coverslips 배양법4)을 이용하였는데, 10 μg/mL colcemid를 26 gauge 주사기로 한 방울씩 떨어뜨리고 37℃에서 25분간 반응시켜 종양세포가 중기(metaphase)가 되게 동시화(synchronize)하였다. 배지를 모두 제거하고 미리 가온해 둔 0.8% sodium citrate를 2.0 mL씩 넣고 37℃ 20분간 반응시킨후 신선한 Caynoy 고정액(methanol：acetic acid＝3：1) 1 mL를 더해 실온에 20분간 더 두고 이 과정을 2회 반복하였다. trypsin 용액이 든 coplin jar에 coverslip을 한 장씩 넣어서 약 2분 30초∼3분간 trypsinization을 실시한 후, 70% ethanol로 탈수하고 Giemsa염색을 하였다. 말린 다음 현미경으로 중기 세포를 관찰하고 ISCN(International system for cytogenetic nomenclature, 1995)지침5)에 따라 핵형 분석을 하였다.
Flow cytometric analysis
종양세포의 DNA ploidy 분석은 CycleTEST TM PLUS DNA Reagent Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA) 염색 시약과 FACSort flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용해서 시행하였다. 먼저 배양한 종양 세포를 완충액으로 세척한 후 약 2.5×106/mL되게 세포수를 조정하여 trysin완충액 250 uL를 더해 실온 암소에서 10분간 반응시켰다. Trypsin inhibitor와 RNase완충액 200 uL를 첨가하고 다시 실온 암소에 10분간 둔후 propidium iodide 200 uL를 넣어 냉장 온도에서 10분간 반응시켰다. DNA cycle 분석은 CellFIT program을 이용하여 aneuploidy 유무를 관찰하고 S phase fraction을 구하였다.
Tumorigenecity
배양한 종양세포가 in vivo 상태하에서 종양을 유발할 수 있는지와 원발종양과 동물모델에 생긴 속발종양이 조직학적 그리고 생물학적 특성(biological behavior)이 유사한지를 알아보기 위해 10 7/0.1 mL개의 종양세포를 현탁액으로 만들어 무흉선 누드마우스(athymic nude mouse)의 등에 피하주사하여 누드마우스에 발생한 종양의 크기가 1×2 cm이 되면 누드마우스를 희생하여 종양을 적출하였다. 적출한 종양을 세부분으로 나누어 첫째, 포르말린에 고정하여 파라핀으로 포매후 광학현미경으로 관찰하여 nude mouse에서 자란 종양이 환자의 원발종양과 병리조직학적으로 같은 phenotype(편평상피암)인지 확인하였으며 둘째, 전자현미경으로 관찰하여 종양세포의 형태를 미세구조학적으로 관찰하고 상피세포기원의 특징을 갖는지 여부와 셋째, 누드마우스로부터 적출한 종양조직을 다시 계대배양하여 배양된 누드마우스의 종양세포와 원래 배양한 환자의 원발종양세포와의 차이점을 비교분석하였다.
Analysis of cytokeratin, epithelial membrane antigen (EMA), vimentin
배양중인 종양세포를 분리하여 cytospin slide를 만든 후 상피계통 종양세포의 특징을 갖는지 알아보기 위해 cytokeratin(Sigma, St. Louis, Mo), epithelial membrane antigen(EMA, Dakopatts Co., Glostruo, Denmark) 및 vimentin(Dakopatts Co., Glostruo, Denmark)의 항체를 사용하여 면역화학적방법을 적용하여 발현양상을 관찰하였다.
