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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(12); 1998 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(12): 1521-1526.
Immunohistochemical Study for Differentiation of Human Middle Ear Cholesteatoma.
Kee Hyun Park, Hong Joon Park, Young Myoung Chun, Jin Suk Lee, Hui Jun Kim
Department of Otolaryngology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea. parkkh@madang.ajou.ac.kr
S중이 진주종상피의 분화인자에 대한 면역조직화학적 연구
박기현 · 박홍준 · 전영명 · 이진석 · 김휘준
아주대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: 중이진주종과증식과각화InvolucrinFilaggrin.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Human epidermis is a continuously dividing tissue, in which keratinocytes gradually differentiate and mature while moving from basal cells to suprabasal cell layers. Epidermal homeostasis is maintained by a delicate balance between proliferation and terminal differentiation. Cholesteatoma is characterized by the presence of a squamous epithelium invading the middle ear, which is believed to have hyperproliferative properties. The aim of this study is to determine whether the hyperproliferative character of cholesteatoma is associated with differentiation of basal cell or suprabasal cell layers.
MATERIALS AND METHODS:
Using immunohistochemical techniques, we investigated the reaction pattern of monoclonal antibody to involucrin and filaggrin as differentiation markers in the cholesteatoma matrices which were harvested during surgery. For the control, the same immunohistochemical study was also done in deep meatal skin and retroauricular skin during the same surgery.
RESULTS:
The immunostaining intensity of filaggrin at suprabasal cell layers was higher in cholesteatoma than in retroauricular skin and deep meatal skin. The immunostaining intensity of involucrin at suprabasal cell layers was higher in cholesteatoma and deep meatal skin than in retroauricular skin.
CONCLUSION:
This result represents that the epidermal cells in cholesteatoma at suprabasal layers actively differentiate more than the epidermal cells in retroauricular skin. So this study suggests that hyperkeratinization in cholesteatoma might be due to altered differentiation of suprabasal keratinocytes. Furthermore, this study reveals that the deep meatal skin has unusual hyperproliferative behavior in contrast to the retroauricular skin.