Analysis of P 53 gene
두경부 악성종양에서 종양억제유전자로서 가장 많은 빈도로 변이되고 변이된 단백질이 발현된다고 알려진 P 53 유전자에 대하여 PCR-SSCP 방법으로 exon 5, 6, 7에 대한 변이여부와 변이가 있는 경우 해당 exon에 대하여는 automatic DNA sequencing을 통하여 변이된 염기를 규명하였다. 먼저 DNA를 추출한후 EMBL data library(accession number X54156)로부터 P53의 DNA 염기순서정보를 통하여 첫 PCR 산물은 exon 5에서 exon 8이 포함되는 1647 bp fragment를 얻었다. 첫 PCR fragment를 templete로 하여 exon 5, 6, 7 각각에 대하여 두번째 PCR(nest PCR)을 시행하였다. exon 5에 대하여는 5' 염기 13,040-3' 염기 13,060, exon 6는 5' 염기 13,235-3' 염기 13,255, exon 7은 5' 염기 14,107-3' 염기 14,127의 oligonucleotide primer를 각각 사용하였다. 두번째 PCR 산물을 30mM Tris-HCl로 완충된 50% formamide에서 90℃에서 3분간 denaturation시킨 다음 6% polyacrylamide가 함유된 MDE(Mutation Detection Enhancement) gel에 전기영동하고 mobility shift는 silver staining으로 관찰하였다. mobility shift가 있는 exon에 대하여는 Perkin Elmer ABI Prism 310 Genetic Analyzer를 이용한 자동염기서열 분석을 통하여 변이된 염기를 규명하였다.
결과
PNUH-12 편평세포암 세포주의 수립을 위한 특성 실험을 통하여 다음의 결과를 얻었다.
Growth characteristics
50세대 계대배양시의 성장곡선은 0∼1일까지는 lag phase, 1-9일은 exponential phase, 9일 이후에는 plateau phase 양상을 보였고, doubling time은 48시간이었다(Fig. 1).
Morphology
세포주가 유래된 원래의 하인두 종양은 분화가 잘된 편평상피암(well-differentiated squamous cell carcinoma)였다(Fig. 2A). 계대배양중인 종양세포는 입방(cuboidal)또는 확산(spreading)형의 양상을 보이면서 핵속에는 여러개의 핵소체와 세포질은 과립상을 보였다(Fig. 2C). 배양된 종양세포를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 뚜렷한 핵소체, 염색질의 덩어리엉김, 불규칙한 핵의 윤곽 및 편평상피세포의 특징인 desmosomes과 tonofilament를 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
Chromosome analysis
총15개의 중기 세포를 관찰하였으며, 염색체의 수는 53개부터 61개까지 분포하였고, trisomy, tetrasomy, monosomy, deletion, translocation, isochromosome, derivative chromosome 및 그 기원을 알 수 없는 marker chromosome이 관찰되는 등 복잡한 수적 및 구조적 이상을 나타내었다. ISCN clonality 규정5)에 의한 핵형은 53∼61, XX, i(Xp), +del(1)(p11), +2, +2, +6, +6, -7, -9, -10, +11, add(12q)×2, +13, t(14q；22q)×2, add(14p)×2, +16, +16, +16, +16, i(17q)×2, +3∼11 mar[cp15]로 표기할 수 있었고 대표적인 핵형은 Fig. 4와 같다.
Flow cytometric analysis
하나의 aneuploid peak가 관찰되었다. 정상인 말초혈액의 임파구를 대조군으로 사용하여 분석한 DNA index는 1.42, G 2+M/G 1 비는 1.91, S-phase fraction은 15.2%였다(Fig. 5).
Tumorigenecity
세포주의 누드마우스에 대한 이종이식에서는 5마리 모두 6주 이내에 종양이 형성되었으며, 이중 2마리는 12주 후에 종양이 배부, 복부, 사지를 침범하여 사망하였다(Fig. 6). 이종이식된 종양을 절제하여 병리조직학적 검사 결과 모든 예에서 원발된 하인두 종양과 같은 phenotype인 편평상피세포암의 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 2B). 누드마우스에서 자란 종양을 다시 primary culture하여 계대배양을 한 후 배양중인 종양세포를 위상차현미경으로 관찰한 형태학적 특징은 원발세포주인 PNUH-12와 비슷하였으며(Fig. 2D), 전자현미경으로 관찰한 소견은 원발종양세포와 마찬가지로 상피세포기원의 특징을 갖고 있었다.
Analysis of cytokeratin, EMA, vimentin
상피세포의 기원을 나타내는 cytokeratin에 대해서는 모든 종양세포가 강양성을 보였으며, EMA는 종양세포의 30% 정도에서 양성을 나타내었다. 중배엽기원의 나타내는 vimentin에 대해서는 모든 종양세포가 음성을 보였다(Fig. 7).
P53 유전자 분석
종양세포로부터 DNA를 분리하여 exon 5, 6, 7에 대한 PCR-SSCP결과 exon 7에 변이(mobility shift)의 소견이 관찰되었다(Fig. 8). SSCP상 변이가 관찰되었던 exon 7에 대하여는 Perkin Elmer ABI Prism 310 Genetic Analyzer를 이용한 자동 염기서열 분석상 exon 7의 78번째 염기인 C가 G로 점돌연변이(one point mutation)을 일으킨 missense mutation이 발견되었다(Fig. 9).
고찰
악성종양의 관련 연구에 있어서 암세포주 세포주 확립은 가장 기본적 연구자료이며 상부 기도·소화기 악성종양에서의 이러한 세포주 확립은 악성종양의 다양한 연구에 있어서 기초적 자료로 활용된다. 두경부 암의 생물학적 특성은 매우 다양하여 같은 병기의 편평상피암이라도 국소 침습, 경부전이 및 원격전이에 있어서도 차이가 있다. 이러한 다양한 생물학적 특징으로 인하여 다양한 종류와 여러 부위에서의 두경부암 세포주 확립과 이를 이용한 in vitro 실험을 통하여 유전자 치료와 같은 새로운 치료접근법이 필요하다. 그러나 일반적으로 두경부 편평상피암 세포주는 배양이 어려워 세포주 확립이 다른 악성종양에 비해 많지 않다. 저자들은 두경부 편평상피암 세포주 확립을 위하여 20례의 환자에서 종양세포 배양을 시도하여 2례에서 세포배양에 성공하였다. 그중 1례는 세포주 특성화를 수립하는 과정에서 누드마우스에 대한 낮은 종양발생율(tumorigenecity, 1/5)와 종양세포의 이종이식에 의하여 누드마우스에 생긴 종양이 전형적인 상피세포기원의 특성을 갖지 않고 원발종양인 편평상피암과 다소 다른 형태학적 소견을 보여 제외하였고, 따라서 하나의 새로운 세포주인 PNUH-12만 수립하였다. 이처럼 두경부 편평상피세포암 세포주 수립에 힘든 요인은 첫째 인체에서 이미 감염되어있는 경우에는 세포배양시 감염의 가능성이 상당히 높으며, 둘째 암세포보다 섬유아세포가 과성장하는 경우가 많고, 셋째 암세포는 안자라고 정상분화된 각질세포만 자라는 경우와, 넷째 세포배양액의 조성이 수립하고자하는 세포주에 필요한 성장인자를 갖추지 못하여 계대배양이 진행되면서 성장을 멈추거나 암세포가 죽게되는 경우이다.1)6-8) 전체적으로 두경부영역의 편평상피암세포주 수립의 성공률은 저자에 따라 약간의 차이는 있지만 다른 종류의 악성종양보다는 낮아서 30% 전후이다.9-11)
고형종양으로부터 종양세포를 원발배양하기 위하여 두가지 방법이 사용되고 있다.11-13) 체외이식조직배양법(explant culture)은 조직 조각을 배양액이 담긴 배양기에 넣고 조직이 배양기 바닥에 접착(attachment)이 일어난 후 세포가 자라나게 하는 방법이다. 이 방법은 간편하고 손쉽게 조직배양을 할 수 있으며 피부생검과 같이 조직 양이 아주 적은 경우에 세포손실의 위험성 없이 배양을 할 수 있는 장점이 있는 반면에, 일부 조직은 배양기와 접착이 잘 되지 않고 접착이 되더라도 조직에서 세포가 성장할 때 세포마다 성장력의 차이가 있어서 원하지 않는 세포가 자랄 수 있는 단점이 있다. 본 연구에서 시도한 방법은 효소처리를 통한 배양법(enzymatic culture)으로서 원발 조직이나 조직 조각을 소화효소처리로 하여 조직에 포함된 여러 세포를 분해하고 원하는 세포를 배양기 위에 유착성 단일층(adherent monolayer)으로 자라게 하는 방법이다. 이 방법은 explant culture에 비하여 여러 세포의 집합체인 조직으로부터 원하는 세포를 단시간에 훨씬 높은 수율로 얻을 수 있는 장점이 있지만 연구목적에 필요한 이상적인 효소와 그 사용농도 및 반응시간을 위한 예비적 실험이 필요하다는 단점이 있다.