Keywords: CholesteatomaDifferentiationHyperproliferationInvolucrinFilaggrin
서론 중이 진주종은 중이강내 각화성 편평상피가 존재하는 것으로 정의되며, 골조직을 파괴함으로써 여러 합병증을 유발한다. 중이 진주종의 발생기전에는 아직도 많은 논란이 있으며 임상적으로 여러 유형의 진주종이 각각 다른 발생기전으로 설명되고 있다. 즉 고막천공이나 고막이완부 함몰(retraction pocket)등을 통해 외이도나 고막의 상피세포가 침입하여 형성될 수 있으며, 중이염에 의한 만성적인 자극으로 중이점막상피의 편평상피화로 화생(metaplasia)하여 형성될 수도 있으며 중이강내의 편평상피가 중이내 잔류하여 생기는 선천적 원인도 진주종의 가능한 병인으로 알려져있다.1)2) 조직학적으로 보면 중이 진주종은 상피세포의 비정상적인 과각질화(hyperkeratosis)와 과다증식성향(hyperproliferation)을 나타내는데 그 병리기전을 현재까지 보고된 연구로3-7) 추론 해 보면, 첫째, 증식능력을 가진 기저세포의 증가, 둘째 새로운 증식능력을 가진 기저상층세포의 형성, 셋째 상피세포의 케라틴 형성능력의 증가등이 알려져 있다. 정상 상피세포는 지속적으로 분화하는 조직으로 기저막과 접하고있는 기저세포만이 증식능력을 가지며 기저세포가 분화하고 성숙되면서 기저상층으로 이동하게되고 결국 각질층으로 도달한 상피세포는 아포프토시스(apoptosis)에 의해서 케라틴 형성과 함께 세포탈락이 일어나게된다. 즉 세포분화는 항상 세포증식과 상반된 보완관계를 유지하며 세포층을 일정하게 유지하게되는데 분화도가 증가되면 세포의 증식은 감소하게되며, 세포의 증식도가 증가하게 되면 분화는 미분화상태로 남게된다. 소위 상피세포의 항상성(epidermal homeostasis)이 이 둘간의 균형에의해서 유지되나 만약 그 균형이 깨어지면 세포의 과증식경향이나 분화의 가속화현상이 기저상층에서 나타날 수 있으며 상피세포에서는 과각화 현상이 일어날 수 있다. 따라서 본 연구에서는 상피세포의 분화 표식자로써 involucrin과 filaggrin을 통해 중이 진주종 상피세포에서 분화의 분포를 알아봄으로써 이미 여러 연구에서 알려진 진주종의 과증식과 과각화성향의 병리기전을 연구하는데 기초자료로 마련하고자 본 연구를 시행하였다. 재료 및 방법 재 료 아주대학병원 이비인후과로 내원하여 중이진주종으로 임상적진단을 받고, 유양동 삭개술(mastoidectomy)을 시행받은 환자중 상태가 양호한 8명의 중이진주종 상피조직과 8명의 심부외이도 상피조직 그리고 8명의 후이개 상피조직을 사용하였다. 방 법 표본제작 중이수술시 채취한 진주종 상피와 심부외이도 상피조직 그리고 후이개 상피조직을 10% 중성포르말린에 고정한 다음 상승 알코올 계열에서 탈수시킨 후, 파라핀에 포매시켜 보관하였다. 얻어진 상피조직을 면역조직화학적으로 관찰하기 위하여 보관된 조직을 4∼5 μm두께로 연속 절편하여 표본당 5∼8장의 조직절편을 제작하였다. 분화지표 상피세포 분화시에 과립층(granular layer cells)과 상부극세포층의 각질형성 세포에서만 특징적으로 염색되는 involucrin에 대한 단클론항체인 BT-600(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA, U.S.A.)과 과립층세포와 각질층세포(cornified layer cells)에서만 특징적으로 염색되는 단클론항체인 anti-human filaggrin(Bio-medical Technologies Inc., Stoughton, MA, U.S.A.)을 PBS에 involucrin은 1:5로 fillggrin은 1:200으로 희석시켜 사용하였다. 면역조직화학적 염색 Involucrin과 filaggrin에 대한 면역화학적 염색은 Microprobe immunostaining station(Biomeda, Pittsburgh, PA)을 이용하였다. 파라핀 조직절편을 xylene과 histoclear의 혼합용액인 탈랍제(dewaxing agent)로 탈파라핀 처치를 시행후, 무수 알코올로 xylene과 histoclear를 제거하기 위해 상온에서 2회 세척하였고, 조직절편의 탈수효과를 위해 상온에서 다시 2회 세척하였다. 내재성 peroxidase를 억제할 목적으로 methanol과 periodic acid가 포함된 Endo/blocker(Biomeda, Pittsburgh, PA)에 조직절편을 섭씨 40도에서 2분간 방치(incubation)한후 상온에서 tris-buffer로 세척하였다. 비특이성 반응을 줄여 조직항원이 잘 노출될 수 있도록 조직절편을 단백분해효소인 pepsin에 섭씨 40도에서 4분간 방치시킨 후 상온에서 tris-buffer로 세척하였다. 조직항원과 항체간의 반응에 있어서 비특이적 결합을 억제하기 위해 차단항체(blocking serum)인 정상혈청과 함께 섭씨 40도에서 2분간 방치시켰다. 조직절편에서 여분의 혈청을 흡입한후, 1차 항체와 함께 섭씨 40도에서 9분간 둔 다음 tris-buffer로 상온에서 2회 세척하였다. 2차항체로 섭씨 40도에서 4분간 방치 후, 상온에서 tris-buffer로 1회 세척하였다. Peroxidase의 역가를 높히기위해 peroxidase enhancer(Biomeda, Pittsburgh, PA)로 상온에서 1회 세척한 후, 원하는 강도의 색을 얻기위해 섭씨 40도에서 chromogen(AEC:3-amino-9-ethyl carbazole)과 함께 10분씩 2회에 걸쳐 방치시켰다. 조직절편을 상온에서 증류수로 세척한 후, Mayer's hematoxylin으로 30초간 길항 염색을 실시하였다. 염색이 끝난 조직절편을 증류수로 세척 후, tris-buffer로 세척한 다음, 다시 증류수로 세척하고 봉입하였다. 관찰방법 진주종 상피와 심부외이도 상피조직 그리고 후이개 상피조직의 분화에 있었서 상피세포층을 기저층(basal layers), 상부기저층(suprabasal layers) 그리고 각질층(cornified layers)으로 나누어 비교하였고 그 염색 반응정도에 따라 반응이 나타나지않은 경우를 negative(-), 약한 염색반응을 보이는 경우를 focal(±), 염색반응을 보이는 경우를 positive(+)로 정의하고 200배 시야하에서 광학현미경으로 비교 관찰하였다. 결과 Filaggrin에 대한 반응 Filaggrin에 대한 반응을 살펴보면 심부외이도 상피세포와 후이개 상피세포에서는 8례 중 6례에서 단지 각질층에서만 염색되어지는 반면 진주종상피세포에서는 8례 중 7례에서 기저상부층과 각질층에 염색되어지는 것이 관찰되었다(Table 1, Fig. 1A, B and C). Involucrin에 대한 반응 Involucrin에 대한 반응을 살펴보면 중이 진주종상피세포는 8례 중 7례에서 심부외이도 상피세포에서는 8례 중 6례에서 기저상부층에서 염색되어지는 반면 후이개상피 세포에서는 단지 1례만이 기저상부층에서 염색되어지는 것이 관찰되었다. 각질층의 염색은 진주종, 심부외이도, 후이개 상피세포 모두 8례 중 3례에서 염색이 되었다(Table 1, Fig. 2A, B and C). 고찰 중이진주종은 중이강내에 각질화된 편평상피가 과증식하여 케라틴이 축적되는 질환으로 만성적이고 지속적인 염증반응을 유발하여 주위 골조직 파괴함에 따라 난청을 동반하며, 때로는 내이누공이나 두개강내 합병증 등의 원인이 될 수 있는 질환이다. 조직학적으로 보면 중이강내에 각질화된 중층편평상피로 구성된 기질(matrix)과 상피하 결합조직 및 육아조직을 갖고 있으며 다량의 케라틴을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 광학 현미경학적 조직검사상 정상고막이나 외이도 상피와 비교해 볼 때 상피하 염증조직이외에는 조직학적차이는 관찰되지 않으면서도 어떻게 진주종의 특징적인 임상양상을 유발하는지에 대한 중이 진주종의 병리기전 연구는 진주종이 처음 명명된 이후부터 많은 생화학적, 면역조직화학적 연구가 이루어졌고 최근에는 in situ hybridization 등 진주종 상피세포의 분자생물학적 연구가 진행되고 있다. 지금까지의 진주종의 병인에 대한 면역 조직화학적 연구결과를 종합해 보면 먼저 진주종의 과증식 성향연구에 있었서 Wullstein등8)이 진주종에서 기저상피세포의 증식이론(basal cell proliferation theory)을 제시한 바 이래 많은 연구를 통하여 증식능력을 가진 기저세포수의 증가를 확인하였고 기저 세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아있음을 cytokeratin6)과 PCNA(proliferating cell nuclear antigen),9) cytokine10)등을 통한 면역조직화학적연구에서 확인하였다. 그리고 진주종상피에서 특징적으로 보여지는 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져있지만,7) Broekaert등11)은 기저세포의 케라틴 합성능력의 증가를 실험하여 기저세포가 정상적인 케라틴 합성능력을 보였다고 보고하였고, Stammberger등12)은 involucrin과 filaggrin 분화인자를 이용한 면역조직화학적 연구에서 기저상부세포에서의 조기분화(early differentiation)를 확인하였다. 정상상피는 지속적으로 분화하는 조직으로 기저막과 접하고있는 기저세포만이 증식능력을 가지며 기저상층으로 이동하면서 분화하게되고 각질층에 도달한 상피세포는 예정된 능동적 사망기전인 아포프토시스에 의해서 세포의 운명을 다하게 된다. 이러한 분화와 증식이 균형을 이루며 상피세포층을 유지하게되는데 만약 그 균형이 깨어지면 세포의 과증식경향이나 분화의 가속화현상이 기저상층에서 나타날 수 있고, 이는 진주종 상피세포에서의 과도한 케라틴합성의 원인이 된다. 