본 세포주가 상피세포에서 유래되고 상피세포의 특성을 가지고 있음은 두가지 실험을 통하여 증명하였다. 첫째, 상피세포의 세포질내에 불용성 polypetide로서 구성된 intermediate filament인 cytokeratin이 면역화학적 검사에서 배양중인 모든 종양세포에 강하게 발현되었다. cytokeratin의 아형(subtype)은 적어도 19종 이상이나 본 실험에서는 아형에 관계없는 universal cytokeratin 항체를 사용하였다. 또한 상피세포막항원(epithelial membrane antigen, EMA)에 대해서도 일부 종양세포에서 양성발현을 보였으며, 중배엽 기원을 의미하는 vimentin에 대하여는 모두 음성발현을 보였다. 둘째, 형태학적으로 세포주에 대한 투과전자현미경검사에서 편평상피세포의 특징이 desmosome과 tonofilament 등이 관찰되었다.
PNUH-12의 핵형분석에서는 대단히 다양한 염색체 변화를 보여주고 있으나 이것은 계대배양(in vitro)동안에도 염색체 변화가 다양하게 일어날 수 있으므로 in vivo의 상태를 정확히 반영하지 못한다는 단점이 있다. 그러나 세포주 확립시 가장 기본적이며 유전학적 변화에 대한 초기정보를 얻을 수 있는 핵형분석을 계대배양중 어느시점에서 해서 ISCN에 규정한 clonality 기준5)에 의하여 분석되어야 세포주 분양후 세포유전학적 연구분야에 도움을 줄 수 있다. 현재 밝혀진 두경부악성종양에서의 염색체변화는 3p, 5q, 6p, 9p, 11q, 13p, 15p, 17p의 소실과 1q, 3q, 8q, 15q의 획득(gain)의 빈도가 높다고 알려져 있으나14)15) 이러한 변화는 고형종양조직으로부터 원발배양(primary culture)를 통하여 알려진 것이며, 세포주에서와 같이 여러세대 이상의 계대배양을 거치면 이보다 훨씬 복잡한 숫적, 구조적 염색체 이상을 나타낸다.
확립된 세포주가 원발종양의 특성을 변함없이 대표할수 있는지의 여부에 대하여는 동물모델을 이용하여 in vivo에서 종양유발성(tumorigenecity)를 갖는지 알아보고, 또한 생긴종양이 원발종양과 병리조직학적으로 그리고 배양세포가 형태학적으로 유사성을 갖는지 검증하는 것이 대표적인 실험이다.2)16-18) 실험동물 모델로서는 thymus가 없어 T 임파구를 생산할 수 없으므로 면역기능이 거의 없는 누드마우스가 가장 많이 이용된다. 누드마우스는 인간 암세포를 이종이식하여도 거부 반응없이 종양이 자랄 수 있는 실험동물이므로 인간 암세포의 검색, 암세포주의 유지, 항암제 약물실험 등에 유용하다. 본 실험에서 PNUH-12 세포주를 누드마우스에 이종이식하여 형성시킨 종양을 다음과 같이 검증하였다. 첫째, 누드마우스에 형성시킨 종양은 다시 적출하여 30세대 이상의 계대배양이 가능하였으며 둘째, 배양중인 누드마우스 종양세포의 형태학적 특징이 원발종양에서 유래한 세포주인 PNUH-12와 매우 유사함을 관찰하였고 세째, 병리조직학적으로(phenotypically) 누드마우스에 생긴 종양이 원발종양과 같은 편평상피암의 소견을 나타내었다. 이러한 소견들은 PNUH-12가 원발종양과 유사한 생물학적 특성(biological behavior)을 가짐을 시사한다. 그러나 PNUH-12가 유래한 원발종양과 PNUH-12를 이종이식하여 생긴 누드마우스의 종양이 계대배양과 조직학적검증을 통하여 유사하다고 하더라도 종양세포가 생체내 반응을 일으킬 때 필요한 모든 요소를 누드마우스에서는 갖지 못하므로 임상적으로 환자예후를 결정하는 암세포의 침윤과 전이 능력에 대한 검증 등은 할 수 없다.
폐암, 위암, 유방암등 여러 인체암에서뿐만 아니라 두경부악성종양에서도 가장 흔하게 발견되는 유전적 이상은 P 53 종양억제유전자의 변이이다. P 53 유전자는 17번 염색체의 단완(17p 13)에 존재하고 genomic size는 20kb이며 11개의 exon으로 구성되어 있고 sv40 large T-antigen이나 adenovirus EIB와 같은 host protein과 복합체를 형성할 수 있으며 393개의 아미노산으로 구성된 53kDa의 P 53 단백질을 합성(encoding)한다. 정상형의 P 53 단백질은 세포의 성장과 분열을 억제하는 기능을 갖고, 세포내 DNA가 손상을 받으면 P 53 단백질이 생산되고 세포내 축적되어 손상된 DNA의 복구를 조장하는 것으로 알려져 있다. 그러나 악성종양에서는 염색체 소실에 의한 P 53 대립유전자의 하나 혹은 둘 모두의 소실, P 53 유전자의 missense mutation 또는 nonsense mutation, viral oncoprotein(human papailloma virus의 E6 단백질, Adenovirus E1b, sv40 large T antigen)과 P 53의 결합 등으로 P 53 단백의 기능이 상실되어 암세포의 증식이 일어나게 된다. 11개의 exon중 exon 4, 5, 6, 7, 8은 여러 암에서 돌연변이가 호발하는 부위로서 두경부악성종양의 경우는 이중 특히 codon 238-248부위가 hot spot를 이룬다. PNUH-12 세포주에서 PCR-SSCP검사에서 돌연변이가 exon 7에서 검출되었으며 염기배열분석상 exon 7의 78번째 염기인 C가 G로 점돌연변이된 missense mutation을 나타내었다. 따라서 P 53 변이와 연관된 연구에 PNUH-12가 양성대조군으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
결론
저자들은 본 연구를 통해 새로운 세포주 PNUH-12를 수립하고 그 특성을 분석하였다. 이 세포주는 두경부악성종양의 다양한 연구, 즉 암세포의 분화, 침습, 전이, 발암유전자와 억제유전자의 발현양상, 항암제와 방사선에 대한 감수성과 내성, 생체반응조절물질에 대한 항암효과, 단세포군 항체의 개발, 암표지항원의 개발 등에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 현재 여러 연구소와 연구자들이 각 분야에서 암세포주를 수립하기 위하여 노력하고 있으나 국내에서 수립된 암세포주는 부족한 실정이다. 향후 두경부악성종양의 다방면 연구에 활용될 수 있도록 두경부 모든 영역으로부터의 다양한 세포주 확립이 절실히 요망된다.
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