본 연구에서 진주종 상피세포의 분화의 분포를 알기위해 사용되어진 분화인자인 involucrin은 Rice와 Green13)에 의해 처음으로 규명되어 졌으며 인체의 편평상피에서 합성되는 일종의 세포질 단백으로써 인체 중층편평상피의 성숙과정에 있는 세포는 원형질막의 세포질면에 약 12 nm두께인 단백 기낭(protein envelope)을 형성하는데, involucrin은 이 단백질의 수용성 단백 전구물질이다. Involucrin은 분자량이 140 kD의 비교적 고분자량으로써 인간의 정상표피에서는 과립층과 상부극세포층의 각질형성 세포에서 발견되고 기저층과 각질층에서는 대개 발견되지 않으므로 편평상피 세포의 중간단계분화(intermediate stage of squamous differentiation)에대한 좋은 지표로 사용되어지고 있으며,14) 최근에는 폐,15) 피부,16) 자궁경부병변17) 등 암진단에 있어서 발병부위의 악성화유무를 판단하는 데 유용한 지표로 알려져 있다. 정상 피부에 대한 involucrin의 반응에 관한 연구에서 Murphy16)등은 표피의 상부1/3에서 세포질이 균일하게 염색되었고 기저각질세포(basal keratinocyte)와 극세포층(stratum spinosum)의 직상부층은 염색이 안된다고 하였다. 중이 수술시 얻어진 진주종 상피세포를 이용하여 involucrin의 면역조직화학적 염색을 통하여 조사된 본 연구에서는 후이개 상피세포에서만 정상 상피세포와 같은 동일 소견을 나타내었지만, 중이 진주종 상피세포와 심부외이도 상피세포에서는 기저상부세포에서도 염색되어지는 소견이 관찰되어졌다. 이는 중이 진주종 상피세포 뿐만아니라 심부 외이도 상피세포도 비정상적인 분화성향을 보임으로써 진주종의 여러 발병기전 중 고막천공이나 고막이완부 함몰(retraction pocket)등을 통해 외이도나 고막의 상피세포가 침입하여 형성된다는 상피침입설(immigration theory)1)를 이해하는 자료가 될 수 있으며 향후 이에 대한 면역조직화학적 연구가 더 필요하리라 사료된다. 본 연구에 사용되어진 또 다른 면역 분화인자인 filaggrin은 과립층세포와 표피층세포의 분화시에만 세포질에 특징적으로 나타나는 keratohyaline을 구성하는 단백질로써 histidine이 풍부하고 분자량이 38 kD이다.18) 주로 과립층세포에서는 keratohyaline 과립형태로 세포질에 존재하다가 표피층세포로 분화하면서 keratohyaline 과립이 섬유세사간공간(interfilamentous space)내로 산포(dispersion)되어 섬유세사간응집(interfilamentous aggregation)을 통해 대원섬유(macrofibril)를 형성하게 된다. In vitro 실험에서 filaggrin은 케라틴섬유(keratin fiber)들을 이황화결합(disulfide bond)에 의해 케라틴섬유들간의 응집을 촉진시킨다는 것이 입증되었다.19) 최근의 연구에서는 피부 상피세포뿐만아니라 진주종 상피세포의 분화과정에 있었서 filaggrin이 cytokeratin filament의 응집에 관여함으로써 진주종도 상피세포의 특징들을 가진다는 것을 면역조직학적연구를 통해 확인되었다.6) 중이 수술시 얻어진 진주종 상피세포를 이용하여 filaggrin의 면역조직화학적 염색을 통하여 조사된 본 연구에서는 심부외이도 상피세포와 후이개 상피세포에서는 단지 각질층에서만 염색되어지는 반면 진주종상피세포에서는 기저상부층과 각질층에 염색되어지는 것으로 관찰되었다. 이는 진주종상피세포의 분화가 기저상부층에서 조기분화(early differentiation)가 일어남을 의미하며 진주종의 중요한 병리기전으로 알려진 과각질화의 원인으로 추정할 수 있었다. 결론 본 저자들은 이미 여러 연구에서 알려진 진주종의 과증식과 과각화성향을 연구하기 위하여 상피세포의 분화 표식자로써 involucrin과 filaggrin을 이용하여 중이 진주종상피세포는 심부외이도나 후이개 상피세포와는 달리 기저상부층에서 조기분화(early differentiation)가 일어남을 관찰할 수 있었으며, 심부외이도 상피세포는 후이개상피와는 다른 비정상적인 분화양상을 보임을 관찰할 수 있었다. 이상에서 현재까지 중이 진주종의 특징으로 알려져 있는 진주종 상피세포의 과각화 성향은 기저상부세포의 변경된 분화때문일 것으로 추정할 수 있었고, 중이 진주종 상피세포 뿐만아니라 심부 외이도 상피세포도 비정상적인 분화성향을 보임으로써 진주종의 여러 발병기전을 이해하는데 좋은 자료가 될 수 있으리라 생각되며, 향후 이에 대한 면역조직화학적 연구 및 분자생물학적 연구가 더 필요하리라 사료된다.
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